биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


Мамонты, кости и лекарственная устойчивость: новые технологии позволяют изучать эволюцию возбудителей инфекционных заболеваний

[31 октября, 2013 г.]

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Изучение эволюции патогенных микроорганизмов до последнего времени сталкивалось с объективными трудностями, главной из которых было отсутствие ископаемых остатков их предковых форм. Как же узнать, какими были микроорганизмы, вызывавшие опустошительные эпидемии в древности и в средние века? Новые технологии, позволяющие изучать древнюю ДНК, обнаруживаемую в археологическом материале, а также современные методы эволюционного анализа, позволяют реконструировать историю древних эпидемий и искать предшественников современных возбудителей инфекционных заболеваний.

Обратите внимание!

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2013 в номинации «Лучший обзор».


Спонсор конкурса — дальновидная компания Life Technologies. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Изучение эволюции живых организмов невозможно представить без изучения их предков и «родственников» — отдаленных и близких. Долгое время считалось, что палеонтологические методы малоприменимы для изучения эволюции микроорганизмов, поскольку относительно малые размеры и отсутствие скелета не позволяют им сохраняться в окаменелостях в доступном для изучения виде. Исключение составляют, пожалуй, только цианобактерии, которые оказались способными формировать окаменелости двух типов: строматолиты (прижизненно минерализованные многослойные колонии) и микрофоссилии (одиночные минерализованные бактериальные клетки).

Значительный прогресс в палеомикробиологии был достигнут относительно недавно, когда было выяснено, что отдельные биологические молекулы могут сохраняться в палеонтологических образцах в течение миллионов лет. К счастью, одной из таких молекул является ДНК, что позволяет использовать обнаруженные фрагменты этого вещества для идентификации древних микроорганизмов и изучения их биологического разнообразия.

«Рекордсменами по выживанию» являются ДНК микроорганизмов, законсервированных внутри кусочков янтаря. В янтаре возрастом 25–35 млн. лет обнаружены, в частности, фрагменты ДНК стафилококков [1]. Применительно к микроорганизмам, вызывающим эпидемические инфекционные заболевания у человека, интерес представляют более поздние находки, связанные не только с палеонтологическим, но и с археологическим материалом. Как оказалось, возбудители инфекционных заболеваний, которые сопровождаются бактериемией (то есть проникновением возбудителя в кровь), — такие, например, как возбудители чумы, сыпного тифа и т.д., — заносятся с током крови во внутренние ткани зубов (пульпу). ДНК этих возбудителей сохраняется в пульпе зубов после смерти заболевшего, причем, благодаря особенностям анатомического строения зубов, проникновение посторонних микроорганизмов в пульпу практически не происходит.

Рисунок 1. Способ экстракции ДНК из пульпы зуба. Картинка из [2].

Для того, чтобы извлечь бактериальную ДНК из пульпы зубов, предложено несколько остроумных способов. Один из них состоит в том, что зуб извлекают из черепа, обрабатывают его поверхность антисептиком, заливают слоем стерильной резины (рис. 1а) для того, чтобы избежать контаминации (загрязнения) чужеродной ДНК на последующих этапах работы, разрезают верхушку зуба в стерильных условиях, чтобы открыть доступ к пульпе (рис. 1b—с), впрыскивают туда стерильной иглой раствор, который растворяет ДНК (рис. 1d), а затем помещают зуб в стерильную пробирку (рис. 1e) и центрифугируют на высокой скорости (рис. 1f) для того, чтобы содержащий ДНК раствор под действием центробежной силы перешел в пробирку. Количество полученной ДНК можно затем многократно увеличить, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

В полимеразной цепной реакции используются уникальные одноцепочечные фрагменты ДНК (так называемые праймеры), которые позволяют распознать в изучаемой пробе и многократно увеличить количество (амплифицировать) только ДНК определенного вида микроорганизмов, — например, ДНК возбудителя чумы и никакую иную. Использование ПЦР для обнаружения микробной ДНК в ископаемых останках и археологическом материале позволило сделать множество совершенно удивительных открытий.

Так, например, установлено, что опустошительную эпидемию «Черной смерти», разразившуюся в Европе в середине XIV столетия, вызвали два штамма возбудителя чумы, которые были занесены независимо друг от друга и распространялись разными путями — первый с юга Европы на север, а второй — по побережью Балтийского и Северного морей, вызывая вспышки этой смертельной инфекции в ганзейских городах [34].

