Конкурс «био/мол/текст»-2013

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2013 в номинации «Своя работа».

---

Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Проблема нефтяного загрязнения земель будет стоять перед человечеством, по крайней мере, до тех пор, пока двигатели внутреннего сгорания работают на нефтепродуктах. Самым экологически безопасным методом восстановления грунта после нефтяного загрязнения считается биологический (или биоремедиация) [1], [2]. Во всем мире идет работа по выделению микробных штаммов из нефтезагрязненных грунтов, поскольку они не только не теряют жизнеспособности при встрече с углеводородами, но и способны использовать последние в качестве источника пищи. По всему миру налажено производство коммерческих препаратов, предназначенных для борьбы с нефтяным загрязнением почвы. В России (СССР) их выпуск начался в 1988 г., и по сей день повышается их эффективность, расширяется диапазон допустимых температур, рН, возникают препараты узкого применения для наиболее сложных случаев (ароматических и полициклических углеводородов). Стратегическое планирование на уровне государства возлагает большие надежды на биоремедиацию почв [1], и, тем не менее...

У использования биопрепаратов кроме несомненных плюсов есть и недостатки, сужающие возможности их применения, а иногда делающие их опасными. Серьезные разливы нефти биологической очисткой, к сожалению, не удаляются — применимость биологических методов в большинстве случаев ограничивается концентрацией нефтепродуктов <3% к весу почвы [3]. Полнота удаления углеводородов при этом редко превышает 90%. Последнему есть ряд очевидных и неочевидных причин, на которых мы подробно остановимся в этой статье.

Очевидные причины неудач биоремедиации заключаются в отравляющем действии углеводородов [4]. Кроме того, не все углеводороды подвержены разложению (во всяком случае, быстрому). У микробов возникают проблемы с окислением полициклических ароматических, ароматических, разветвленных углеводородов, соединений с присадками тяжелых металлов или содержащих серу и галогены [5]. Остальные факторы, затрудняющие окисление нефтепродуктов, лежат несколько глубже, под поверхностью почвы.

Причина первая: геометрия пространства грунта

К биоремедиации в большинстве случаев приступают, когда нефтепродукт находится в почве в виде минорного компонента. Для начала необходимо сделать так, чтобы микроорганизмы-окислители достигли загрязнителя, предназначенного им в пищу, по всей глубине загрязненного слоя. Из микробных препаратов готовится водная суспензия, которая после полива инфильтруется в слое грунта, содержащего углеводороды. Эта суспензия в первую очередь попадает в крупные поры грунта (диаметром более 50 микрон) (рис. 1).

Постепенно капиллярные силы затягивают суспензию в мелкие поры, а микробные колонии либо располагаются по стенкам в виде биопленок [6], либо формируют скопления шариков [6]. А вот дальше в жизни искусственно внесенных микроорганизмов возникают трудности. Одна из таких трудностей связана с тем, что в грунте поры среднего размера уже густо заселены. На ней мы сосредоточим внимание ниже. Другая трудность проявит себя не сразу, а когда объем растущей колонии станет сопоставим с поперечником занятых пор. В естественных органоминеральных грунтах (почвы, торфы) поры очень извилисты и резко меняют диаметр. Можно сравнить их строение с чередованием больших гротов и узких «шкуродёрок» (меандров) в пещерах (рис. 2).

Слипшиеся микроорганизмы могут формировать в меандрах барьеры, непроницаемые для воды и воздуха. Углеводороды способствуют такому слипанию, т.к., например, многие микобактерии в их присутствии покрываются восковой капсулой. Получаются сгустки клеток размером до нескольких миллиметров [5], которые могут заткнуть даже самые крупные поры, затрудняя движение воды и воздуха.

