биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


Двухцепочечная РНК защищает трансгенные растения только от нежелательных насекомых

[16 марта, 2015 г.]

Ученые получили трансгенные растения, в хлоропластах которых образуется двухцепочечная РНК, нарушающая работу жизненно важного гена колорадского жука — гена белка цитоскелета β-актина. Все личинки жуков, которые в эксперименте питались листьями таких растений, погибали в течение пяти дней. В то же время разработанный подход высокоселективен в отношении вредителя и безопасен для опылителей.

XXI век — это век биотехнологий: развиваются методы адресной доставки лекарств в определенные органы или клетки с минимальным количеством побочных эффектов [1], становится возможным контролировать активность отдельных генов в разных тканях организма. Но при этом в сельском хозяйстве по-прежнему используются на удивление грубые методы — к примеру, применение инсектицидов, действующих абсолютно не избирательно и причиняющих вред не только поедающим растения насекомым-вредителям.

Каким же образом возможно точечно воздействовать на одних лишь вредителей? Все виды живых существ отличаются друг от друга своей ДНК, поэтому делать ДНК-ориентированную систему защиты от с/х-вредителей — это первое, что приходит на ум. Механизм можно позаимствовать у природы — во всех клетках эукариот существует система уничтожения подозрительных нуклеиновых кислот, которая используется для защиты от вирусов.

Дело в том, что только у вирусов бывают нуклеиновые кислоты особой структуры — двухцепочечные РНК (дцРНК). У всех остальных организмов молекулы РНК представлены в виде одиночных цепочек нуклеотидов. Обнаружив двухцепочечную РНК, клетка активирует механизм защиты под названием РНК-интерференция [2]. Специальные белки (Dicer) режут подозрительную молекулу РНК на фрагменты. Антисмысловые цепи этих фрагментов раздаются другим белкам (RISK), как фотороботы сотрудникам правоохранительных органов. Когда эти белки находят РНК или ДНК с похожей последовательностью (неважно, одноцепочечные или двухцепочечные), они ее уничтожают. А поскольку РНК — это единственный способ для гена проявить свою активность, получается, что гены, которым соответствовала двухцепочечная РНК, перестают работать.

Такой системой можно манипулировать: например, заставить клетку отключать собственные гены, «скормив» ей искусственно синтезированную двухцепочечную РНК с соответствующей последовательностью. Организм будет считать, что защищается от вирусов, и сам же отключит собственные гены. Если эти гены будут жизненно важными — организм погибнет.

Именно такую систему защиты от вредителей пытались реализовать в последние годы биотехнологи, создавая трансгенные растения вопреки предубеждению части общества относительно ГМО [3]. Они получали растения, в тканях которых синтезировались дцРНК с фрагментами генов колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata). Если насекомое ело трансгенное растение, двухцепочечная РНК с последовательностью одного из важных генов попадала в его клетки. Запускался механизм РНК-интерференции, и жук погибал.

К сожалению, эта система работала не так эффективно, и колорадские жуки после поедания трансгенных растений гибли не всегда. Проблема заключалась в том, что дцРНК синтезировалась в ядре растительной клетки, а затем попадала в цитоплазму, где встречалась с белком Dicer и разрезалась на фрагменты (рис. 1, справа). Когда насекомые ели растения с заранее нарезанной на короткие фрагменты РНК, ответ их клеток оказывался слабым [4]. Во-первых, короткие двухцепочечные РНК, как показано на примере некоторых насекомых, могут хуже поглощаться клетками. Во-вторых, существует вероятность, что нарезанные «чужими» для насекомых белками фрагменты РНК вызывают слабую реакцию клетки. Необходимо было найти способ сохранять длинную дцРНК в клетках растений до попадания в пищеварительную систему жуков. И такой способ был предложен: решили перенести синтез дцРНК из ядра клетки в хлоропласты, где нет белка Dicer [5].

Как известно, хлоропласты произошли от цианобактерий, которые поселились внутри клеток эукариот, дав им возможность фотосинтезировать. У бактерий нет системы классической РНК-интерференции, потому и у хлоропластов ее тоже нет. Поэтому двухцепочечную РНК решено было производить именно в хлоропластах, чтобы она дошла до насекомых-вредителей в неразрезанном виде (рис. 1, слева). Кроме того, локализация дцРНК в хлоропластах практически исключает возможность её появления в клетках цветов, а следовательно, и нанесения вреда насекомым-опылителям.

