биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


Фуллерены: неожиданные биологические свойства углеродных наночастиц

[3 ноября, 2013 г.]

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Поиск соединений, способных продлить жизнь и отодвинуть старость — одна из самых актуальных задач современной науки. Сообщение о том, что исследователям из Франции удалось добиться почти двукратного увеличения продолжительности жизни экспериментальных животных при помощи фуллеренов (наночастиц углеродной природы), заставило ученых задуматься над молекулярными механизмами подобного эффекта. Эта статья повествует о компьютерном моделировании возможных механизмов биологической активности фуллеренов и о первых попытках подтвердить полученные модели в биологических экспериментах.

Обратите внимание!

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2013 в номинации «Своя работа».


Спонсор конкурса — дальновидная компания Life Technologies. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Мячи для нанофутболистов

Фуллерены — это довольно необычный класс молекул, представляющих собой одну из форм существования углерода (так называемых аллотропных модификаций). Всем известные алмаз и графит — тоже не что иное, как разные аллотропные формы углерода, однако в структуре алмаза атомы углерода собраны в тетраэдры, графит состоит из плоских слоев, образованных шестиугольниками, ну а фуллерены —это шарообразные молекулы с замкнутой поверхностью. Самый простой из фуллеренов содержит 60 атомов углерода и удивительным образом напоминает по своей структуре футбольный мяч: его поверхность образована чередующимися пяти- и шестиугольниками, причем размер этого «мяча» составляет всего 1 нм (нанометр).

Рисунок 1. Молекула фуллерена очень похожа на футбольный мяч, только забивать им голы сможет лишь футболист наноскопического размера.

Открытие фуллеренов — один из ярких примеров прогностической мощи науки: еще в 70-е годы XX века были сделаны теоретические квантово-химические расчеты, предсказывающие существование подобных молекул, однако лишь в 1985 году их впервые обнаружили при исследовании паров графита после его лазерного облучения [1]. Позднее фуллерены были найдены и в природных минералах — особняком здесь стоит такой камень, как шунгит [2]. А недавно выяснилось, что эти углеродные «шарики» встречаются даже в космических туманностях [3].

Физики и химики нашли фуллеренам множество применений: их используют при синтезе новых соединений в оптике и при производстве проводников. О биологических же свойствах фуллеренов долгое время поступали неоднозначные данные: биологи то объявляли их токсичными [4], то обнаруживали антиоксидантные свойства фуллеренов и предлагали использовать их в лечении таких серьезных заболеваний, как бронхиальная астма [5].

Крысы-долгожители

В 2012 году увидела свет публикация, которая привлекла внимание геронтологов — специалистов, работающих над проблемами старения. В этой работе Тарек Баати и соавторы [6]* продемонстрировали впечатляющие результаты — крысы, которых кормили суспензией фуллеренов в оливковом масле, жили вдвое дольше обычных, и, к тому же, демонстрировали повышенную устойчивость к действию токсических факторов (таких как четыреххлористый углерод). Токсичность этого соединения обусловлена его способностью генерировать активные формы кислорода (АФК) [7], а значит, биологические эффекты фуллеренов, скорее всего, можно объяснить их антиоксидантными свойствами (способностью «перехватывать» и дезактивировать АФК).

* — Подробно об этом «биомолекула» уже рассказывала: «Алхимия „волшебной сажи“ — перспективы применения фуллерена С60 в медицине» [8]. — Ред.

Связь активных форм кислорода с процессами, происходящими при старении, в настоящее время уже практически не подвергается сомнению. С 60-х годов ХХ века, когда была сформулирована свободнорадикальная теория старения [9], и до настоящего времени объем данных, подтверждающих такую точку зрения, только накапливается. Однако до сих пор ни один антиоксидант — ни природный, ни синтетический — не давал столь поразительного увеличения продолжительности жизни экспериментальных животных, как в опытах Баати и коллег. Даже специально сконструированные коллективом под руководством академика Скулачева антиоксиданты «адресного действия» — так называемые «ионы Скулачева», или соединения ряда SkQ, — демонстрировали менее значительные эффекты [10].

