Стремительное развитие биотехнологий двух последних десятилетий позволяет ученым работать и совершать открытия со скоростью, которая и не снилась ученым еще 50 лет назад. Амбициозному проекту «Геном человека» под эгидой Национальной организации здравоохранения США (NIH) понадобилось 13 лет (1990–2003) для определения нуклеотидной последовательности человеческого генома. Частная компания Celera Genomics под руководством Крейга Вентера приступила к параллельному проекту по секвенированию генома человека значительно позже, в 1998 году, но благодаря значительному развитию технологий в области молекулярной биологии, завершила полное секвенирование генома одновременно (на самом деле там было все сложнее — см. «Геном человека: как это было и как это будет» [1]). В тот год у Вентера было немало поводов для гордости: руководимый им коллектив исследователей не только выполнил работу гораздо быстрее, но и значительно экономнее. Celera Genomics потратила в десять раз меньше денег, чем аналогичный проект NIH (всего 300 миллионов долларов по сравнению с 3 миллиардами). После этого Вентер долгое время был «законодателем моды» в области молекулярной биологии, работая на переднем крае науки и пользуясь последними техническими разработками.

Следующей прорывной работой группы Вентера стало создание синтетического бактериального генома и успешное внедрение его в клетки бактерий в 2010 году [2], [3]. На это достижение у исследователей ушло 15 лет и 40 миллионов долларов. Но технический прогресс продолжает непрерывное движение вперед, и сегодня, всего 4 года спустя, этот результат Вентера уже не кажется столь недосягаемым. Недавно опубликованное в журнале Science исследование открывает новую страницу в синтетической биологии — создание «усовершенствованной» эукариотической синтетической хромосомы [4]. Команде исследователей, состоящей в основном из студентов, понадобилось шесть лет на разработку технологического подхода и синтез первой синтетической хромосомы эукариот. При этом, новое исследование не только знаменует важный шаг в молекулярной биологии, но и новый подход к фундаментальным исследованиям. Если при секвенировании генома Вентер доказал эффективность привлечения частных (а не только государственных) средств к фундаментальным исследованиям в биологии, то синтез дрожжевой хромосомы под руководством Джефа Боеке (Jef Boeke) подтвердил, что передовые исследования могут осуществляться не только мастистыми опытными профессионалами, но и молодыми исследователями-студентами.

Первый синтез эукариотической хромосомы

Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются эукариотами (так же, как человек и другие животные), и поэтому обладают гораздо более сложно устроенным геномом, чем бактерия Mycoplasma mycoides, геном которой был синтезирован командой Вентера [2], [3]. Синтетическая дрожжевая хромосома группы Боеке представляет собой несколько измененную третью хромосому из генома S. cerevisiae и составляет около 2,5% полного генома (состоящего из 12 миллионов пар нуклеотидов). Исследователи называют ее «дизайнерской» хромосомой synIII, т.к. они внесли в нуклеотидный состав хромосомы изменения, убрав некодирующие последовательности и добавив последовательности, необходимые для дальнейших исследований. Синтетический геном Mycoplasma mycoides, созданный группой Вентера, тоже содержал определенные изменения: несколько удаленных генов и «водяные знаки» — дополнительные последовательности ДНК, кодирующие имена главных участников проекта. При сборке дрожжевой хромосомы Боеке пошел дальше: своей целью он видел не просто синтез хромосомы «с нуля», но и внесение в нее изменений, которые помогу дальнейшим исследованиям. «Я не сомневался, что синтез хромосомы нам удастся, — говорит Боеке. — Главным вопросом было, как внести какие-то изменения в естественную структуру хромосомы, чтобы результат действительно стоил усилий» [5]. Для этого исследователи разработали особый генетический подход — SCRaMbLE, который позволяет вырезать из хромосомы отдельные гены и изучать влияние этих изменений на жизнедеятельность S. cerevisiae (см. врезку).

«Собери геном»

Джеф Боеке и его коллеги решили не только синтезировать с нуля дрожжевую хромосому, но и «усовершенствовать» её. В её синтетическом аналоге они удалили некоторые фрагменты ДНК (интроны, субтеломерные участки, транспозоны, гены тРНК и молчащие гены типов спаривания) и произвели оптимизацию кодонов (например, заменили стоп-кодон TAG на TAA). Шаблон синтетической хромосомы был разработан in silico (на компьютере), после чего его нужно было воплотить в реальную последовательность ДНК. Первоначально Боеке хотел заказать синтез полной хромосомы в коммерческой компании, но оказалось, что это слишком затратно как в финансовом отношении, так и по времени. Для синтеза цепочки ДНК длиной 90 тысяч пар нуклеотидов (треть длины третьей хромосомы S. cerevisiae), по оценке компании, потребовалось бы более года работы и 50 тысяч долларов.