ПЦР помогает также реконструировать исторические события: например, с использованием этого метода установлено, что осада города Дуэ французами во время войны за испанский престол (1710–1712 гг.) сопровождалась вспышкой сыпного тифа, возникшей, вероятно, вследствие заноса возбудителя этого заболевания — риккетсии — в Европу испанскими солдатами из Нового Света [5]. ДНК риккетсий обнаруживалась в пульпе зубов испанских солдат, массовые захоронения которых найдены в окрестностях этого города.

Впечатляющие результаты достигнуты благодаря палеомикробиологическим исследованиям в области изучения возбудителя туберкулёза. Турбекулез зачастую осложняется гематогенной диссеминацией возбудителя (т.е. распространением его через кровь) и поражением костей, — в частности, костей позвоночника. ДНК микобактерий туберкулёза может быть извлечена из пораженной костной ткани и использована для исследований. Кроме того, некоторые липидные факторы вирулентности микобактерий могут неплохо сохраняться в мумифицированных останках животных и человека, что позволяет подтверждать диагноз туберкулёза.

Выяснено, что туберкулезом страдали животные, на которых охотился первобытный человек — бизоны и мамонты [6]. Кроме того, очевидно, что туберкулёзом были поражены и первобытные люди, начиная с железного века. Возбудитель туберкулеза был обнаружен в костях людей из захоронения Аймырлыг на юге Сибири, датированного 2000 лет до н.э. [7], а также в костях детей из неолитической стоянки Атлит на территории современного Израиля, возраст которой определен в 9000 лет [8]. Учитывая, что поселение Атлит является самым древним из известных центров одомашнивания диких животных, не исключено, что первобытные люди заражались туберкулёзом от одомашненного крупного рогатого скота. ДНК микобактерий туберкулёза с большой частотой определялась в костях жителей Древнего Египта, начиная с 3500 лет до н.э.

Таким образом, туберкулез являлся частой инфекцией в древности. Однако ученых интересует вопрос о том, вызывали ли древние эпидемии те же варианты возбудителя, что и сейчас, или это были совершенно другие штаммы.

Применительно к возбудителю туберкулёза наибольший интерес вызывает происхождение штаммов генетического семейства Beijing (произносится как «Бэйджинг»), впервые выявленного в гистологических препаратах лёгочной ткани 1956–1990 гг. от больных из предместий Пекина. Штаммы этого генетического семейства являются наиболее контагиозными (т.е. заразными) и легче всего приобретают устойчивость к противотуберулезным препаратам, что делает весьма затруднительным лечение и ухудшает прогноз заболевания. Ответить на вопрос о происхождении штаммов Beijing помогают филогенетические исследования, основанные на анализе ДНК современных микобактерий туберкулеза, распространенных в различных географических регионах Земли в различных этнических группах.

Филогенетические методы в биологии и медицине

Филогенетические методы в биологии и медицине используют для установления родственных связей между таксономическими единицами (видами и популяциями внутри вида, — в частности, штаммами микроорганизмов). Основной задачей филогенетического анализа является установление наиболее вероятного «сценария», по которому шла эволюция тех или иных форм жизни.

Филогенетический анализ основан на допущении, что в ходе эволюции живые организмы претерпевают изменения, причем количество изменений прямо пропорционально времени, прошедшему с момента их происхождения (см. также: «Сверим часы»). Очень часто для установления родства между различными организмами используются молекулярные данные, — например число аминокислотных замен в различных белках или замен нуклеотидов в ДНК. Такие данные позволяют избежать субъективизма исследователя и, кроме того, хорошо подходят для статистического анализа.

Например, на основе изучения изменений аминокислот в молекуле гемоглобина возможно оценить родство человека и разных других видов млекопитающих. Гемоглобин взрослого человека состоит из двух идентичных полипептидных α-цепей, двух идентичных β-цепей и присоединенных к ним групп гема. Каждая α-цепь содержит по 141 аминокислоте, а каждая β-цепь — по 146 (каждая цепь кодируется своим геном).

Как показывают данные, представленные в табл. 1, у человека и у шимпанзе последовательности аминокислот и в α-, и в β-цепях идентичны. Гемоглобины человека и гориллы различаются лишь по двум аминокислотам (по одной в каждой цепи). Человек и обезьяны довольно близки друг к другу по строению гемоглобина; различия в строении гемоглобина между человеком и представителями других отрядов млекопитающих гораздо шире — от 10 до 26% (табл. 1). Гемоглобин человека отличается от гемоглобина лягушки и карпа сильнее, как и следовало ожидать. Различия в аминокислотной последовательности β-цепи между человеком и лягушкой составляют 46%, а различия в α-цепи между человеком и карпом — 50% (Dayhoff, 1972).