Образование барьеров из микробных колоний вероятнее в тех грунтах, где углеводороды формируют капли, поскольку углеводородокисляющие микроорганизмы скапливаются на них [4]. Это возможно, например, при исходно высокой влажности грунта. Сухой грунт, содержащий органическое вещество, удерживает углеводород поверхностными силами своих органических молекул. Можно с уверенностью предположить, что добавление воды после того, как нефть «села» на почву, не ведет к образованию нефтяных капель [7]. Если углеводорода немного (1% относительно массы грунта), то формируются островки пленок [6], которые постепенно исчезают под поверхностью микробной биопленки. Возможно смыкание отдельных углеводородных или микробных пленок противоположных стенок с образованием пробок, когда просвет поры достаточно мал для межмолекулярного взаимодействия, а поверхностные энергии грунта, углеводорода и биомассы приблизительно равны. Это дает реализацию промежуточного сценария между капельным и пленочным.

Кроме пор, сравнимых по размеру с микроорганизмами, в грунтах присутствуют и более мелкие, называемые ультрамикропорами (<3 мкм) и криптопорами (<0,2 мкм) (рис. 3). Они образуются путем многократного дробления глинистых частиц (например, при увлажнении/высыхании). Для микробов данные поры практически недоступны, поскольку их собственные размеры редко бывают меньше одного микрона. Довольно бесполезны они и для корней растений, поскольку вода отсюда удаляется лишь при термической обработке или под большим давлением.

Тем не менее, в этих порах вполне могут размещаться углеводороды. И это составляет последнюю из обсуждаемых здесь геометрических проблем. Для простоты расчета возьмем один из парафинов с низкой летучестью — С₁₂Н₂₄. Длина межатомных связей С—С в нем равна 0,154 нм, а связей С—Н — 0,11 нм, т.е. общая длина молекулы — 1,91 нм. Теоретически эти молекулы могли бы размещаться в порах диаметром менее 2 нм. Длинные молекулы с 60 атомами углерода поместятся в поры около 12 нм. При этом надо помнить, что молекула, особенно длинная, вряд ли будет поддерживать себя в расправленном состоянии, поскольку внутри нее действует эффект энтропийного сворачивания (ответственный также за запутывание скручиваемой нитки). Т.е. реальная молекула длинноцепочечного углеводорода будет занимать несколько меньший объем, чем продиктовано простым сложением межатомных расстояний в ней. Получается, что криптопоры предоставляют более чем достаточно пространства для размещения самых крупных углеводородных молекул. В некоторых случаях вода, являясь антагонистом углеводородов, не позволяет им застрять здесь. Однако, например, в условиях пустынного климата достигается полное иссушение грунта, и сценарий попадания углеводорода в недоступные для микробов поры становится все более реальным.

Причина вторая: я чужой в этом мире...

Вернемся теперь к трудности из жизни внесенных в грунт микробов, связанной с уже живущими в нем соседями. Микромир нефтезагрязненной почвы не так разнообразен, как здоровой. Тем не менее, в зависимости от степени загрязнения здесь продолжает оставаться некоторый набор аборигенных существ (рис. 4). Они населяют преимущественно поры среднего размера (30–60 микрон), и от них зависит, смогут ли микробы-гости попасть в эти поры и обосноваться в них. Законы экологии диктуют, что внедриться в активное аборигенное сообщество микробам-гостям тяжело. Для внедрения необходим некий неиспользуемый сообществом ресурс, которым могут оказаться углеводороды. Если же все ресурсы уже используются членами аборигенного сообщества, то внесенные микробы для успешного размножения должны обладать конкурентными преимуществами, позволяющими им наращивать биомассу более эффективно, чем их соседи. В некоторых случаях происходит прямой антагонизм колоний с выделением антибиотиков. При таком развитии событий внесенные микробы представляют собой биологическое загрязнение, которое даже после удаления нефти лишит почву аборигенного сообщества. Не лишне напомнить, что аборигенное сообщество — неотъемлемая часть химизма почвы. Решение проблемы, созданной гостями-агрессорами, видится в пастеризации почвы с последующим использованием землевания — приема присыпания пострадавшей почвы слоем здоровой того же типа [3]. Тогда происходит перемещение части микробного сообщества с потоками влаги, и процесс можно сравнить с переливанием крови от одного человека другому. (Аналогия распространяется и на тот факт, что есть вероятность прилить несовместимую кровь.)

