биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


Мобильные генетические элементы прокариот: стратификация «общества» бродяжек и домоседов

[8 ноября, 2014 г.]

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Мобильные элементы генома прокариот обсуждаются в отечественных научных и научно-популярных изданиях незаслуженно редко. Однако именно эти агенты распространяют в популяциях микроорганизмов устойчивость к физическим и химическим факторам, в том числе ультрафиолету и антибиотикам. Или дарят приютившим их клеткам селективные преимущества, кодируя метаболические пути и факторы патогенности. Эти «путешественники» преодолевают не только межклеточные и межвидовые границы, но даже междоменные, перетаскивая с собой внушительный багаж ценной генетической информации. Прокариотический мобилом поразительно мозаичен, сложно стратифицирован и напоминает своеобразный «парк юрского периода», предоставляя возможность исследовать ранние этапы эволюции механизмов наследственности и изменчивости.


Главный спонсор конкурса — дальновидная компания Генотек.
Конкурс поддержан ОАО «РВК».


Обратите внимание!

Эта работа представлена на конкурс научно-популярных статей «био/мол/текст»-2014 в номинации «Биоинформатика и молекулярная эволюция».


Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики. Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon. Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий.

Организмы и геномы можно таким образом расценивать как секции биосферы, по которым гены глобально циркулируют с различной интенсивностью, и в которые персональные гены и опероны могут включаться, если они предоставляют достаточные преимущества...

K. Jeon и J. Danielli [1].

Характерная, но не уникальная, особенность прокариотических организмов (бактерий и архей) — способность передавать наследственную информацию не только «вертикально» (от предков к потомкам), но и активно обмениваться ею «горизонтально» (между «соседями») — путем конъюгации, трансформации и трансдукции. Горизонтальный генетический перенос (ГГП) может происходить между прокариотическими, эукариотическими и даже между прокариотическими и эукариотическими клетками, а также в пределах одной клетки. В настоящее время ГГП признан одним из основных механизмов адаптивной эволюции [2].

ГГП осуществляют мобильные генетические элементы (МГЭ)* — чрезвычайно пёстрая группа «мигрантов» с различной склонностью к оседлости, в которую входят вирусы, плазмиды, транспозоны, интегроны, геномные острова и др. Революционные темпы развития молекулярно-биологического инструментария и пополнения баз «прочитанных» нуклеотидных последовательностей способствовали открытию удивительного мира МГЭ, или мобилома. Оказалось, что в геномах бактерий эти «бродяги» не только не являются маргиналами, но и выстроили сложную иерархию. И не так их легко различить. Основной виновник этого — всё тот же ГГП, предоставляющий неисчерпаемые возможности для генетической изменчивости. В результате наследственный материал организован модульно (рис. 1) и подобно матрёшке: МГЭ меньшего размера входят в состав более крупных и т.д. И не все они легки на подъём — иногда им нужны приличные стрессы или помощь товарища. Они часто путешествуют в другие клетки «зайцами», эксплуатируя элементы более высокого ранга. А могут и предательски обездвиживать друг друга. Итак, рассмотрим основные группы прокариотического «мобильного социума».

* — Несколько более простых для восприятия и более коротких историй о мобильных элементах «биомолекула» уже публиковала, так что неподготовленным читателям, возможно, стóит обратиться к ним: «Геном человека: полезная книга, или глянцевый журнал?», «Alu: история одной последовательности», «Тайны „молекулярных паразитов“, или Как путешествовать по геному», «Разнообразия много не бывает: чем занимаются мобильные элементы генома в мозге». — Ред.

Рисунок 1. Мозаичная структура мобилизуемых и конъюгативных генетических элементов. В пунктирном круге приведены МГЭ (плазмиды, фаги, транспозоны), предоставляющие функциональные модули (указаны под чертой). Чёрные треугольники в функциональных модулях «заякоренного» геномного острова обозначают существование мутантных, нефункциональных форм этих модулей. Рисунок из [3].

Основные сокращения

  • МГЭ — мобильные генетические элементы
  • ГГП — горизонтальный генетический перенос
  • ОРС — открытая рамка считывания, последовательность нуклеотидов между инициирующим и терминирующим кодонами гена
  • ori T — место начала переноса цепи плазмидной ДНК при мобилизации
  • ori V — место начала репликации (копирования, воспроизводства) плазмидной ДНК
  • rep — ген белка-инициатора репликации многих бактериальных плазмид

Вирусы: суперпаразиты и помощники

Вирусы (в т.ч. бактериофаги) и вироиды — субклеточные инфекционные агенты, которые могут воспроизводиться только внутри живых клеток («переключают» на собственное воспроизведение системы экспрессии наследственной информации клеток-хозяев), а вне клеток ведут себя как органические полимеры. Здесь я немного отклонюсь от прокариотических перипетий — уж очень интересны недавние открытия в мобиломе эукариот и даже вирусов.

Вироиды представляют собой кольцевые одноцепочечные РНК всего из нескольких сотен нуклеотидов, реплицируемые клеточной РНК-полимеразой. Они не содержат открытой рамки считывания (ОРС). Предполагается, что вироиды — это «сбежавшие интроны» (вырезанные при сплайсинге незначащие участки мРНК, приобретшие способность к репликации) или же представители добиотического «мира РНК»*, эволюционные реликты. Вирусы, в отличие от вироидов, — молекулы РНК или ДНК, покрытые как минимум одной оболочкой — белковым капсидом.

