биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


От рака вылечит… верблюд!

[4 ноября, 2014 г.]

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Молекулярное биоразнообразие у позвоночных чрезвычайно велико. Однако недавнее открытие полнофункциональных антител сильно упрощенной структуры, существующих в природе в дополнение к традиционным антителам у представителей семейства Верблюдовых и некоторых хрящевых рыб, оказалось одним из важнейших сюрпризов молекулярной иммунологии последних 20 лет. Постоянное увеличение числа публикаций об этих антителах и потребность в технологиях их производства говорят о стремительно возрастающем интересе к этим уникальным молекулам.


Главный спонсор конкурса — дальновидная компания Генотек.
Конкурс поддержан ОАО «РВК».


Обратите внимание!

Эта работа представлена на конкурс научно-популярных статей «био/мол/текст»-2014 в номинации «Своя работа».


Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики. Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon. Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий.

Верблюды — одни из самых необычных животных нашей планеты. Все мы с детства знаем, что они способны жить в довольно-таки экстремальных условиях: ни одно другое животное не выжило бы в жаркой пустыне, питаясь одними лишь колючками и обходясь практически без воды. Внешне верблюды выглядят весьма своеобразно, однако и их «внутренний мир» не менее необычен. Во-первых, эритроциты верблюдов имеют овальную форму, что защищает их организм от обезвоживания (у всех остальных млекопитающих эритроциты круглые, что при обезвоживании приводит к «слипанию» друг с другом). Но есть у верблюдов и другая, не менее удивительная особенность, а именно — наличие особых антител. Именно этому и будет посвящён дальнейший рассказ.

Наши защитники — антитела

Что такое антитела? Это особые молекулы иммунной системы, имеющие гликопротеиновую природу, и способные распознавать чужеродные для организма структуры, такие как вирусы, бактерии, и другие потенциально вредные агенты, называемые одним словом — антигены [12]. При распознавании антигена антитела передают информацию о нём клеткам иммунной системы — лимфоцитам, — и те в свою очередь уничтожают вредоносный агент. У человека и у всех млекопитающих антитело — это структура, состоящая из двух тяжёлых и двух лёгких цепей. Антитела, обладающие такой структурой, называются классическими. Их тяжёлые и лёгкие цепи в свою очередь состоят из вариабельных (V) и константных (C) доменов. Тяжёлые цепи содержат один вариабельный (VH) и три константных домена (СH1, СH2, СH3), лёгкие цепи — один вариабельный (VL) и один константный (СL) домены (рис. 1). Именно такое строение обеспечивает способность антител узнавать конкретные антигены (это называется вариабельностью антител и осуществляется V-доменами) и взаимодействовать с клетками собственной иммунной системы (эффекторная функция антител; за неё ответственны C-домены).

Рисунок 1. Схема строения классического антитела. CH1, CH2, CH3 — константные домены тяжёлой цепи, СL — константный домен лёгкой цепи; VH — вариабельный домен тяжёлой цепи, VL — вариабельный домен лёгкой цепи. Вариабельные домены образуют антиген-распознающий фрагмент, а константные — эффекторный (связывающийся с лимфоцитами). Картинка из википедии с изменениями.

Рисунок 2. Схема строения верблюжьего антитела, HCAb. CH1, CH2 — константные домены. VHH — вариабельный домен. VHH сами по себе образуют наноантитела.

Молекулярный сюрприз

В 1993 году группа бельгийских учёных обнаружила в крови млекопитающих семейства Верблюдовых (верблюдов, лам, викуний и альпак) антитела, структура которых заметно отличалась от структуры вышеописанных классических антител [3]. Позднее подобные антитела были обнаружены также у некоторых видов акул и родственных им хрящевых рыб [4]. Поскольку казалось, что с травоядными млекопитающими работать всё же проще и безопаснее, чем с хищными рыбами, учёные решили взяться за основательное изучение именно верблюжьих антител. И сделали удивительное открытие: антитела, присутствующие в крови у Верблюдовых, имеют уникальную структуру — они состоят только из фрагмента одной укороченной тяжелой цепи, а лёгкие цепи у них отсутствуют (рис. 2).

Эти антитела были названы HCAb («heavy chain antibody»). Антиген-узнающий участок HCAb формируется лишь одним вариабельным доменом — VHH (Variable domain of the Heavy chain of the Heavychain antibody). Позднее учёные установили, что VHH — полностью функциональная молекула, которая способна распознавать и связывать антиген ничуть не хуже, чем вариабельные домены классических антител. Даже при их изоляции от константных доменов антитела они сохраняют способность связываться с антигенами так же, как и обычные антитела. Вдобавок к этому, они являются и самыми миниатюрными из всех известных белков с аналогичными свойствами. Их размер достигает примерно 2×4 нм. Поэтому этот фрагмент и получил название «наноантитело», «нанотело» или «мини-антитело».