Мы повышаем шансы на выживание микробов-гостей, если вносим их в сообщество, находящееся в анабиозе. Состояние анабиоза микроорганизмов в почве достигается, например, при низких температурах или низкой влажности. Но даже при значениях температуры выше +50 °С и влажности около 0% исследователи показывают наличие в грунте активной жизни [8]. Факторы, вызывающие ее пробуждение, во многом остаются непредсказуемыми, и есть вероятность размножения микроорганизмов, пролежавших в анабиозе несколько миллионов лет [9]. В последнее время ученые все чаще отказываются от определения конкретных видов микроорганизмов грунта в пользу метагеномики — выделения фрагментов ДНК целых микробных сообществ [10]. Такой поворот методов продиктован тем, что на практике микробиологи зачастую способны зафиксировать лишь 5–10% видов, населяющих почву. По крайней мере, это признание заставляет осмотрительно относиться к внедрению новой микрофлоры.

Микробное сообщество грунта не есть сумма отдельных свойств его представителей (как то биомасса, обмен веществ и т.д.). Например, разложение бензина сообществом микроорганизмов идет быстрее, чем отдельных его компонентов чистыми культурами [4]. В первое десятилетие 21-го века было выявлено такое неожиданное свойство микроорганизмов, как выделение сигнальных веществ (см. врезку), «понятных» практически для всех членов сообщества [11], [12]. Данные вещества позволяют согласовать совместную работу сообщества по освоению среды, не оставляя свободной энергии для конкуренции и антагонизма [8], [11], [12]. К каждой новой стадии окисления углеводорода (как любой другой органики) подключается новая группа микробов. Зачастую углеводород разрушается, не являясь питанием, а по принципу соокисления [4]: микробы выделяют в среду ферменты для окисления питательных веществ, а вместе с этим попутно окисляются и вещества со сходным химическим строением. Реализуется примерно тот же принцип, что и при неспецифической защитной реакции организма. То есть, не являясь классическим организмом, микробное сообщество, тем не менее, проявляет такое его свойство, как согласованная работа отдельных частей, как бы перебрасывая мостик от индивидуальных колоний разных видов к их соединению в единый организм.

Причина третья: а почему я должен это есть?

Для процесса соокисления углеводородов необходимо некоторое количество органического вещества с высокой биологической доступностью. Это может быть глюкоза, но в полевых условиях такое вещество обычно заключено в гумусе, полисахаридных выделениях растений, органических остатках. В лаборатории физики почвогрунтов и на кафедре инженерной геологии Казанского федерального университета (где и работает автор этой статьи) более 10 лет проводятся исследования взаимного влияния грунта и углеводородов нефти. В этих опытах мы постоянно наблюдаем, что почва, содержащая небольшой процент органического углерода, быстрее самоочищается от нефти, чем песок, лишенный органики [7]. Еще до анализов заметно, что, простояв несколько недель с загрязнением, песок продолжает источать углеводородный запах, а почва приобретает аромат геосмина — земли после дождя.

Однако дополнительный источник органического вещества может и отрицательно сказаться на скорости разложения углеводородов. В частности, экспериментально изучая действие растений на самоочищение почвы, мы наблюдали, как мощные корневые системы зачастую тормозили исчезновение из почвы дизельного топлива и его компонентов [3]. Вероятно, в этих случаях механизм соокисления углеводородов не реализовался. Нельзя сказать, что углеводороды совсем не потребляются в пищу, но потребление корневых выделений при любом раскладе привлекательнее. Тем более, что микроорганизмы, их окисляющие, в обычных условиях питаются именно полисахаридами и парафинами, которые выделяют корни растений [4]. Поэтому засев растениями нефтезагрязненной почвы с целью ее очистки (фиторемедиация) не всегда оправдан.