* — «Мир РНК» — это гипотетический сценарий возникновения жизни на Земле, в основе которого лежит предположение о том, что исходно жизнь была основана только на молекулах РНК, а не ДНК или белках: «РНК у истоков жизни?». — Ред.

Вирусы паразитируют в клетках всех известных доменов — Eukarya, Archaea и Bacteria. Недавно был обнаружен ДНК-содержащий вирус «Спутник», паразитирующий на гигантском (различим с помощью светового микроскопа) мимивирусе акантамёбы (APMV) и названный по аналогии с бактериофагами вирофагом [4]*. Вирофаг способен размножаться только при коинфицировании клетки амёбы мимивирусом, используя его «фабрику воспроизводства» и вызывая образование абортивных форм или патологически измененных капсидов APMV (рис. 2). ДНК «Спутника» — химера, совмещающая гены, заимствованные как у APMV, так и вирусов архей и неохарактеризованных морских вирусов.

* — Захватывающая история открытия вирусов вирусов рассказана в статье «...А на блохе — блошиночка поменьше». — Ред.

Рисунок 2. Частицы вирофага «Спутник» в мимивирусе [5].

В 2011 году были описаны еще 2 вирофага — OLV (Organic Lake Virophage) и Mavirus (Maverick Virus), причем множественные генетические параллели между Мавирусом и МП-транспозонами (гигантские транспозоны эукариот типа Maverick/Polinton) позволили предположить, что они эволюционировали от общего предка [6]. Отбор способствовал широкому распространению вирофага в клетках, поскольку паразитизм по отношению к гигантским вирусам повышал выживаемость инфицированных ими клеток, а приобретенная ретровирусная интеграза повышала шансы «закрепиться» в эукариотической клетке и трансформироваться в МП-транспозон.

В 2012 году охарактеризовали интегрированную в ДНК мимивирусов форму вирофага и даже новый класс МГЭ — трансповироны, способные встраиваться в ДНК и мимимирусов, и вирофагов [7]. Подобно бактериофагам, переносящим гены от одних бактерий к другим, вирофаги могут играть важную роль в ГГП между разными группами вирусов и их хозяевами.

Бактериофаги за счёт собственных тирозиновых рекомбиназ (интеграз) способны существовать в интегрированном (чаще в хромосому) состоянии — в форме профага. Однако при вырезании профага могут захватываться и упаковываться в вирусные «головки» фрагменты ДНК хозяина, которые в дальнейшем трансдуцируются в новые клетки и вместе с фаговой ДНК часто становятся «плацдармом» для рекомбинационных событий. Профаговая ДНК в некоторых случаях может составлять до 16% бактериального генома, причём постоянный обмен функциональными модулями между профагами, инфицировавшими одну клетку, приводит к формированию химерных фагов (P22 из Salmonella), а часто — к утрате способности к вырезанию и перманентному участию в эволюции бактериального генома.

Многие профаги кодируют факторы вирулентности, трансформируя нетоксигенные бактерии в агентов-убийц: профаг CTXphi из Vibrio cholerae кодирует холерный токсин, а упомянутый выше P22 — ферменты конверсии О-антигена сальмонеллы, позволяя ей уходить от иммунного надзора.

В составе фагов обнаруживают другие МГЭ (например, транспозоны, несущие гены антибиотикорезистентности) и их модули (системы репликации и переноса конъюгативных плазмид). Самый известный пример слияния модулей фагового и плазмидного происхождения — фаг Р1, способный реплицироваться и длительно поддерживаться вне хромосомы, ничем не отличаясь от плазмиды. Профаги разных бактерий детально рассмотрены в обзоре [8].

Плазмиды — маленькие гиганты больших процессов

Плазмиды — внехромосомные двуцепочечные молекулы ДНК, способные к длительному автономному существованию в клетках прокариот и некоторых эукариот. Чаще всего плазмидные ДНК суперскручены и ковалентно замкнуты в кольцо, однако у актиномицетов и спирохет встречаются и линейные формы, что обычно сочетается с линейной организацией хромосом. Размер плазмид обычно варьирует от 0,85 т.п.н. (pRKU1 из Thermotoga petrophila) до 600 т.п.н., но у бруцелл и ризобий описаны мегаплазмиды размером более 1 млн п.н., что иногда делает вопрос их дифференцировки от дополнительных хромосом риторическим [9]. Элиминация мегаплазмид, в отличие от хромосом, обычно не вызывает фатальных для бактериальной клетки последствий, однако вместе с плазмидами могут утратиться такие важные функции, как способность к фиксации азота и формированию симбиотических клубеньков (у ризобий).

На долю плазмидной ДНК может приходиться 1–15% наследственной информации бактериальной клетки, однако известны случаи, когда плазмидами контролируется до 25% (у некоторых Archaea) и даже до 40% информации (2 мегаплазмиды размером около 1,4 и 1,6 млн п.н. у Sinorhizobium meliloti).