Таблица 1. Различия в аминокислотных последовательностях гемоглобина между человеком и другими млекопитающими.
Пара видовРазличия
α-цепьβ-цепь
Человек — шимпанзе00
Человек — горилла11
Человек — макак-резус35
Человек — макак5–7
Человек — мышь13–1518
Человек — кролик1810
Человек — собака16–1710
Человек — лошадь1317
Человек — лама1614
Человек — свинья1316
Человек — корова1217
Человек — овца1518
Человек — коза14–1618–20
Человек — гривистый баран15–1621–23
Человек — гигантский серый кенгуру1926

Степень филогенетического родства между организмами (в частности штаммами микроорганизмов) может быть отображена графически в виде дендрограммы (филогенетического дерева; на рис. 2 представлен упрощенный вариант дерева).


Рисунок 2. Филогенетические взаимоотношения некоторых животных.

Как видно, человек и шимпанзе располагаются на филогенетическом дереве рядом — значительно ближе друг к другу, чем к птицам или рыбам. Это означает, что человек и шимпанзе являются друг другу более «близкими родственниками», чем рыбам или птицам, и имеют гипотетического общего предка. Филогенетическое дерево состоит из внутренних и внешних ветвей, узлов и корня (если выбрано укорененное дерево). Внутренние ветви соединяют внутренние узлы, внешние ведут непосредственно к объектам исследования (рис. 3).


Рисунок 3. Укорененное филогенетическое дерево и элементы его топологии.

Порядок следования всех ветвей дерева называют его топологией. Деревья с корнем отражают направление эволюции, порядок ответвления от общего предка (дивергенции), датирование этих эволюционных событий. Деревья без корня (рис. 4) показывают родственные отношения между анализируемыми штаммами, но не направление эволюции.


Рисунок 4. Филогенетическое дерево без корня.

Объектами филогенетических исследований в эпидемиологии являются штаммы микроорганизмов или соответствующие нуклеотидные последовательности. Эти объекты исследований являются т.н. оперативными таксономическими единицами (ОТЕ). В филогенетических деревьях выделяют кластеры, объединяющие группы ОТЕ, имеющих общего предка. В эпидемиологии изоляты, находящиеся в одном кластере, как правило, относят к одному эпидемическому штамму (клону или семейству штаммов), поскольку филогенетическое родство входящих в кластер культур фактически означает, что между ними когда-то существовали эпидемические связи.

Для изучения популяционной структуры микобактерий туберкулёза используются различные молекулярно-генетические методы. Одним из наиболее распространенных является метод MIRU—VNTR, основанный на обнаружении в ДНК микроорганизма специфических повторяющихся последовательностей — тандемных повторов. Родственные культуры возбудителя имеют совпадающее число тандемных повторов в специальных участках хромосомы (называемых MIRU—VNTR-локусами). На основании MIRU—VNTR метода можно изучить эволюционные отношения между отдельными штаммами, входящими в генетическое семейство Beijing и построить филогенетическое дерево, отражающее эволюционные связи между этими штаммами (подобное неукорененное дерево приведено на рис. 5).

Рисунок 5. Филогенетическое дерево 48 основных штаммов микобактерий туберкулёза внутри генотипа Beijing M. tuberculosis, представляющих различные географические регионы. Каждая ветвь представляет одно генетическое событие (одно изменение в одном локусе ДНК). Пунктирные линии обозначают возможные альтернативы. Рисунок из [9].

Нетрудно заметить, что наиболее распространенным штаммом (генотипом) является генотип M11, который располагается в центре филогенетического дерева. Это, по-видимому, означает, что данный генотип является наиболее древним — родоначальником других штаммов. Если оценить современное географическое распространение этого штамма в Евразии, то окажется, что наиболее широко он распространен в Китае; при этом его доля убывает в направлении с востока на запад до северо-запада Российской Федерации. В то же время, в странах Западной Европы генотип M11 практически не встречается (рис. 6).

Рисунок 6. Географическое распределение основных MIRU-типов генотипа Beijing M. tuberculosis.