Схема защиты трансгенных растений от колорадского жука

Рисунок 1. Схема защиты трансгенных растений от колорадского жука. Специфичность обеспечивается благодаря образованию в растении двухцепочечных РНК, соответствующих фрагменту жизненно важного гена определенного вредителя. Длинная дцРНК при попадании в клетку вызывает отключение соответствующего гена. Справа — двухцепочечная РНК синтезируется в ядре растительной клетки и режется на кусочки еще в самом растении. Такая короткая дцРНК не вызывает гибели существенного количества вредителей. Слева — ДНК, кодирующая двухцепочечную РНК, встроена в геном хлоропластов, и в этом случае РНК, оставшись невредимой, вызывает сильный ответ в клетках жуков, что приводит к их гибели. Рисунок из [4].

Чтобы РНК образовывалась в клетках в двухцепочечном виде, синтезировали фрагменты ДНК, кодирующие обе цепи — смысловую и антисмысловую. Эти фрагменты встраивались в ДНК хлоропластов благодаря последовательностям нуклеотидов, гомологичным определённым последовательностям в хромосомах пластид. После синтеза двух молекул одноцепочечной РНК они налипали друг на друга и образовывали дцРНК.

Листья дикого и трансгенного картофеля

Рисунок 2. Листья «дикого» (слева) и трансгенного (справа) картофеля (в хлоропластах которого образуется двухцепочечная РНК для блокировки гена АСТ колорадского жука) каждый день давали личинкам. Фотография сделана на третий день эксперимента, и видно, что личинки колорадского жука почти не едят листья трансгенного картофеля. Рисунок из [5].

ДНК-матрицу доставляли в хлоропласты, обстреливая листья растений крошечными золотыми «пулями», облепленными ее молекулами. После этого из листьев получали культуру клеток (каллус), из которой отбирали клетки, чьи хлоропласты содержали привнесенную ДНК. А из подходящих клеток выращивали целые растения (растение иногда удается восстановить из отдельных его фрагментов: возможно, вы пробовали проращивать, к примеру, стебли роз, из которых можно получить полноценное растение).

В эксперименте с трансгенным картофелем использовали дцРНК для двух генов колорадского жука: ACT, кодирующего β-актин (белок цитоскелета), и SHR, кодирующего субъединицу белкового комплекса, вовлеченного в мембранную перестройку при транспорте везикул [5]. Двухцепочечная РНК, как и было задумано, синтезировалась в хлоропластах и сохраняла длину до попадания в организм колорадских жуков. Оказалось, что наиболее эффективна в деле борьбы с вредителями дцРНК для гена АСТ: когда листьями такого картофеля кормили личинок колорадского жука, все они погибали уже в течение трёх дней. Анализ подтвердил, что у личинок, которые питались листьями трансгенного картофеля, подавлялась экспрессия целевого гена. Листья трансгенного картофеля, в котором двухцепочечная РНК образовывалась в хлоропластах, были повреждены вредителями намного меньше, чем листья растений, у которых дцРНК синтезировалась в ядре, а также чем листья обычного картофеля (рис. 2).

Предложенный метод целенаправленной защиты растений от вредителей позволяет разработать различные варианты его применения. Например, последовательность нуклеотидов дцРНК можно подбирать таким образом, чтобы она действовала против нескольких видов насекомых, или производить в хлоропластах набор отдельных молекул двухцепочечной РНК для разных вредителей.

Литература

  1. биомолекула: «Работа курьером, район — организм»;
  2. биомолекула: «Обо всех РНК на свете, больших и малых»;
  3. Элементы: «ГМО — мифические опасности»;
  4. Whyard S. (2015). Insecticidal RNA, the long and short of it. Science347 (6225), 950–951;
  5. Zhang J., Khan S.A., Hasse C., Ruf S., Heckel D.G., Bock R. (2015). Full crop protection from an insect pest by expression of long double-stranded RNAs in plastids. Science347 (6225), 991–994.

Автор: Кондратенко Юлия.

Число просмотров: 643.

Вернуться в раздел «Новости»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Re: Двухцепочечная РНК защищает трансгенные растения только от нежелательных насекомых

Gadzhimuradov Oscar — 14 октября, 2016 г. 17:01. (ссылка)

Цитата: "Чтобы РНК образовывалась в клетках в двухцепочечном виде, синтезировали фрагменты ДНК, кодирующие обе цепи — смысловую и антисмысловую. Эти фрагменты встраивались в ДНК хлоропластов благодаря последовательностям нуклеотидов, гомологичным определённым последовательностям в хромосомах пластид. После синтеза двух молекул одноцепочечной РНК они налипали друг на друга и образовывали дцРНК." Как известно, ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует при транскрипции лишь одну цепь РНК, считывая генетический код лишь с одной из цепей ДНК - значимой цепи, смысловой. Каким образом образуется в случае с трансгенными растениями двухцепочечная РНК, ведь в этом случае ДНК-зависимая РНК-полимераза должна считывать информацию с обеих цепей ДНК, и вмсто одной иРНК(мРНК) синтезировать комплементарные друг другу две молекулы РНК, которые затем соединятся в дцРНК?