Не являясь обязательными элементами генома, плазмиды обеспечивают селективное преимущество содержащим их микроорганизмам при освоении различных экологических ниш. При стабильном поддержании в клетке они «даруют» хозяину устойчивость к антибиотикам (R-плазмиды), солям тяжёлых металлов, ультрафиолетовому облучению, кодируют факторы патогенности, пути биосинтеза антибиотиков и бактериоцинов, системы рестрикции-модификации, симбиотические факторы, пути деградации органических и неорганических соединений (D-плазмиды), фиксации атмосферного азота [2]. Недавно показано, что некоторые плазмиды, кодируя специфические регуляторы транскрипции (AraC-, H-NS-типов и др.), могут изменять экспрессию и хозяйских генов.

Участие плазмид в ГГП обусловлено свойствами плазмидного «остова», в состав которого входят области, обеспечивающие инициацию репликации (rep-oriV, иногда — cop), стабильное наследование (у многих плазмид за это отвечают локусы par и mrs, системы постсегрегационной гибели бесплазмидных клеток), а также кластеры, обеспечивающие миграцию плазмид — системы мобилизации и конъюгации (mob, tra). Плазмиды классифицируют по размеру, копийности, кодируемым фенотипическим признакам и т.д., однако филогенетически обоснована только классификация по группам несовместимости на основе гомологии области rep-oriV.

Плазмидами часто мобилизуются сосуществующие с ними в одной клетке неконъюгативные МГЭ (но обладающие как минимум сайтом начала переноса oriT, а чаще и генами mob) и даже хромосомы. Мобилизация генов хромосомы возможна в случае интеграции в неё конъюгативной плазмиды. Это возможно, когда в обеих молекулах присутствуют одинаковые инсерционные последовательности (IS-элементы), обеспечивающие гомологичную рекомбинацию (типичный пример — F-фактор E.coli). Однако интеграция может быть и RecA-независимой, если плазмида кодирует тирозиновую интегразу (плазмиды стрептомицетов pSE101, pSAM2 и псевдомонад pKLK106). В этом случае интеграция чаще происходит в гены тРНК, но в некоторых хозяевах эта закономерность нарушается [3].

Плазмиды служат донорами функциональных модулей для других МГЭ (рис. 1), в результате чего формируются сложные мобильные мозаичные конструкции, осваивающие новые геномы. Плазмидные репликоны — «каркасы» многочисленных векторных систем и прекрасные модели для изучения механизмов экспрессии наследственной информации.

Транспозоны — универсальные генетические челноки

Транспозоны — МГЭ, перемещающиеся как в пределах одной молекулы ДНК, так и между разными репликонами одного генома (конъюгативные транспозоны — и между геномами). Фланкированы инвертированными повторами, а в центральной части содержат гены, ответственные за перемещение. Транспозоны прокариот подразделяют на IS-элементы, Tn-элементы и Mu-подобные фаги [10].


  • IS-элементы — инсерционные последовательности длиной 700–1800 п.н., содержащие ОРС одного-двух белков, необходимых для перемещения (в частности, ген рекомбиназы/транспозазы), а также промотор транскрипции. IS-элементы ограничены короткими инвертированными концевыми повторами (10–40 п.н.) и обычно фланкированы прямыми повторами (2–12 п.н.), возникающими из-за удвоения ДНК-мишени в области интеграции элемента. Несмотря на то, что IS-элементы не кодируют каких-либо фенотипических признаков, их внедрение часто вызывает инсерционные мутации или же изменяет экспрессию генов в непосредственной близости от места внедрения. Внедрение двух копий IS-элемента на небольшом расстоянии друг от друга может вызывать делеции заключённого между ними наследственного материала, а присутствие копии в составе другого репликона может вести к образованию коинтегратов этих репликонов (гомологичной рекомбинации). IS-элементы очень широко представлены в хромосомах и МГЭ.
  • Tn-элементы (собственно транспозоны) помимо генов, ответственных за перемещение, несут детерминанты устойчивости к тяжёлым металлам, антибиотикам, УФ, гены факторов патогенности, ферментов утилизации ксенобиотиков и т.п. «Начинка» фланкирована инвертированными повторами из 35–48 п.н. (у Tn3-семейства) или двумя идентичными IS-элементами в прямой или обратной ориентации (составные транспозоны, например, Tn5 и Tn10); как и в случае IS-элементов, характерно удвоение ДНК-мишени (небольшие прямые повторы). Транспозоны, как правило, внедряются в плазмидную и хромосомную ДНК, используя репликативный (копия — и в доноре, и в реципиенте) или консервативный (вырезание из донора — встраивание в реципиент) механизмы транспозиции, опосредованные собственной транспозазой (TnpA), а в случае Tn3-семейства — и резолвазой (TnpR), разрешающей формирующиеся при транспозиции коинтеграты. В составных транспозонах за перемещение отвечает транспозаза, кодируемая лишь одним IS-элементом, второй элемент обычно дефектен. Внедрение транспозонов, как и IS-элементов, оказывает мутагенное и рекомбиногенное действие на ДНК-мишень [10].
    Многие Tn-элементы могут автономно перемещаться не только в пределах одного генома, встраиваясь в случайные места, но и между бактериями. Конъюгативные транспозоны обладают собственным (видимо, плазмидного происхождения) tra-опероном. В отличие от классических транспозонов, использующих при интеграции сериновую рекомбиназу (резолвазу/инвертазу) или DD-E-рекомбиназу (транспозазу), конъюгативные транспозоны (Tn916 из Enterococcus faecalis, Tn5253 из Streptococcus pneumoniae, CTnDOT из Bacteroides) «приручили» подобную λ-фаговой тирозиновую рекомбиназу (специфичность интеграции зависит от хозяина). Описаны также мобилизуемые транспозоны, содержащие ген рекомбиназы, oriT и mob-систему (Non-replicating Bacteroides Units — NBU1 и NBU2, Tn4555, Tn4451, Tn4453) или только oriT (Tn5398) и использующие аппарат переноса конъюгативных плазмид или других транспозонов [3].
  • Mu-подобные фаги — умеренные бактериофаги γ-протеобактерий, сложнейшие транспозоны, которые помимо генов транспозиции/интеграции несут детерминанты сборки фаговых частиц и имеют внеклеточную форму существования. При первичной интеграции в геном инфицированной клетки используют механизм консервативной транспозиции, а при переходе из лизогенной стадии (профага) к литической — репликативную транспозицию.
    Интеграция фага Mu происходит в случайные сайты, провоцируя инсерционный мутагенез, с дупликацией 5 п.н. ДНК-мишени. При развитии литического сценария множественные копии фага вызывают фрагментацию хромосомы, что способствует упаковке в фаговые капсиды и последующей трансдукции не только вирусной ДНК, но и ближайших фрагментов ДНК-мишени. Иногда фрагменты хромосомы при упаковке в капсид полностью заменяют фаговую ДНК [11].