Размер диаграмм на рис. 6 приблизительно пропорционален доле штаммов Beijing в общей популяции M. tuberculosis. Цифрами обозначен индекс генетического разнообразия (чем ближе этот показатель к единице, тем более разнообразна популяция возбудителя туберкулёза) [9]. Данные, представленные на рисунках 5 и 6, позволяют предположить, что генетическое семейство Beijing сформировалось в Китае (поскольку наиболее древняя его ветвь преобладает именно в Северном Китае), а затем распространялось в западном направлении, что и обеспечило «градиент» частоты его встречаемости. Наиболее вероятной гипотезой, объясняющей распространение возбудителя туберкулёза в направлении с Востока на Запад, является миграция населения, произошедшая в историческом прошлом.

Но какая же миграция населения могла привести к распространению этого генетического семейства туберкулеза в Евразии? Поскольку Beijing не является эндемичным для Европы, можно исключить миграции, которые в равной степени затрагивали Россию и Европу, как источник исключительного проникновения штаммов Beijing в Россию. К таковым относятся финно-угорская, скифская, и гуннская экспансии [10]. Выдвинуто предположение [9], что проникновение штаммов Beijing в Россию могло быть связано с евразийской экспансией монгольской империи Чингисхана в 13–15 веках. Средневековая монгольская империя впервые в истории тесно связала отдаленные части евразийского суперконтинента и создала единую экономическую и культурную систему, охватывавшую огромное пространство Евразии. Связи монголо-татар с Русью были тесными и продолжительными (в отличие от контактов с европейцами), что, вероятно, и обеспечило укоренение на территории России штаммов генетического семейства Beijing.

Таким образом, изучение эволюции патогенных микроорганизмов во многом связано с изучением истории человечества, эпидемий, войн и вызванных ими миграций. Междисциплинарные исследования, использующие данные естественных и гуманитарных наук, позволяют глубже понять картину совместного сосуществования популяций микроорганизмов и человеческого общества.

Литература

  1. Lambert L.H., Cox T., Mitchell K., Rosselló-Mora R.A., Del Cueto C., Dodge D.E., Orkand P., Cano R.J. (1998). Staphylococcus succinus sp. nov., isolated from Dominican amber. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 511–518;
  2. Tran-Hung L., Tran-Thi N., Aboudharam G., Raoult D., Drancourt M. (2007). A new method to extract dental pulp DNA: application to universal detection of bacteria. PLoS One 2(10), e1062;
  3. Haensch S., Bianucci R., Signoli M., Rajerison M., Schultz M., Kacki S., Vermunt M., Weston D.A., Hurst D., Achtman M., Carniel E., Bramanti B. (2010). Distinct clones of Yersinia pestis caused the Black Death. PLoS Pathog. 6(10), e1001134;
  4. биомолекула: «Это чума»;
  5. Nguyen-Hieu T., Aboudharam G., Signoli M., Rigeade C., Drancourt M., Raoult D. (2010). Evidence of a louse-borne outbreak involving typhus in Douai, 1710–1712 during the war of Spanish succession. PLoS One 5(10), e15405;
  6. Lee O.Y., Wu H.H., Donoghue H.D., Spigelman M., Greenblatt C.L., Bull I.D., Rothschild B.M., Martin L.D., Minnikin D.E., Besra G.S. (2012). Mycobacterium tuberculosis complex lipid virulence factors preserved in the 17,000-year-old skeleton of an extinct bison, Bison antiquus. PLoS One 7(7), e41923;
  7. Taylor G.M., Murphy E., Hopkins R., Rutland P., Chistov Y. (2007). First report of Mycobacterium bovis DNA in human remains from the Iron Age. Microbiology 153, 1243–1249;
  8. Hershkovitz I., Donoghue H.D., Minnikin D.E., Besra G.S., Lee O.Y., Gernaey A.M., Galili E., Eshed V., Greenblatt C.L., Lemma E., Bar-Gal G.K., Spigelman M. (2008). Detection and molecular characterization of 9,000-year-old Mycobacterium tuberculosis from a Neolithic settlement in the Eastern Mediterranean. PLoS One 3, e3426;
  9. Мокроусов И.В. Генетическое разнообразие и эволюция Mycobacterium tuberculosis. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, Спб. 2009;
  10. Underhill P.A., Passarino G., Lin A.A., Shen P., Mirazón Lahr M., Foley R.A., Oefner P.J., Cavalli-Sforza L.L. (2001). The phylogeography of Y chromosome binary haplotypes and the origins of modern human populations. Ann. Hum. Genet. 65, 43–62.

Автор: Гончаров Артемий.

Число просмотров: 478.

Creative Commons License — условия использования и распространения материалов сайта.
Вернуться в раздел «Технология»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.