Эти вещества представляют собой липофильные положительно заряженные молекулы с присоединенным антиоксидантным «хвостом», которые благодаря своей структуре способны накапливаться в митохондриях (именно в этих органоидах эукариотических клеток происходит генерация активных форм кислорода). Однако соединения ряда SkQ продлевали жизнь подопытных мышей в среднем всего на 30%.

Рисунок 2. Слева — мышь, старение которой замедлено благодаря приему «ионов Скулачева», справа — мышь из контрольной группы [11].

Почему же фуллерены оказались столь эффективными в борьбе со старением?

Задавшись этим вопросом, мы стали рассматривать возможность существования дополнительного механизма биологического действия фуллеренов — кроме уже известного антиоксидантного. Подсказка обнаружилась при изучении одного из соединений ряда SkQ — SkQR1, содержащего остаток родамина. Это соединение относится к группе протонофоров — молекул, способных переносить протоны из межмембранного пространства через мембрану в матрикс митохондрии, снижая, таким образом, трансмембранный потенциал (Δψ). Как известно, именно этот потенциал, существующий благодаря разнице в содержании протонов по разные стороны мембраны, и обеспечивает выработку энергии в клетке. Однако он же и является источником генерации АФК. В сущности, активные формы кислорода здесь сродни «токсическим отходам» при производстве энергии. Хотя они имеют и ряд полезных функций [12], в основном АФК — источник повреждения ДНК, липидов и многих внутриклеточных структур.

Рисунок 3. Схема строения митохондрии (слева), перенос протонов органическими кислотами — «мягкими разобщителями» (в центре) — и динитрофенол — самый известный из «разобщителей» (справа).

Есть сведения, что некоторое снижение митохондриального трансмембранного потенциала может быть полезным для клеток [13]. Снижение его всего на 10% приводит к уменьшению продукции АФК в 10 раз [14]! Существуют так называемые «мягкие разобщители», повышающие протонную проводимость мембран, в результате чего происходит «разобщение» дыхания и фосфорилирования АТФ [15].

Пожалуй, самый известный «разобщитель» — DNF, или 2,4-динитрофенол (рис. 3). В 30-е годы ХХ века им очень активно пользовались при лечении ожирения. Собственно, динитрофенол — первый «жиросжигатель», использовавшийся в официальной медицине. Под его действием клетка переключается на альтернативный путь метаболизма, запуская «сжигание» жиров, а получаемая клеткой энергия не запасается в АТФ, как обычно, а излучается в виде тепла.

Поиск легких способов похудения будет актуален всегда, пока представители Homo Sapiens будут беспокоиться о своем внешнем виде; однако для нашего исследования более интересен тот факт, что подобные «мягкие разобщители» снижают выработку АФК и в небольших дозах могут способствовать продлению жизни [16].

Возникает вопрос — а могут ли фуллерены, кроме антиоксидантных свойств, проявлять еще и свойства «переносчиков» протонов, действуя, таким образом, сразу с двух сторон? Ведь шарообразная молекула фуллерена — полая изнутри, а значит, в ней вполне могут уместиться небольшие частицы — такие как протоны.

Моделирование in silico: что сделали физики

Для проверки этой гипотезы коллективом НОЦ «Наноразмерная структура вещества» были выполнены сложные расчеты. Как и в истории с открытием фуллерена, в нашем исследовании компьютерное моделирование предшествовало экспериментам. Моделирование возможности проникновения протона в фуллерен и распределения заряда в такой системе производилось на основе теории функционала плотности (DFT). Это широко используемый инструмент квантово-химических расчетов, позволяющий вычислять свойства молекул с высокой точностью.