Интегроны — природные системы клонирования и экспрессии

Интегроны представляют собой «заякоренные» в транспозонах, плазмидах и хромосомах «платформы», включающие ген intI тирозиновой рекомбиназы (интегразы), промотор и сайт интеграции attI для «улавливаемых» генных кассет — ДНК-сегментов, содержащих только беспромоторную ОРС с уникальным рекомбинационным сайтом attC (рис. 3, а).

В процессе перемещения от одного интегрона к другому или от одного сайта в интегроне к другому сайту, генная кассета существует как автономная и неспособная к репликации двунитевая кольцевая молекула ДНК. Кассеты, захватываемые интегронами и суперинтегронами, могут содержать гены факторов патогенности, метаболических путей, детерминанты антибиотико- и дезинфектантоустойчивости или гены рестрикционных ферментов. Интеграза IntI катализирует сайт-специфическую рекомбинацию между сайтами attI и attC, в результате чего происходит интеграция или вырезание кассеты. Множество событий интеграции ведет к образованию мультикассетных рядов, в которых все кассеты фланкированы attC-сайтами. Известны хромосомные суперинтегроны, включающие до 179 генных кассет (у Vibrio cholerae), однако среди клинически значимых бактерий большинство интегронов содержит до 5–8 генных кассет. Наиболее эффективно экспрессируются кассеты, расположенные ближе к промотору, но изменение селективного давления может способствовать перестройкам в составе интегрона.

Рисунок 3. Интегрон — ДНК, улавливающая генные кассеты и распространяемая в составе более высокоорганизованных МГЭ. а — Структура интегрона класса 1. Pint — промотор интегразы, Pant — промотор кассет антибиотикорезистентности. Остальные элементы объяснены в тексте; б — Иерархическая организация МГЭ. Рисунок скомбинирован на основе [9] и [12].

Все интегроны, несущие кассеты антибиотикорезистентности, разделяют на 5 классов на основании гомологии последовательностей кодируемых ими интеграз. Большинство интегронов антибиотикорезистентности относится к классу 1 (часто ассоциированы с Tn21-семейством). Они включают два концевых невариабельных региона, называемых константными последовательностями (constant sequences, CS), и высоковариабельный центральный участок. В одном конце интегрона (5’-CS), обычно находятся intI, attI и промотор, от которого экспрессируются гены кассеты. В другом конце (3’-CS), находится часть гена qacEΔ1, который, будучи интактным, несёт устойчивость к четвертичным аммониевым соединениям. За ним расположен ген sul, определяющий резистентность микроорганизма к сульфаниламидам, и 1–2 гена с неустановленной функцией — orf5 и иногда orf6 (рис. 3, а). Интегроны класса 2 ассоциированы с Tn7-семейством, классов 3 и 5 — с плазмидами, класса 4 — с конъюгативным геномным островом SXT Vibrio cholerae.

Не являясь «самораспространяемыми» элементами, интегроны активно переносятся в бактериальных популяциях за счёт МГЭ, в которых они локализованы (рис. 3, б), подвергаются рекомбинации (известны химерные интегроны из модулей разных классов), деградации, «улавливают» новые кассеты, причем функции огромного числа кассет до сих пор не известны [13].