«Мал да удал» — поговорка именно про нанотела. За счёт своих малых размеров эти антитела получают ряд преимуществ. В первую очередь, важно то, что они легко проникают в труднодоступные органы и ткани организма, куда классическим антителам проникнуть сложно или даже невозможно из-за их крупных размеров. Благодаря структурным особенностям, нанотела способны распознавать такие участки в антигенах, которые недоступны классическим антителам.

Важной особенностью является то, что наноантитела очень стабильны и не разрушаются ни при низких, ни при высоких температурах, ни при различных значениях pH. Их легче, проще и экономичнее синтезировать в больших количествах, что необходимо при производстве лекарств [5]. Также стоит отметить, что с наноантителами легко производить разнообразные генно-инженерные манипуляции, и то, что они практически не иммуногены (то есть не вызывают иммунного ответа). Итак, учёные поняли, что перед ними — мощный инструмент, который можно использовать в терапии и лечении множества заболеваний. Изучением верблюжьих наноантител занимается и наша Лаборатория молекулярных биотехнологий в Институте биологии гена РАН.


Нанотела по-русски

Итак, первое и самое главное условие — для того, чтобы получить уникальные наноантитела, нужен верблюд, в организме которого они будут синтезироваться. В 2004 году выбор пал на двугорбого верблюда (Camelus bactrianus), поскольку он является наиболее приспособленным к суровой русской зиме представителем семейства Верблюдовых. Далее начинается основная работа. В нашей лаборатории была отработана и усовершенствована следующая схема получения наноантител (рис. 3) [5]:


  • Иммунизация верблюда антигеном для того, чтобы вызвать образование конкретных антител.
  • Отбор крови животного. Примечание: ни одно животное при этом не пострадало! Потому что для дальнейших процедур достаточно взять всего 100 мл крови верблюда.
  • Клонирование последовательности генов наноантител из В-лимфоцитов, содержащихся в крови. Для этого выделяется РНК, и на её основе синтезируется комплементарная ДНК, а затем последовательности амплифицируются методом ПЦР.
  • Встраивание последовательностей наноантител в геном фага и отбор антител, специфических к необходимому антигену, методом фагового дисплея. Эта технология основана на встраивании чужеродных нуклеотидных последовательностей в один из генов, кодирующих белки оболочки бактериофага. Метод фагового дисплея позволяет «разместить» на поверхности бактериофага молекулу антитела, и таких вариантов получают множество. Методика заключается в следующем: бактериофаги, несущие миллионы различных фрагментов антител, наносят на колонку, содержащую нужный антиген. После отмывания ненужных фагов те, которые связывают данный антиген, снимают с колонки и размножают в бактериях. Нуклеотидная последовательность отобранных фагов может быть модифицирована, после чего мутированные фаги размножают в бактериях и повторяют процесс селекции [1].
    В нашей лаборатории была предложена модификация, повышающая эффективность отбора наноантител. Она носит универсальный характер и заключается в частичной делеции гена gIII фага M13, использование которого при соответствующих изменениях в процедуре приводит к значительному уменьшению фона и повышению эффективности процедуры селекции [6].
  • Анализ отбираемых клонов методом, предложенным в нашей лаборатории — методом параллельного рестрикционного анализа (фингерпринтинга) [7]. Этот метод позволяет лучше контролировать процесс селекции и частично заменяет секвенирование.

Рисунок 3. Схема получения библиотеки наноантител.

Рисунок 4. «Chromobody» — нанотело, связанное с красным флуоресцентным белком, RFP. Рисунок с сайта idw-online.de.

Верблюжьи наноантитела — на страже нашего здоровья

Область применения наноантител очень широка — это разные отрасли науки, биотехнологии и медицины. Была продемонстрирована возможность использования наноантител в качестве ингибиторов ферментов [8] за счёт их малого размера и способности проникать в каталитический центр. Также их можно использовать как аффинные лиганды [9], интратела [10], зонды в биосенсорах [11] и как инструмент изучения белок-белковых взаимодействий [12]. Благодаря своим малым размерам, наноантитела являются идеальными кандидатами для разработки небольших пептидомиметиков [13]. Наноантитела могут быть также использованы в пищевой промышленности, — например, при производстве сыра, поскольку способны предотвратить инфекцию молочнокислых бактерий фагом и ускорить брожение [14].

Сейчас стремительно развиваются методы оптической микроскопии, позволяющие исследовать такие биологические процессы как экспрессия белка, движение клеток, их локализацию и активность. В качестве инструмента визуализации этих процессов часто используют флуоресцентные белки. Эти белки после поглощения света определенной длины волны переизлучают его, но уже в более длинноволновом диапазоне [15]. Если объединить нанотело и флуоресцентный белок с помощью генно-инженерных методов, можно получить конструкцию, называемую «chromobody» (рис. 4) [10]. Подобный подход открывает принципиально новую возможность исследовать поведение антигенов в живых клетках.