При моделировании один или несколько протонов помещали вне фуллерена, а затем производился расчет наиболее оптимальной конфигурации — такой, при которой полная энергия системы будет минимальной. Результаты расчетов показали: протоны могут проникать внутрь фуллерена! Оказалось, внутри молекулы C60 может накапливаться до шести протонов одновременно, а вот седьмой и последующие уже не смогут проникнуть внутрь и будут отталкиваться — дело в том, что «заряженный» протонами фуллерен приобретает положительный заряд (а, как известно, одноименно заряженные частицы отталкиваются).

Рисунок 4. Распределение положительного заряда внутри системы «фуллерен+протоны». Слева направо: два, четыре или шесть протонов внутри фуллерена. Цветом обозначено распределение заряда: от нейтрального (красный) до слабоположительного (синий).

Происходит это потому, что проникающие внутрь фуллеренового «шарика» протоны оттягивают на себя электронные облака атомов углерода, что приводит к перераспределению заряда в системе «протоны+фуллерен». Чем больше протонов проникает внутрь, тем сильнее положительный заряд на поверхности фуллерена, тогда как протоны, напротив, все сильнее приближаются к нейтральным значениям. Эту закономерность можно проследить и на рисунке 4: когда количество протонов внутри сферы превышает 4, они становятся нейтральными (желто-оранжевый цвет), ну а поверхность фуллерена всё сильнее «синеет».

Вначале расчеты были выполнены только в системе «фуллерен+протоны» (без учета влияния других молекул). Но ведь в клетке фуллерен находится не в вакууме, а в водной среде, заполненной множеством соединений разной степени сложности. Поэтому на следующем этапе моделирования физики добавили к системе 47 молекул воды, окружающих фуллерен, и проверили, не повлияет ли их присутствие на взаимодействие с протонами. Однако и в присутствии воды модель действовала успешно.

Биологи подтверждают гипотезу?

Известие о том, что фуллерены могут адсорбировать протоны, да еще и приобретают при этом положительный заряд, вдохновило биологов. Похоже, что эти уникальные молекулы и вправду действуют сразу несколькими путями: инактивируют активные формы кислорода (в частности, гидроксильные радикалы, присоединяя их по многочисленным двойным связям [17]), адресно накапливаются в митохондриях благодаря своим липофильным свойствам [18] и приобретенному положительному заряду, и, вдобавок ко всему, снижают трансмембранный потенциал, перенося протоны внутрь митохондрий, подобно другим «мягким разобщителям» дыхания и окислительного фосфорилирования.

Для изучения антиоксидантных свойств фуллеренов мы использовали систему экспресс-тестов на основе биолюминесцентных бактериальных биосенсоров. Биосенсоры в данном случае — генетически-модифицированные бактерии, способные улавливать повышение внутриклеточной генерации АФК и «сигнализировать» об этом исследователям. При создании биосенсоров в генóм одного из безвредных штаммов кишечной палочки Escherichia coli вводится искусственная конструкция, состоящая из генов люминесценции (свечения), поставленных под контроль специфических промоторов — регуляторных элементов, «включающихся» при повышении внутриклеточной генерации активных форм кислорода, или же при действии иных стресс-факторов — например, при повреждении ДНК. Стоит начать действовать на клетку таким стресс-фактором — бактерия начинает светиться, и по уровню этого свечения можно с достаточной точностью определить уровень повреждений.

Рисунок 5. Светящиеся бактерии на чашке Петри (слева) и принцип действия биосенсоров (справа).

Такие модифицированные штаммы разрабатываются в ГосНИИ Генетики [19] и широко применяются в генетической токсикологии [20] при изучении механизмов действия излучений и окислительного стресса [21], действия антиоксидантов (в частности, SkQ1 [22]), а также для поиска новых перспективных антиоксидантов среди синтезируемых химиками веществ [23].