Геномные острова — «пластилин» для эволюционного процесса

Геномные острова (genomic islands, ГО) — сегменты ДНК, присутствующие в геноме одних штаммов и отсутствующие у других, даже близкородственных штаммов одного вида. Строение «усредненного» ГО показано на рис. 4. Для геномных островов характерно:


  • Размеры 10–500 т.п.н. (менее 10 т.п.н. — геномные островки (genomic islets));
  • Отличные от ДНК-мишени нуклеотидные характеристики: G+C состав, частоты тетрануклеотидов и использование кодонов;
  • Несут ген тирозиновой рекомбиназы (интегразы), обеспечивающей встраивание ГО в специфические районы хромосомы — гены тРНК, ген prfC у E. coli (для ГО SXT и R391). Именно избирательное встраивание ГО в 1–2 сайта хромосомы иногда помогает отличить его от «непривередливых» к месту интеграции конъюгативных транспозонов [3]. Иногда ГО не содержат или утратили ген интегразы, в результате чего оказались «заякоренными» в хромосоме хозяина. Пример такого острова — SGI1, «подаривший» штамму Salmonella enterica sv. Typhimurium DT104 множественную устойчивость к антибиотикам. Похоже, до утраты рекомбиназы этот ГО был интегративной конъюгативной плазмидой;
  • Часто фланкированы 16—20-п.н. повторами ДНК-мишени, которые могут использоваться для вырезания острова. Для вырезания иногда требуется помощь собственного фермента эксцизионазы или помощь инфицировавшего клетку бактериофага. Для острова SaPI1 из Staphylococcus aureus показана мобилизация фагами 80α и φ13, причём вырезанная ДНК ГО встраивалась в новые места генома или, реплицируясь, конкурировала с фаговой ДНК за включение в фаговый капсид и переносилась путем трансдукции в другие клетки;
  • Часто содержат IS-элементы и транспозоны, участвующие в приобретении или устранении генетической информации в пределах острова, причем рекомбиназы этих МГЭ могут использоваться и для интеграции/вырезания целого острова, например, ГО, обнаруженных на плазмидах pXO1 Bacillus anthracis и p33071 Rhodococcus equi [3];
  • Играют важную роль в эволюции и адаптации бактерий к изменяющимся условиям среды обитания, кодируя факторы патогенности, симбиотического «стиля жизни», резистентности к тяжёлым металлам и антибиотикам, ферменты деградации ксенобиотиков и т.п. Считается, что ГО обеспечивают «эволюцию квантового скачка», драматически меняя фенотип хозяина, например, с непатогенного на патогенный или с несимбиотического на симбиотический. Предполагается, что развитие паразитического способа существования у изначально сапротрофных свободноживущих микобактерий происходило с участием ГО. Именно на ГО Rv0986 локализованы гены, кодирующие способность M. tuberculosis прикрепляться к эукариотическим клеткам [14].

Рисунок 4. Схематическое изображение структуры геномного острова в составе бактериальной хромосомы [14]. DR — прямые повторы ДНК хромосомы, фланкирующие ГО; IS — инсерционные элементы.

Недавно у штаммов клона С Pseudomonas aeruginosa был обнаружен ГО — pKLC102 (103,5 т.п.н.) — плазмидно-фаговый гибрид, предположительно несущий детерминанты патогенности, способный существовать как в интегрированном в хромосому состоянии, так и в форме автономной плазмиды [15]. Различные ОРС pKLC102 гомологичны типичным генам бактерий, ассоциированных с ризосферой растений, что может указывать на эволюционирование этого ГО в соответствующих микробных сообществах. У некоторых штаммов клона С, выделенных из лёгких больных муковисцидозом, этот ГО был необратимо «заякорен» в хромосоме из-за внедрения в него транспозона TNCP23 (химера из IS6100, интегрона класса 1 и плазмиды), что вело и к крупным хромосомным инверсиям. Внедрению транспозона, несущего интегрон с кассетой устойчивости к аминогликозидам, видимо, способствует лечение больных муковисцидозом соответствующими антибиотиками.

Геномные острова гонококков (GGI) кодируют систему секреции типа IV (T4SS), родственную плазмидным системам конъюгационного переноса. Посредством T4SS распространяется не только сам элемент и его продукты, но секретируется в окружающую среду и хромосома Neisseria gonorrhoeae, которая затем может трансформировать другие бактерии и участвовать в рекомбинационных событиях.

Помимо островов патогенности огромный интерес представляют «экологические» острова β- и γ-протеобактерий, многие из которых конъюгативны и кодируют ферменты биодеградации хлорированных и нитроароматических соединений. В частности, clc-элемент из Pseudomonas sp. B13 несёт amn-кластер биодеградации аминофенола.

Эксцизия, а, следовательно, и распространение ГО, строго регулируется. Часто это происходит под quorum-sensing-контролем («чувством кворума») в стационарной фазе бактериального роста. Мобилизация многих ГО происходит в результате SOS-ответа на повреждения ДНК, вызванные антибиотиками (SXT-элемент V. cholerae, способный мобилизовать и «приютившую» его ДНК) или другими факторами среды [14].