Однако наиболее важная область применения наноантител — улучшение здоровья человека и животных. Особенно актуально их использование в профилактике и лечении раковых заболеваний. Область онкотерапии сейчас развивается бурными темпами. Например, одна из последних тенденций в терапии и лечении рака — применение специальных гликопротеинов лектинов [16]. Использование антител также является одним из новых и перспективных трендов в этой области. Можно синтезировать антитела, которые будут распознавать участки раковых клеток и прикрепляться к ним. За счёт этого опухоль станет более заметной и уязвимой для клеток иммунной системы. Для этих целей можно использовать классические антитела, однако наноантитела являются более удобными и эффективными, — опять же, благодаря малым размерам, поскольку для успешного лечения солидной опухоли прежде всего необходимо обеспечить доступ достаточного количества антител к различным её участкам [17].

Для этих целей как нельзя лучше подходят небольшие наноантитела. Они способны проникать в твердые опухоли более эффективно, чем более крупные классические антитела. Но и выводятся из организма они значительно быстрее, при этом успевая подействовать на опухоль [18]. Наноантитела можно использовать как эффективные тест-системы для диагностики рака. Было создано несколько нанотел, которые распознают человеческий простат-специфический антиген — молекулу, образующуюся при раке простаты у мужчин [19]. Эти нанотела определяют концентрацию простат-специфического антигена, за счёт чего можно установить, болен ли пациент, и предложить ему оптимальную схему лечения [11].

Еще одним из механизмов противоопухолевого действия антител является блокирование ими факторов роста, ускоряющих развитие раковых клеток. В норме эти вещества стимулируют деление и рост нормальных клеток. Однако действие факторов роста неспецифично, и они помогают злокачественным клеткам в том числе. В нашей лаборатории были получены наноантитела, специфичные к фактору роста эндотелия сосудов [19]. Блокирование взаимодействия этого фактора роста с рецептором опухолевой клетки предотвращает ангиогенный эффект, то есть вокруг опухоли не разрастается сеть кровеносных сосудов, и, не получая достаточного кровоснабжения, она перестаёт расти и метастазировать.

Наноантитела, помимо использования для диагностики и лечения рака, также можно применять и при других заболеваниях. Уже есть предварительные исследования, которые показывают, что с помощью нанотел можно лечить болезни Альцгеймера и Паркинсона, вызываемые «слипанием» белков. Нанотела способны не только предотвращать их агрегацию, но и, что более интересно, устранять уже существующие агрегаты [20].

Множество недавних исследований посвящено использованию наноантител для борьбы с вирусами и другими инфекциями [21]. В том числе, это изучается и в нашей лаборатории. Например, было показано, что введение мышам наноантител определённой конфигурации за 2 часа до или через 24 часа после инфицирования вирусом гриппа типа H5N2 защищает животных от летального исхода [22].

«Нет ничего более изобретательного, чем природа», — сказал Цицерон. Нет сомнений в том, что природа приготовила учёным ещё множество загадок. Одна из них — загадка о верблюжьих наноантителах — уже раскрыта. Сделано множество открытий, показывающих, что нанотела верблюда обладают поистине уникальными свойствами. В будущем наноантитела могут использоваться как эффективное дополнение к существующим подходам на основе моноклональных антител, так и в качестве самостоятельной технологии уникальных антиген-распознающих белков.

Рисунок 5. Верблюд — лекарь будущего. Источник: nationalgeographic.com.