Вообще говоря, как питательные вещества углеводороды не так уж плохи. Еще с 80-х годов 20 века нефтяные дистилляты стали использоваться для получения дешевого кормового белка [5]. Все классы углеводородов могут служить питанием для микроорганизмов, однако наиболее привлекательны н-алканы. Как отдельные вещества лучше всего окисляются н-алканы с длиной цепочки 10–18 атомов углерода [2], [5], [14], хуже — 6–9 атомов (они токсичны и быстро улетучиваются) [5]. Мы наблюдали, как изменяется состав сырой нефти в почве в процессе ее потребления аборигенными микроорганизмами: активнее всего окислялись алканы с длиной цепочки 20–27 атомов углерода. Более длинные углеродные цепочки тоже окисляются, но образуют тупиковые продукты, которые далее микробами не используются [5].

В общем виде процесс окисления углеводорода начинается с микробных ферментов — оксигеназ. Они вырабатываются организмами тем активнее, чем больше в окружающей среде продуктов распада углеводородов, а внесение глюкозы подавляет синтез этих ферментов [5]. Оксигеназа вводит один атом кислорода в концевую метильную группу углеводорода, и образуется спирт [2], [5], [14]. На следующих стадиях окисления с участием некоторых других ферментов последовательно получаются продукты: альдегид или кетон, жирная кислота и продукты ее окисления вплоть до углекислого газа и воды (подробнее эти стадии описаны в статье О. Логиновой «Бактерии-нефтедеструкторы для биоремедиации супесчаных почв Воронежской области» [2]). В конечном счете, весь процесс можно свести к обобщенным реакциям образования органического вещества или углекислого газа [14]:

Возможные сценарии судьбы углеводорода, которые описывает это уравнение:

1. Полный переход углерода в биомассу — потребляется минимум кислорода, углекислый газ не образуется, образуется две молекулы воды.
2. Углерод полностью расходуется на дыхание — потребляется максимум кислорода, образуется много воды.
3. Промежуточный случай, который можно определить, например, по экспериментальному выходу углекислого газа.

Заметим: количество вступившего в эту гипотетическую реакцию кислорода определяет путь, по которой она пойдет. Соответственно, создавая те или иные условия доступа микробов к кислороду, можно регулировать и продукцию их биомассы, и выброс углекислого газа в атмосферу. Последнее приобретает особое значение, когда идет биоремедиация в крупных масштабах и нет стремления вносить вклад в парниковый эффект планеты. Мы можем заключить, что обогащение грунта кислородом, которое, например, в США является основным способом биоремедиации, должно быть столь же осмотрительным, как применение любого другого метода.

Регулировать доступ микробов к кислороду можно уже упомянутым приемом землевания и поливом водой, поскольку влага является конкурентом воздуха за поровое пространство грунта. Если мы несколько ограничиваем подачу воздуха с поверхности, запирая его между водными линзами и немного увеличивая глубину загрязненного участка, то можем добиться ускорения разложения углеводорода примерно в 1,5 раза по сравнению с его разложением у самой поверхности [3].

Вывод: лучшее — враг хорошего

Размышления об условиях среды, нужных микроорганизмам для эффективного окисления загрязнителя, традиционно стартуют от лабораторных параметров: «температура 30..40 °С, рН 6..9». Однако в лаборатории у микробов не было другого дела, кроме как потреблять и размножаться. В поле же им приходится тратить энергию не только на размножение, но и на приспособление к случайным факторам. При этом нельзя с уверенностью сказать: будет ли микробная колония выполнять задачу очистки от загрязнения, или процесс приспособления уведет ее в другую сторону. С точки зрения умения приспосабливаться выигрывают аборигенные организмы. Внесенные искусственно колонии «заточены» под разрушение загрязнителя. Обе группы микроорганизмов могут помочь восстановлению грунтов. И на работу обеих групп могут неоднозначно повлиять высокая доступность кислорода, влаги и органики, извилистость и разветвленность пор.