Главные нарушители границ и их мекка

Крупнейшие из самых подвижных «платформ» для сборки всевозможных мобильных элементов и модулей — плазмиды и бактериофаги, но последние обычно имеют очень ограниченный круг хозяев. Плазмиды — более широко представленный и разнообразный МГЭ прокариотического мира, поскольку этот элемент способен преодолевать не только межвидовые барьеры, но и междоменные (энциклопедический пример — Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens, инфицирующие эукариотические клетки). Плазмидные модули входят в состав конъюгативных транспозонов и геномных островов (рис. 1), а в самих плазмидах находят приют IS-элементы, транспозоны, интегроны, фаговые модули и даже геномные острова. Оказалось, что влияния ГГП не избежали и внутриклеточные паразиты, которые, считалось, должны быть изолированы от потенциальных доноров ДНК: конъюгативные плазмиды, причастные к вирулентности, обнаружены у Rickettsia felis, как найдены плазмиды и у внутриклеточной бактерии Buchnera — эндосимбионта тли.

Можно выделить несколько «горячих точек» ГГП: ризосфера растений, биоплёнки, разлагающиеся материалы, клетки простейших (жизнеспособные Chlamydiae и Rickettsia обнаружены в амёбах) [16]. Всё перечисленное можно встретить в отстойниках (станциях очистки воды), где смешиваются сточные воды различного происхождения, в т.ч. больничные и фармпроизводств, обеспечивающие селективное давление для обмена МГЭ в условиях высокой бактериальной плотности и метаболической активности. Процесс трансформации клеток молекулами ДНК происходит в среде постоянно. Свободная ДНК может сохраняться в окружающей среде тысячелетиями, а природной компетентностью обладает как минимум 90 видов почвенных и водных прокариот. Однако ведущую роль в распространении между бактериями детерминант резистентности и биодеградации играют конъюгативные и мобилизуемые плазмиды.

Из обитателей отстойников, а что самое опасное — из бактерий вод, уже прошедших очистку, — в большом количестве выделяют плазмиды IncP-1-группы несовместимости (в системе классификации плазмид псевдомонад) [12]. Эти относительно небольшие молекулы дарят хозяевам массу селективных преимуществ (от множественной резистентности до биодеградации хлорорганики) и способны распространяться не только среди псевдомонад, но и практически всех грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий. Кроме того, они способны мобилизовать неконъюгативные R-плазмиды (например, IncP-4) к переносу в ещё более широкий спектр бактерий, а также в дрожжи и клеточные линии млекопитающих [17].

Селективное давление, оказываемое присутствием в сточных водах как лекарств, так и нефтепродуктов, тяжёлых металлов и сурфактантов, стабилизирует соответствующую плазмидную ДНК в бактериальных популяциях отстойников. Интересно, что возможна неспецифическая, «побочная», селекция R- и D-плазмид присутствием тяжёлых металлов, устойчивость к которым часто кодируется плазмидами этих двух типов. Возможна и селекция R-плазмид присутствием в среде детергентов, содержащих четвертичные аммонии: детерминанты антибиотикорезистентности и ген qacEΔ1 часто «соседствуют» в плазмидных интегронах. Кроме того, кодируемые R-плазмидами эффлюкс-помпы бактерии используют не только для выброса поступающих в клетку антибиотиков, но и для транспортировки других соединений, поэтому даже при отсутствии в среде антибиотиков соответствующие плазмиды могут оказаться полезными и стабильно поддерживаться в бактериальных популяциях. Отстойники, по сути, служат котлами по переплавке геномов, где под множественным селективным давлением происходит обмен наследственной информацией между патогенными и сапротрофными микроорганизмами, отбор оптимальных комбинаций генов, которым ничто не мешает распространяться за пределами очистных сооружений. И именно плазмиды играют важнейшую роль в поддержании бактериального «коммунального генетического пула» [9].

Биология плазмид в России и за рубежом. Что же можно возвести на крепком фундаменте?

Несмотря на колоссальный вклад плазмид в распространение бактериальной резистентности, в биодеградативный потенциал среды, в эволюцию геномов и биотехнологию, заниматься изучением этих молекул в России теперь не модно. Показательно, что в огромной стране работает всего одна (!) лаборатория, специализирующаяся на биологии плазмид (ИБФМ РАН, г. Пущино). Особо неблагодарное дело — исследовать не антибиотикорезистентность, практическая значимость которой так очевидна, а фундаментальные процессы — репликацию, сегрегацию, конъюгацию. Но именно эти процессы позволяют исследователю заглянуть в «эволюционные ясли» механизмов наследственности, лежат в основе классификации плазмид и определяют возможность поддержания клинически/биотехнологически важных признаков в конкретной бактериальной популяции.

Как же относятся к плазмидам зарубежные биологи? Статьи коллективов из Японии, Германии и Испании, посвящённые структуре и функционированию внехромосомных ДНК бактерий, регулярно появляются на страницах таких авторитетных изданий, как Nature, Journal of Bacteriology, EMBO и др. В последние годы признанных экспертов в области биологии плазмид «догнали» учёные из США, Китая, Польши, Белоруссии.