Боеке стал обдумывать альтернативные стратегии для синтеза больших участков ДНК. Ему пришло в голову, что в университете учится немало студентов, мечтающих поучаствовать в настоящем исследовании. В 2007 году в Университете Джона Хопкинса в Балтиморе (США) состоялся первый курс под названием «Собери геном» (Build-a-genome [7]), который оказался очень популярным среди студентов и стал проводиться каждый семестр.

С заданиями курса может разобраться даже студент младших курсов. В течение семестра каждому выделяется отдельный участок ДНК, который необходимо синтезировать, а затем объединить вместе с другими участками и перенести в дрожжевую клетку с помощью гомологичной рекомбинации. Именно с помощью студентов, многие из которых стали соавторами Боеке в статье в журнале Science, и была собрана хромосома synIII.

Создание третьей хромосомы состояло из нескольких главных шагов (рис. 1). На первом этапе перекрывающиеся олигонуклеотидные фрагменты (из 60–79 пар нуклеотидов) собирались во фрагменты длиной 750 п.н. с помощью ПЦР и встраивались в плазмиды-переносчики. На втором этапе эти плазмиды переносили в клетки бактерий. Благодаря тому, что 750-нуклеотидные фрагменты имели перекрывающиеся последовательности, между плазмидами происходила гомологичная рекомбинация и сборка более крупных фрагментов в составе плазмиды-переносчика — от 2 до 4 тыс. п.н. На заключительном этапе плазмида-переносчик с крупным фрагментом помещалась в клетки дрожжей, где происходила гомологичная рекомбинация между естественной третьей хромосомой и фрагментом искусственной хромосомы в составе плазмиды. Таким образом, часть естественной хромосомы заменялась участком из synIII, а после нескольких повторений этой процедуры (а точнее, 11 повторений) вся третья хромосома представляла собой «дизайнерскую» последовательность синтетической хромосомы (рис. 2).

Несмотря на все изменения, внесенные учёными в последовательность ДНК третьей хромосомы, дрожжи продолжали расти и делиться так же, как и раньше. «Что поистине удивительно, так это то, что около 50 тыс. нуклеотидов из примерно 270 тыс. в „оригинальной“ хромосоме были изменены или удалены, но она по-прежнему работает», — делится своим восторгом Боеке [5]. Ученые тщательно исследовали модифицированный штамм дрожжей: проанализировали размер и скорость роста колоний и морфологию отдельных клеток при разных условиях выращивания. Никаких отличий по сравнению со штаммами дикого типа не было обнаружено. Анализ экспрессии генов так же не выявил никаких аномалий. Секвенирование synIII показало, что синтез искусственной хромосомы прошел почти идеально: хотя совсем избежать мутаций в ходе работы не удалось, ученые обнаружили в последовательности ДНК только 10 отклонений по сравнению с запланированной последовательностью, которые, однако, не привели к значительному искажению результата. Синтетическая хромосома оказалась также очень стабильной, к моменту публикации исследования она поддерживалась в 30 независимых дрожжевых колониях на протяжении как минимум 125 поколений.

Большие планы

У научной группы Боеке грандиозные планы дальнейших исследований, многие из которых связаны с созданием полного синтетического генома S. cerevisiae. При этом они предполагают, что в дрожжевой геном возможно внести гораздо более серьезные изменения, чем те, которые они осуществили в своем исследовании. «Наше исследование представляет собой один из миллиарда возможных вариантов дизайна геномов, и мы предполагаем, что дизайн синтетических хромосом станет новым способом для поиска ответов на многие специфические эволюционные и механистические вопросы о структуре и функциях генома», — отмечают Боеке и соавторы в своей статье в Science [4].

Чтобы синтезировать полный дрожжевой геном Боеке уже собрал группу единомышленников из разных стран, среди которых немало молодых ученых и студентов. Его курс «Собери геном» теперь проводится не только в нескольких университетах США, но так же в Лондоне и двух университетах в Китае. При этом новые университеты приглашают присоединиться в любой момент. Как отмечает Том Эллис, один из исследователей, вовлеченных в синтез 11-й хромосомы в Лондоне: «Этот подход демонстрирует ответ финансируемой государством фундаментальной науки тому, что сделал Вентер: нужно создать несколько лабораторий, позвать студентов, и они смогут сделать то же самое. Они тоже смогут собрать хромосому» [5].

Литература

1. Геном человека: как это было и как это будет;
2. Жизнь в эпоху синтетической жизни;
3. Элементы: «Создано первое живое существо с синтетическим геномом»;
4. N. Annaluru, H. Muller, L. A. Mitchell, S. Ramalingam, G. Stracquadanio, et. al.. (2014). Total Synthesis of a Functional Designer Eukaryotic Chromosome. Science. 344, 55-58;
5. Ewen Callaway. (2014). First synthetic yeast chromosome revealed. Nature;
6. Jessica Dymond, Jef Boeke. (2012). The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioengineered. 3, 170-173;
7. Eric M. Cooper, Helöise Müller, Srinivasan Chandrasegaran, Joel S. Bader, Jef D. Boeke. (2012). The Build-a-Genome Course. Methods in Molecular Biology. 273-283.