В нашем случае использование именно бактериальной модели обусловлено следующим: бактерии, как известно, относятся к прокариотам, и клетки их устроены проще, чем эукариотические. Процессы, происходящие в мембране митохондрий эукариот, у прокариот реализуются прямо в клеточной мембране; в этом смысле бактерии — «сами себе митохондрии». (Удивительное сходство строения этих органелл с бактериями даже послужило в свое время основой для так называемой симбиотической теории происхождения эукариот [24].) Следовательно, для изучения процессов, происходящих в митохондриях, подобная модель вполне подходит.

Первые же результаты показали, что водная суспензия фуллерена C60, для более эффективного растворения обработанная ультразвуком, при добавлении к культуре биосенсоров увеличивала их устойчивость к повреждению ДНК активными формами кислорода. Уровень таких повреждений в опыте был на 50–60% ниже, чем в контроле.

Кроме того, было зафиксировано снижение уровня спонтанной продукции супероксид-анион-радикала в клетках SoxS-lux штамма при добавлении суспензии C60. Особенностью этого штамма как раз и является связь уровня его свечения с количеством супероксид-анион-радикала. Именно такого эффекта следует ожидать от соединения, действующего по принципу «мягких разобщителей» — если снижается трансмембранный потенциал, то и АФК (в частности, супероксид) будут вырабатываться в меньших количествах.

Полученные результаты, конечно, весьма предварительны, и работы еще продолжаются, именно поэтому в подзаголовке данного раздела и стоит вопросительный знак. Время покажет, сможем ли мы со временем заменить его на уверенный восклицательный. Ясно одно — в ближайшее время фуллерены неизбежно окажутся в фокусе внимания научных коллективов, изучающих проблемы старения и занимающихся поиском геропротекторов — веществ, замедляющих старение. И кто знает, не станут ли эти крохотные «шарики» надеждой на продление столь короткой пока человеческой жизни?

Работа проводилась в лаборатории экспериментального мутагенеза и лаборатории промышленных микроорганизмов НИИ биологии ЮФУ, а также в НОЦ «Наноразмерная структура вещества», ЮФУ, под руководством проф. А.В. Солдатова. Основные результаты моделирования системы «фуллерен+протоны» и биологические эффекты описаны, соответственно, в работах:

  1. Chistyakov V.A., Smirnova Yu.O., Prazdnova E.V., Soldatov A.V. (2013). Possible Mechanisms of Fullerene C60 Antioxidant Action. Biomed. Res. Int. 2013, 821498 и
  2. Prazdnova E.V., Chistyakov V.A., Smirnova Yu.O., Soldatov A.V., Alperovich I.G. (2013). Possible Mechanisms of Fullerene C60 Antioxidant Action. In: II German-Russian Interdisciplinary Workshop «Nanodesign: Physics, Chemistry and Computer modeling». Rostov-on-Don, 2013, 23.