Как и в любой другой науке, практически и мировоззренчески ценные открытия в биологии плазмид опираются на возводимый десятилетиями теоретический фундамент. В этом отношении показательна «биография» плазмиды pPS10 фитопатогена Pseudomonas savastanoi. Испанские биологи копили знания о механизмах её поддержания 30 лет! В итоге на базе белка-инициатора репликации этой плазмиды (RepA) была разработана модель для изучения амилоидных протеинопатий, наблюдаемых при нейродегенеративных заболеваниях человека [18]. Кроме того, обнаружение структурного сходства белка RepA с компонентами эукариотического origin recognition complex заставило учёных выдвинуть предположение о слиянии на каком-то эволюционном этапе гена инициатора репликации хромосомы общего предка эукариот и архей и гена repA бактериальных плазмид типа pPS10 [19]. Таким образом, некоторые молекулярные модули эукариотических организмов, включая человека, могут быть унаследованы напрямую от плазмид прокариот.

Внушителен и «послужной список» плазмиды биодеградации карбазола pCAR1: японские микробиологи по ней написали не менее пяти работ, причём именно гены биодеградации их интересовали в последнюю очередь, а в первую — механизмы поддержания и распространения, взаимодействие с бактериальной хромосомой. Авторы «CARологии» показали, например, что глобальный регулятор транскрипции H-NS-семейства, кодируемый pCAR1, модулирует экспрессию хромосомных генов, в том числе, усиливает транскрипцию mexEF-oprN-оперона (гены эффлюкс-системы), повышая устойчивость бактерии-хозяина к антибиотикам [20].

С годами становится ясно, что самое интересное лежит не на поверхности. Связь плазмид с распространением антибиотикорезистентности очевидна, и соответстующие гены изучаются давно, однако борьба с этим опасным явлением пока успехом не увенчалась. И вот тут-то на помощь могут прийти всё те же, такие «неинтересные», области rep-ori-par, ответственные за поддержание плазмидной ДНК. Именно их рассматривают в качестве мишеней антиплазмидной терапии, которой в перспективе можно было бы дополнить лечение некоторых бактериальных инфекций.

Потенциал мобильных элементов прокариот как объектов исследования почти неиссякаем. На какие же аспекты функционирования «мобильного социума» будут направлены взгляды учёных в будущем? Разумеется, микробиологи продолжат «вербовать» эти элементы для удовлетворения биотехнологических нужд общества (векторы, препараты для биоремедиации) и искать способы борьбы с негативными для человека последствиями горизонтального генетического переноса (бактериальная резистентность и вирулентность). В то же время, внимание научного сообщества будет направлено и на дальнейшее вскрытие вклада МГЭ в эволюцию организмов. В ближайшие годы также прогнозируется массовое обращение микробиологов к мобилому кишечной микрофлоры: публикации о циркуляции плазмид в этих загадочных бактериальных коллективах уже появляются в респектабельных изданиях. Поиски будут направлены, в том числе, на выяснение роли МГЭ наших симбионтов в формировании метаболических путей и развитии заболеваний.

Литература


  1. Jeon K.W., Danielli J.F. (1971). Micrurgical Studies with Large Free-Living Amebas. Int. Rev. Cytol30, 49–89;
  2. Top E.M., Moenne-Loccoz Y., Pembroke T., Thomas C.M. Phenotypic traits conferred by plasmids. In: The horizontal gene pool: bacterial plasmids and gene spread. Ed. Thomas C.M. Amsterdam: Harwood Academic Publishers, 2000. P. 246–285;
  3. Osborn A.M., Boltner D. (2002). When phage, plasmids, and transposons collide: genomic islands, and conjugative- and mobilizable-transposons as a mosaic continuum. Plasmid48, 202–212;
  4. La Scola B., Desnues C., Pagnier I., Robert C., Barrassi L., Fournous G., Merchat M., Suzan-Monti M., Forterre P., Koonin E., Raoult D. (2008). The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus. Nature 455, 100–104;
  5. Science News — «Virus Gets a Taste of Its Own Medicine»;
  6. Fischer M.G., Suttle C.A. (2011). A virophage at the origin of large DNA transposons. Science 332, 231–234;
  7. Desnues C., La Scola B., Yutin N., Fournous G., Robert C., Azza S., Jardot P., Monteil S., Campocasso A., Koonin E., Raoult D. (2012). Provirophages and transpovirons as the diverse mobilome of giant viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18078–18083;
  8. Canchaya C., Proux C., Fournous G., Bruttin A., Brussow H. (2003). Prophage genomics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 238–276;
  9. Norman A., Hansen L.H., Sorensen S.J. (2009). Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool. Phil. Trans. R. Soc. B. 364, 2275–2289;
  10. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. 2-е изд., перераб. и доп.: Учебник для вузов. СПб: Изд-во СПбГТУ, 2002. 522 с;
  11. Grindley N.D., Reed R.R. (1985). Transpositional recombination in prokaryotes. Annu. Rev. Biochem. 54, 863–896;
  12. Schluter A., Szczepanowski R., Puhler A., Top E.M. (2007). Genomics of IncP-1 antibiotic resistance plasmids isolated from wastewater treatment plants provides evidence for a widely accessible drug resistance gene pool. FEMS Microbiol. Rev. 31, 449–477;
  13. Fluit A.C., Schmitz F.-J. (2004). Resistance integrons and super-integrons. Clin. Microbiol. Infect. 10, 272–288;
  14. Juhas M., van der Meer J.R., Gaillard M., Harding R.M., Hood D.W., Crook D.W. (2009). Genomic islands: tools of bacterial horizontal gene transfer and evolution. FEMS Microbiol. Rev33, 376–393;
  15. Klockgether J., Reva O., Larbig K., Tummler B. (2004). Sequence analysis of the mobile genome island pKLC102 of Pseudomonas aeruginosa CJ. Bacteriol. 186, 518–534;
  16. Ragan M.A., Beiko R.G. (2009). Lateral genetic transfer: open issues. Phil. Trans. R. Soc. B. 364, 2241–2251;
  17. Waters V.L. (2001). Conjugation between bacterial and mammalian cells. Nat. Genet. 29, 375–376;
  18. Giraldo R., Fernández-Tresguerres M.E. (2010). Voyage of RepA protein from plasmid DNA replication through amyloid aggregation towards synthetic biology. J. Appl. Biomed. 8, 151–158;
  19. Giraldo R. (2003). Common domains in the initiators of DNA replication in Bacteria, Archaea and Eukarya: combined structural, functional and phylogenetic perspectives. FEMS Microbiol. Rev. 26, 533–554;
  20. Yun C.-S., Suzuki C., Naito K., Takeda T., Takahashi Y., Sai F., Terabayashi T., Miyakoshi M., Shintani M., Nishida H., Yamane H., Nojiri H. (2010). Pmr, a histone-like protein H1 (H-NS) family protein encoded by the IncP-7 plasmid pCAR1, is a key global regulator that alters host function. J. Bacteriol192, 4720–4731.

