Мы изучаем жизнь на все более тонких уровнях, однако по-прежнему существует не так много данных, которые можно получить для индивидуальных клеток, а не для клеточной популяции в целом. Анализировать содержание некоторых белков в единичных клетках позволяет метод проточной цитометрии. С помощью него можно разделять клеточные суспензии на специальных аппаратах, ориентируясь на флуоресценцию введенных в клетки меток*. Если есть возможность получить антитела, связывающие определенный белок клетки, то, снабдив такие антитела флуоресцентными метками и обработав ими клетки, можно будет оценить яркость свечения каждой отдельной клетки, а значит, и количество целевого белка в ней. Однако флуоресцирующие антитела можно использовать только к белкам, находящимся на поверхности клетки, так как внутрь живых клеток антитела попасть не могут. Поэтому в анализе содержания белков на уровне отдельных клеток есть определенные ограничения.

* — Новейшие «навороты» метода подробно обсуждались на семинаре Совета молодых ученых, посвященном современным технологиям в проточной цитометрии (два замечательных видео из ИБХ) — Ред.

Что же касается активности генов, то есть содержания РНК в отдельных клетках, то до недавнего времени методов их анализа просто не было. Чаще всего РНК выделяется из больших количеств клеток, и данные по активности генов, полученные классическими методами — это «средняя температура по больнице». Если и было показано увеличение активности определенного гена, таким методом невозможно определить, увеличилась ли активность во всех клетках равномерно или же лишь в малой доле клеток, но более резко. Также невозможно получить точную информацию об исходном количестве клеточной РНК: для регистрации молекул, присутствующих в малых количествах, приходится амплифицировать («умножать») их число с помощью ПЦР, а она может протекать с разной эффективностью. Чтобы перейти к анализу содержания РНК в отдельных клетках, разрабатываются модификации классических методов, но их использование очень трудоемко, и стоимость знаний о нуклеиновых кислотах из каждой клетки, если их получать такими способами, очень высока [1]. Кроме того, традиционными методами за один эксперимент можно получить информацию о работе лишь ограниченного набора генов. Поэтому важной выглядит новая разработка американских ученых — метод CytoSeq, который позволяет получить информацию об активностях всех генов нескольких тысяч индивидуальных клеток за один эксперимент [2]. Новый метод цитометрии не обходится без этапа секвенирования [3, 4, 5].

Основной принцип новой технологии — присвоение каждой клетке и каждой молекуле РНК индивидуального «штрихкода». Для этого клетки сначала разделяют нехитрым способом: размазывают суспензию по плашке с лунками определенного размера, при этом клеток должно быть в 10 раз меньше, чем лунок, чтобы уменьшить вероятность попадания двух клеток в одну лунку. Затем в каждую лунку к клетке добавляют шарик, к которому прикреплено несколько десятков миллионов фрагментов ДНК (рис. 1). Каждый фрагмент включает в себя последовательность для захвата матричных РНК. Матричные РНК, как известно, несут на 3’-конце регуляторную последовательность из нескольких адениновых нуклеотидов — поли(А)-хвост [6]. Поэтому их можно «выловить» из смеси молекул, используя комплементарную последовательность из нескольких тимидинов, которой и снабжены фрагменты ДНК на шарике. Кроме того, в каждом фрагменте содержится универсальный праймер, с которого вся смесь молекул впоследствии амплифицируется, а затем секвенируется. А чтобы после этого понять, какая последовательность из какой клетки происходит, а также определить, сколько в ней изначально было копий каждой молекулы, в каждом фрагменте имеются маркеры — нуклеотиды, индивидуальные для шарика, и нуклеотиды, индивидуальные для фрагмента. После добавления шарика с метками в лунку с клеткой капают лизирующий буфер, который растворяет мембрану и высвобождает клеточное содержимое.

В каждой клетке содержится около 100000 индивидуальных молекул РНК, так что каждая из них получает шанс связаться с одной из меток на поверхности шарика. Благодаря такому связыванию к каждой молекуле добавляется случайная метка, по которой ее можно отличить, а также метка своего шарика — одна и та же у всех молекул, происходящих из данной клетки. Таким образом и осуществляется «штрихкодирование». После этого все шарики извлекаются из лунок, и на всей пойманной РНК достраивается комплементарная цепочка ДНК, чтобы было удобнее работать дальше: ДНК более стабильна, чем РНК. После этого потенциально возможно определить последовательность всех молекул РНК, которые были во всех исследованных индивидуальных клетках. Правда, обойдется это недешево — по подсчетам авторов, в $15 000 на 1000 клеток.

Тем не менее со временем производительность секвенирования, как ожидается, будет расти, а стоимость его — падать, что характерно для большинства технологий [7]. Так что процедура анализа всего транскриптома индивидуальных клеток когда-нибудь станет по карману большему числу лабораторий. На данный момент авторы рекомендуют ограничиваться анализом работы определенных генов, интересующих исследователей. Ведь даже знание активностей лишь ограниченного их набора в тысячах индивидуальных клеток даст много новых возможностей. Тем более, взрывной рост объемов баз данных, сопровождающий развитие многочисленных -омик [8], уже сейчас порождает проблемы c обработкой и хранением информации [9].

Для апробации своего метода ученые посмотрели уровни активностей генов цитокинов в Т-клетках после стимуляции рецепторов на их поверхностях [2]. Оказалось, что уровни цитокинов после стимуляции резко повышаются лишь у небольшого числа клеток, причем у каждой из среагировавших клеток растет активность определенного набора генов цитокинов. С помощью своего метода исследователи обнаружили единичные отреагировавшие на стимуляцию клетки среди нескольких тысяч! Кроме того, стало возможным проследить индивидуальные различия в реакциях этих клеток. Данные о вкладе отдельных клеток в жизнь популяции помогут нам больше узнать о самых базовых принципах клеточных взаимодействий в организме, механизмах дифференцировки и онкогенеза [1, 9].

Постепенно в научной среде растет доля «сухих» лабораторий, не проводящих экспериментальной работы (это удел лабораторий «мокрых»), а анализирующих и сопоставляющих разные виды данных из биомедицинских баз. Ведь именно биоинформатика позволяет разгрести авгиевы конюшни документированных по всему миру симптомов, побочных и прямых действий лекарств, всевозможных мутаций, интегрировать данные миллионов пациентов и экспериментов... И получить порой очень неожиданные результаты [10]. Возможно, метод CytoSeq окажет неоценимую услугу «белоручкам» и ускорит «пришествие» Интегративной Биологии, которая будет ворочать огромными массивами разнородных «омических» данных и поспособствует развитию доказательной и становлению персональной медицины.

Литература

1. Секвенирование единичных клеток (версия — Metazoa);
2. Fan H.C., Fu G.K., Fodor S.P.A. (2015). Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222). doi: 10.1126/science.1258367;
3. Код жизни: прочесть не значит понять;
4. 454-секвенирование (высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК);
5. Огурцы-убийцы, или Как встретились Джим Уотсон и Гордон Мур;
6. мРНКаааауу;
7. Технология: $1000 за геном;
8. «Омики» — эпоха большой биологии;
9. Биоинформатика: большие БД против «большого Р»;
10. Вычислительное будущее биологии.