Литература

  1. Соколов В. И., Станкевич И. В. (1993). Фуллерены — новые аллотропные формы углерода: структура, электронное строение и химические свойства. Успехи химии 62б, 455;
  2. Buseck P.R., Tsipursky S.J., Hettich R. (1992). Fullerenes from the Geological Environment. Science 257, 215–217;
  3. Око планет: «В космосе впервые обнаружен фуллерен»;
  4. Андриевский Г.В., Клочков В.К., Деревянченко Л.И. Токсична ли молекула фуллерена С60? Или к вопросу: «Какой свет будет дан фуллереновым нанотехнологиям — Красный или все-таки зеленый?». Электронный журнал «Вся медицина в Интернете!»;
  5. Ширинкин С.В., Чурносов М.И., Андриевский Г.В., Васильченко Л.В. (2009). Перспективы использования фуллеренов в качестве антиоксидантов в патогенетической терапии бронхиальной астмы. Клиническая медицина № 5 (2009), 56–58;
  6. Baati T., Bourasset F., Gharb N., et al. (2012) The prolongation of the lifespan of rats by repeated oral administration of 60fullerene. Biomaterials 33, 4936–4946;
  7. Manibusan M.K., Odin M., Eastmond D.A. (2007). Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185–209;
  8. биомолекула: «Алхимия „волшебной сажи“ — перспективы применения фуллерена С60 в медицине»;
  9. Harman D. (1956). Aging: A theory based on free radical and radiation chemistry. J. Gerontol. 11, 289–300;
  10. Skulachev V.P. (2005). How to clean the dirtiest place in the cell: Cationic antioxidants as intramitochondrial ROS scavengers. IUBMB Life 57, 305–310;
  11. Anisimov V. N., et al. (2008). Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives as tools to interrupt execution of the aging program. 5. SkQ1 prolongs lifespan and prevents development of traits of senescence. Biochemistry (Moscow) 73, 1329–1342;
  12. биомолекула: «Активный кислород: друг или враг, или о пользе и вреде антиоксидантов»;
  13. Антоненко Ю.Н. и др. (2011). Производные родамина 19 как мягкие митохондриально-ориентированные катионные разобщители. Оригинал: J. Biol. Chem. 286, 17831–17840;
  14. Severin F.F., et al. (2010). Penetrating cation/fatty acid anion pair as a mitochondria-targeted protonophore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 663–668;
  15. Скулачев В.П. Рассказы о биоэнергетике, 2-е издание. — М: Молодая гвардия, 1982;
  16. Северин Ф.Ф., Скулачёв В.П. (2009). Запрограммированная клеточная смерть как мишень борьбы со старением организма. Успехи геронтол. 22, 37–48;
  17. Andrievsky G.V., et al. (2009). Peculiarities of the antioxidant and radioprotective effects of hydrated C60 fullerene nanostructures in vitro and in vivo. Free Radic. Biol. Med. 47, 786–793;
  18. Xiao Y., Wiesner M.R. (2012). Characterization of surface hydrophobicity of engineered nanoparticles. J. Hazard. Mat. 215, 146–151;
  19. Zavilgelsky G.B., Kotova V.Y., Manukhov I.V. (2007). Action of 1,1-dimethylhydrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide. Mutat. Res. 634, 172–176;
  20. Празднова Е.В., Севрюков А.В., Новикова Е.В. (2011). Детекция сырой нефти при помощи бактериальных Lux-биосенсоров. Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки № 4 (2011), 80–83;
  21. Празднова Е.В., Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Кхатаб З.С. (2012). Перекись водорода и генотоксичность ультрафиолетового излучения с длиной волны 300–400 нм. Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки № 1 (2012), 85–87;
  22. Чистяков В.А., Празднова Е.В., Гутникова Л.В., Сазыкина М.А., Сазыкин И.С. (2012). Супероксидустраняющая активность производного пластохинона — 10-(6’-пластохинонил) децилтрифенилфосфония (SkQ1). Биохимия 77, 932–935;
  23. Олудина Ю.Н и др. (2013). Синтез модифицированных пространственно-затрудненных фенолов и исследование их способности защищать ДНК бактерий от повреждения ультрафиолетом B. Химико-фармацевтический журнал (в печати);
  24. Кулаев И.С. (1998). Происхождение эукариотических клеток. Соросовский Образовательный Журнал № 5 (1998), 17–22.

Автор: Празднова Евгения.

Число просмотров: 3615.

Creative Commons License — условия использования и распространения материалов сайта.
Вернуться в раздел «In Silico»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Re: Фуллерены: неожиданные биологические свойства углеродных наночастиц

potan (http://potan.livejournal.com/) — 22 ноября, 2013 г. 10:49. (ссылка)

Получается, что если увеличить в митохондриях количество АТФ-синтазы, мембранный потенциал сократится, но и энергия теряться не будет.
Возможно ли в митохондрии какой-нибудь клетки (мышинной яйцеклетки или, хотя бы клеточной линии) удвоить этот ген или усилить его промотер?

(ответить)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.