Автор: Волкова Ольга.

Число просмотров: 3702.

Creative Commons License — условия использования и распространения материалов сайта.
Вернуться в раздел «Клетка»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Re: Мобильные генетические элементы прокариот: стратификация «общества» бродяжек и домоседов

Юлия — 7 марта, 2016 г. 21:34. (ссылка) (свернуть ветвь)

Здравствуйте!
Как отличить генные острова, содержащие ген транспозазы, от транспозонов примерно такого же размера?

(ответить)

Re: Re: Мобильные генетические элементы прокариот: стратификация «общества» бродяжек и домоседов

Панов Андрей — 11 марта, 2016 г. 08:24. (ссылка)

Юлия, добрый день.
Напишите, пожалуйста, адрес своей электронной почты здесь или личным сообщением Ольге, чтобы она смогла прислать Вам статью.

(ответить)

Re: Re: Мобильные генетические элементы прокариот: стратификация «общества» бродяжек и домоседов

Волкова Ольга — 9 марта, 2016 г. 16:42. (ссылка) (свернуть ветвь)

Думаю, что в некоторых случаях различить их не удастся. Из-за мозаичной структуры классифицировать всяческие гибриды, видавшие не одно рекомбинационное событие в своей эволюционной истории, сложно, и многих из них относили в разное время к разным типам, да и сейчас часто называют просто «элемент». Геномным островом становится транспозон (или плазмида, или прочие МГЭ и их гибриды) со сломанным геном рекомбиназы, т.е. заякоренный в чьём-то геноме, тогда дефектный ген будет ориентиром для верного подбора наименования. Если же ген рекомбиназы жив, то уже нужно будет совокупность факторов учитывать. В литературе мне встречались только плазмидные (не хромосомные) ГО, встраивающиеся посредством транспозазы (DD-E-рекомбиназы), но у них, вроде как, привычная для ГО тирозиновая рекомбиназа всё равно есть. Но нельзя исключить, что и в хромосомах такие встречаются. А в общем случае, если рекомбиназа тирозиновая, то, скорее всего, это геномный остров. Но не обязательно: конъюгативные и мобилизуемые Tn могут иметь такую же. Самый важный дифференциальный признак – места встраивания. ГО сидят всего в 1-2 сайтах хромосомы - чаще в конкретных генах тРНК. Большинство конъюгативных и мобилизуемых Tn даже с тирозиновой рекомбиназой ведут себя подобно обычным Tn с DD-E-рекомбиназой, т.е. встраиваются куда ни попадя. Но и здесь (среди мобилизуемых Tn) есть исключения с единичными местами встраивания в одном хозяине и множественными – в другом. То есть важно знать и прилегающий к МГЭ сиквенс. Но, думаю, если в своей работе придётся столкнуться с чем-то подобным, важнее просто найти гомологичные элементы в GenBank и хорошенько сравнить – вдруг подобный «каркас» уже классифицирован (идентичность бывает высокой на протяжении десятков килобаз даже у элементов, найденных в разных частях света). Ну и конечно, если секвенирован только фрагмент МГЭ (однажды у меня на плазмиде так нашёлся кусок ГО, в который ген рекомбиназы не вошёл), то только на сравнение и можно рассчитывать. Не знаю, есть ли новые подобные статьи, но именно вопрос классификации всяких химерных МГЭ замечательно разобран в обзоре [3] списка литературы (Osborn A.M., Boltner D....). Если нужно, могу pdf-ку послать (только адрес почты тогда, пожалуйста, напишите).

(ответить)

Re: Re: Re: Мобильные генетические элементы прокариот: стратификация «общества» бродяжек и домоседов

Юлия — 13 марта, 2016 г. 17:29. (ссылка)

Добрый день! Огромное спасибо за подробный ответ. Пришлите, пожалуйста, статью на адрес 1989july@mail.ru

(ответить)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.