(ответить)

Re: Двухцепочечная РНК защищает трансгенные растения только от нежелательных насекомых

Андрей — 16 марта, 2015 г. 11:18. (ссылка) (свернуть ветвь)

Вопрос ко всем, кому по роду деятельности близка тематика трансгенных растений.
Утверждается, что в клетки человека при поедании пищи не проникают чужие нуклеиновые кислоты, а если и проникают, то в малом количестве, никак не влияя на работу клеток. Это якобы часть защитного механизма от чужеродных патогенов.
В то же время в данной статье рассказывается о проникновении дцРНК в клетки кишечника колорадского жука, что ведёт к блокированию определённых генов и гибели насекомого.
Как согласуются эти два факта? В чём принципиальная разница процессов пищеварения жука и человека, если результаты настолько отличаются? Есть ли какие-то эксперименты, показывающие справедливость первого утверждения (в случае с человеком)? Обращают ли внимание на такие вопросы при разработке трансгенных растений?

(ответить)

Re: Re: Двухцепочечная РНК защищает трансгенные растения только от нежелательных насекомых

Чугунов Антон — 18 марта, 2015 г. 00:37. (ссылка) (свернуть ветвь)

Получен комментарий эксперта. Отвечает к.б.н., зав. лабораторией молекулярной диагностики Центра Биоинженерия РАН Кузнецов Б.Б.
Механизм защиты с помощью интерференции коротких интерферирующих РНК (киРНК) — эволюционно сложившийся способ защиты клетки от внешней инфекции, в первую очередь от вирусов. киРНК обнаружены только у растений, беспозвоночных и одноклеточных; хотя гомологи белков для РНК-интерференции (Dicer, RISC-комплекс) присутствуют и у высших животных, киРНК у них привычными методами не обнаруживались. «Традиционная» иммунная система (лимфоциты + лейкоциты + макрофаги) присутствует лишь у сложных многоклеточных организмов. У одноклеточных же, беспозвоночных и растений (у которых такой системы либо нет, либо она находится в зачаточном состоянии) иммунная защита строится на основе РНК-интерференции. Иммунитет, основанный на РНК-интерференции, не нуждается в сложных органах «тренировки» предшественников иммунных клеток (селезенка, тимус); в то же время, многообразие теоретически возможных последовательностей коротких РНК (421 вариантов) соотносимо с числом возможных белковых антител высших животных. Кроме того, киРНК синтезируются на основе инфицировавшей клетку «враждебной» РНК, а значит, в отличие от антител, они сразу «затачиваются» под конкретный тип инфекции. И хотя вне клетки защита на основе РНК-интерференции не работает (по крайней мере, таких данных пока нет), внутриклеточный иммунитет у растений, беспозвоночных и одноклеточных она обеспечивает более чем удовлетворительно.
Поэтому дело здесь не в различии систем пищеварения у жука и у человека, а в том, что двуцепочечная РНК, если она и попадает в клетки человека в процессе пищеварения, попросту не находит для себя мишени действия внутри клетки, то есть не взаимодействует с информационной РНК клеток человека и животных. В клетках человека работает другой механизм воздействия коротких молекул РНК, т.н. микроРНК, которые, в отличие от киРНК, не попадают в клетку извне, а закодированы в самом геноме человека. микроРНК, в отличие от киРНК, одноцепочечные и имеют весьма специализированную структуру. Роль микроРНК в обеспечении иммунитета невысока, поскольку эту функцию взяли на себя более совершенные механизмы клеточного иммунитета, — в частности, интерфероновая система.
Отсюда следует ответ и на последний вопрос — специальные эксперименты, направленные на взаимодействие РНК растений на человека или животных, не производились, поскольку РНК-интерференция в клетках животных построена на других принципах, чем у растений. Образно говоря, если бы животные реагировали на РНК растений, они бы попросту не смогли бы появиться на Земле, а соответственно, не смог бы появиться и человек. Так что эту опасность природа давным-давно предусмотрела, и подтверждением тому является более чем 450-миллоионолетняя история успешного развития животной жизни на Земле.
Часть материала цитируется по П. Старокадомский: «Обо всех РНК на свете, больших и малых».

(ответить)

Re: Re: Re: Двухцепочечная РНК защищает трансгенные растения только от нежелательных насекомых

Андрей — 18 марта, 2015 г. 13:27. (ссылка)

Спасибо Борису Кузнецову за подробный ответ и Антону за привлечение к разговору эксперта.

(ответить)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.