Литература


  1. биомолекула: «Моноклональные антитела»;
  2. биомолекула: «Иммунологическая Нобелевская премия (2011)»;
  3. Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Bajyana Songa E., BendahmanN., Hamers R. (1993). Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363, 446–448;
  4. Greenberg A.S., Avila D., Hughes M., Hughes A., Mckinney E.C., Flajnik M.F. (1995). A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature 374, 168–173;
  5. Тиллиб С.В. (2011). «Верблюжьи наноантитела» — эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 45, 1–9;
  6. Вятчанин А.С., Тиллиб С.В. (2008). Модификации процедуры фагового дисплея для повышения эффективности селекции антиген—связывающих доменов особых одноцепочечных верблюжьих антител. Биотехнология 4, 32–34;
  7. Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. (2010). Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Acta Naturae 6, 100–108;
  8. Koch-Nolte F., Reyelt J., Schössow B., Schwarz N., Scheuplein F., Rothenburg S., Haag F., Alzogaray V., Cauerhff A., Goldbaum F.A. (2007). Single domain antibodies fromllama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo. FASEB J. 21, 3490–3498;
  9. Klooster R., Maassen B.T.H., Stam J.C., Hermans P.W., ten Haaft M.R., Detmers F.J.M., de Haard H.J., Post J.A., Verrips C.T. (2007). Improved anti-IgG and HSA affinity ligands: clinical application of VHH antibody technology. J. Immunol. Methods 324, 1–12;
  10. Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., Nowak D., Schermelleh L., Gahl A., Backman N., Conrath K., Muyldermans S., Cardoso M.C., Leonhardt H. (2006). Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nat. Methods 3, 887–889;
  11. Huang L., Reekmans G., Saerens D., Friedt J.M., Frederix F., Francis L., Muyldermans S., Campitelli A., Van Hoof C. (2005). Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron21, 483–490;
  12. Huang Y., Verheesen P., Roussis A., Frankhuizen W., Ginjaar J., Haldane F., Laval S., Anderson L.V.B., Verrips T., Frants R.R. et al. (2005). Protein studies in dysferlinopathy patients using llama-derived antibody fragments selected by phage display. Eur. J. Hum. Genet13, 721–730;
  13. Marquardt A., Muyldermans S., Przybylski M. (2006). A synthetic camel anti-lysozyme peptide antibody (peptibody) with flexible loop structure identified by high-resolution affinity mass spectrometry. Chem. Eur. J. 12, 1915–1923;
  14. Ledeboer A.M., Bezemer S., de Haard J.J.W., Schaffers I.M., Verrips C.T., van Vliet C., Düsterhöft E.-M., Zoon P., Moineau S., Frenken L.G.J. (2002). Preventing phage lysis of Lactococcus lactis in cheese production using a neutralizing heavy-chain antibody fragment from llama. J. Dairy Sci85, 1376–1382;
  15. биомолекула: «Флуоресцентные репортёры и их молекулярные репортажи»;
  16. биомолекула: «Лектины — новые инструменты в диагностике и терапии злокачественных опухолей»;
  17. Tunggal J.K., Cowan D.S., Shaikh H., Tannock I.F. (1999). Penetration of anticancer drugs through solid tissue: a factor that limits the effectiveness of chemotherapy for solid tumors. Clin. Cancer Res. 5, 1583–1586;
  18. Milenic D.E., Yokota T., Filpula D.R., Finkelman M.A., Dodd S.W., Wood J.F., Whitlow M., Snoy P., Schlom J. (1991). Construction, binding properties, metabolism, and tumor targeting of a single-chain Fv derived from the pancarcinoma monoclonal antibody CC49. Cancer Res. 51, 6363–6371;
  19. Tillib S.V., Ivanova T.I., Lyssuk E.Y., Larin S.S., Kibardin A.V., Korobko E.V., Vikhreva P.N., Gnuchev N.V., Georgiev G.P., Korobko I.V. (2012). Nanoantibodies for detection and blocking of bioactivity of human vascular endothelial growth factor A (165). Biochemistry 77, 659–665;
  20. Dumoulin M., Last A.M., Desmyter A., Decanniere K., Canet D., Larsson G., Spencer A., Archer D.B., Sasse J., Muyldermans S. et al. (2003). A camelid antibody fragment inhibits the formation of amyloid fibrils human lysozyme. Nature 424, 783–788;
  21. Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J., et al. (2009). Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med. Microbiol. Immunol. 198, 157–174;
  22. Tillib S., Ivanova T.I., Vasilev L.A., Rutovskaya M.V., Saakyan S.A., Gribova I.Y., Tutykhina I.L., Sedova E.S., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. (2013). Formatted single-domain antibodies can protect mice against infection with influenza virus (H5N2). Antiviral Research 97, 245–254.

Автор: Горяйнова Оксана.

Число просмотров: 1246.

Creative Commons License — условия использования и распространения материалов сайта.
Вернуться в раздел «Медицина»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Re: От рака вылечит… верблюд!

Андрей — 6 ноября, 2014 г. 08:19. (ссылка) (свернуть ветвь)

И все таки: насколько реже верблюды болеют раком, благодаря этим замечательным антителам?

(ответить)

Re: От рака вылечит… верблюд!

Горяйнова Оксана — 8 ноября, 2014 г. 18:56. (ссылка)

Андрей, к сожалению, данных о статистике заболеваемости верблюдов раком у меня нет. Но в принципе наличие антител ещё не означает, что в организме не может развиться опухоль. Вообще, любые антитела начинают представлять интерес после проведения над ними каких-либо генно-инженерных манипуляций. Целенаправленно можно получить антитела с заданными свойствами и заданной специфичностью именно к тому антигену, который нас интересует (например, к раковым клеткам). И потом уже работать с ними. Наноантитело, полученное из верблюда, - как раз-таки удобный инструмент для этого, поскольку у него совсем небольшой размер и относительно простая структура. Поэтому различные генно-инженерные манипуляции над ним проводить проще, чем над обычным классическим антителом.

(ответить)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.