В районах нефтедобычи (Татарстан, Томская область, Ханты-мансийский АО и др.) до использования биоремедиации применяются механические и физико-химические способы очистки, которые оперативно удаляют основную часть нефтепродуктов из грунта и подготавливают условия для живой компоненты. Далее перед экологами встает вопрос выбора приоритетов: повысить стоимость земель (вернуть в сельхозоборот, придать туристическую привлекательность и т.п.) или защитить грунтовые воды от остатков загрязнения. Биоремедиация — метод глубокой очистки, работающий довольно медленно (от нескольких месяцев до нескольких лет), поэтому быстрой экономической отдачи от него ждать не приходится. С точки зрения автора, наилучшим подходом будет изоляция восстанавливаемого участка (например, с помощью коллоидного барьера) от подземных вод. Далее следует проводить либо внесение микробного сообщества окислителей нефти и продуктов ее разложения, либо землевание слоем незагрязненной почвы (вышеупомянутое «переливание крови») с соответствующей агротехникой [3]. В первом случае дальнейшем шагом будет обеспечение биологической безопасности — здесь поможет математическое моделирование с учетом биологической кинетики (наиболее развито оно в пищевой промышленности, однако многими учеными предприняты попытки моделирования почвенных микробных популяций [3]). Разные подходы к биоремедиации, как мы увидели, могут как «запереть» углеводороды в грунте, так и привести к образованию новых загрязнителей, иногда более подвижных, чем исходный, т.е. ко вторичному загрязнению грунтов и грунтовых вод. Необходимость выбора приоритетов и гибкого реагирования на изменяющиеся условия среды делает биоремедиацию скорее искусством, чем технологией. В целом, мы еще слишком мало знаем о подземном микромире, чтобы уверенно управлять им вне стен лаборатории.

Литература

1. Рабочие материалы к стратегии развития биотехнологической отрасли промышленности до 2020 года. М., 2009. — 85 с.;
2. Бактерии-нефтедеструкторы для биоремедиации супесчаных почв Воронежской области;
3. Софинская О.А. Разложение н-тридекана в выщелоченном черноземе: дис. ... канд. биол. наук. — М.: МГУ, 2011;
4. Особенности биодеструкции различных классов углеводородов. (2011). OilLoot.RU;
5. Аркадьева З.А., Безбородов А.М., Блохина И.Н. Промышленная микробиология. М.: «Высш. шк.», 1989. — 688 c.;
6. SEUNGHYUN KIM, M. YAVUZ CORAPCIOGLU. (1997). . Transport in Porous Media. 26, 161-181;
7. О. А. Софинская, Е. О. Стаценко. (2015). Исследование нефтезагрязненной почвы с помощью рентгеновской микротомографии (модельный эксперимент). Почвоведение. 2015, 202-210;
8. Anna A. Gorbushina. (2007). Life on the rocks. Environmental Microbiology. 9, 1613-1631;
9. Громов Б.В. (1997). Удивительный мир архей. «Соросовский образовательный журнал». 4, 23–26;
10. Афонин А.А. Генетика прокариот;
11. Steve Atkinson, Paul Williams. (2009). Quorum sensing and social networking in the microbial world. J. R. Soc. Interface. 6, 959-978;
12. Eshel Ben-Jacob, Herbert Levine. (2006). Self-engineering capabilities of bacteria. Journal of The Royal Society Interface. 3, 197-214;
13. Элементы: «„Чувство кворума“: принятие коллективных решений в макро- и микромире»;
14. Билай В.И., Коваль Э.З. Рост грибов на углеводородах нефти. Киев, 1980. — 340 с..