биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


Спектроскопия КР: новые возможности старого метода

[5 декабря, 2015 г.]

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Спектроскопия комбинационного рассеяния света (КР) появилась более 80 лет назад и с тех пор широко используется в физике, химии и многих прикладных областях. Метод привлекателен тем, что на исследуемый образец воздействует только свет и ничего более, но при этом можно получать эксклюзивную информацию о свойствах объекта, которую нельзя получить другими методами. Однако минус КР для исследования живой клетки состоит в том, что получается сигнал со слишком низкой интенсивностью. Тем не менее за последние десятилетия появилось несколько усовершенствований, которые позволили значительно усиливать сигнал, что открыло широкие возможности для применения КР в исследованиях живых клеток и тканей. В обзоре будет рассказано о принципах данных подходов и об их применении для решения современных биофизических и биомедицинских задач.

Обратите внимание!

Эта работа опубликована в номинации «лучшая обзорная статья» конкурса «био/мол/текст»-2015.


Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.


Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.

Если спросить, чем занимаются биофизики, то в большинстве случаев ответ будет — спектрами. А если попробовать уточнить, какими именно спектрами, то варианты ответа будут самыми разнообразными: и спектрами поглощения, и спектрами флуоресценции, инфракрасными, и ультрафиолетовыми, и спектрами электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [1], и спектрами комбинационного рассеяния (КР), и т.д. и т.п. Но в любом случае спектроскопия позволяет исследовать переходы между энергетическими уровнями молекул: электронными, колебательными или вращательными в зависимости от выбранного метода (рис. 1).

При этом выбор метода зависит от конкретной исследовательской задачи. Исторически в нашей группе биофизики клетки (кафедра биофизики биологического ф-та МГУ) изучают конформационные состояния различных биомолекул, используя для этого метод комбинационного рассеяния света (КР, Raman spectroscopy, RS). Итак, что это за метод, и какую информацию можно из него извлечь?

Изменение энергии молекулы

Рисунок 1. Изменение энергии молекулы (ΔЕ) при взаимодействии с квантом света (). Каждый спектроскопический метод работает в своем энергетическом диапазоне. Энергии переходов: Еэл — электронных, Екол — колебательных, Евр — вращательных, Еспин — изменения спина. На основе лекций Ф.Ф. Литвина.

Эффект комбинационного рассеяния света

Явление КР основано на эффекте неупругого (рáмановского, или комбинационного*) рассеяния оптического излучения на молекулах вещества. При обычном (упругом, или рэлеевском) рассеянии свет после взаимодействия с веществом обладает той же энергией, что и возбуждающий луч, следовательно, и частота (и длина волны) излучения не меняется. А при неупругом рассеянии в результате взаимодействия света с молекулами вещества частота излучения меняется. В основном свет рассеивается на молекулах вещества без изменения частоты, но небольшая часть фотонов все же меняет свою частоту, что выражается в появлении дополнительных линий (линий КР) на спектре рассеяния. Схематично явление КР изображено на рис. 2.

* — Да-да, рамановское и комбинационное рассеяние — это одно и то же. Впервые появление новых линий в спектре рассеянного света на кристаллах кварца наблюдали в 1928 году советские учёные Г. С. Ландсберг и Л. И. Мандельштам, которые назвали увиденное явление комбинационным рассеянием света (КР). На неделю позже советских физиков комбинационное рассеяние наблюдали индийские учёные Ч. В. Раман и К. С. Кришнан на жидкостях, используя солнечные лучи в качестве источника света. Впоследствии за открытие эффекта неупругого рассеяния света только Раман был удостоен Нобелевской премии в 1930 году, а данный оптический эффект стал носить его имя (эффект Рамана, англ. Raman effect). Однако в русскоязычной литературе придерживаются названия, данного Ландсбергом и Мандельштамом, т.е. КР. Название «комбинационное» рассеяние означает, что спектр рассеяния представляет собой комбинацию частот возбуждающего света и собственных колебаний молекулы [2]. — Авт.


Рассеяние света на молекуле

Рисунок 2. Рассеяние света на молекуле (жёлтый круг), устройство спектров КР* и схема переходов между колебательными подуровнями и электронными уровнями молекулы. S0 и S1 — основной и первый возбужденный электронные уровни со структурой колебательных подуровней. Серой пунктирной линией обозначен виртуальный подуровень (в случае, если энергии кванта не хватает для перехода на существующий подуровень). 1 — Поглощение инфракрасного (ИК)-кванта приводит к переходу молекулы на новый колебательный подуровень**. 2 — Стоксово КР наблюдается в случае, если молекула находится в невозбужденном состоянии и при взаимодействии со светом переходит на более высокий колебательный подуровень. Энергия рассеянного света при этом меньше энергии возбуждающего света (зеленыйоранжевый). 3 — Рэлевское рассеяние, не приводящее к изменению энергии (и соответственно, длины волны) возбуждающего света. 4 — Антистоксово КР наблюдается в случае, если молекула находится в возбужденном состоянии и при взаимодействии со светом переходит на нижний колебательный подуровень. В этом случае энергия рассеянного света будет больше энергии возбуждающего света (зеленыйсиний). Происходит гораздо реже стоксового из-за разности в заселённости уровней. 5 — Флуоресценция: квант света вызывает электронно-колебательный переход, после чего наблюдается релаксация (бордовая фигурная стрелка) и испускание света с меньшей энергией (синийкрасный). Рисунок из [3].

* — Спектры КР представляют как зависимость интенсивности сигнала от частотного сдвига, Δν [см−1], а не длины волны. В этом случае спектры не зависят от выбора лазера и их можно сравнивать.

** — Стоит заметить, что колебательные состояния, исследуемые в КР спектроскопии, являются такими же, что и в ИК спектроскопии. Однако колебания, которые сильно проявляются в ИК спектре обычно слабо проявляются в КР спектре и наоборот. Таким образом, КР и ИК спектроскопия — это взаимно дополняющие методы, хотя ИК спектроскопия — это по сути спектроскопия поглощения, а КР — рассеяния света.

Видео о том, как увидеть КР своими глазами

Какую информацию несёт спектр КР?

Под «взаимодействием» света с молекулой подразумевается энергетический обмен между фотонами и колебательными подуровнями энергии («колебаниями») молекулы. Это означает, что спектр КР несёт в себе информацию о колебаниях атомов в молекулах исследуемого вещества. Строго говоря, разность частот возбуждающего и рассеянного света (Δν) характеризует нормальные частоты колебаний молекулы в целом. Большинство пиков на спектре КР обусловлено колебаниями сразу нескольких химических связей в молекуле. Но некоторые пики описывают колебания совершенно определённых групп атомов. Например, положение максимумов пиков на спектре КР, характеризующих колебания одинарной С—С, двойной С=С и тройной C≡C связей, будет отличаться. Также на спектре хорошо различаются пики С=О, ароматических колец, тиолов и многих других групп атомов [2, 3]. С помощью таких ключевых колебаний можно определить, с чем мы имеем дело: с липидами, белками, ДНК, порфиринами или другими молекулами (рис. 3). И для каждой молекулы будет свой неповторимый спектр КР. Таким образом, спектр КР — это точный индивидуальный «отпечаток пальцев» молекулы. Поэтому метод чрезвычайно популярен среди химиков-аналитиков и физиков, а также применяется в археологии, экологии, геологии и даже в криминалистике. А вот биолога, как мы все понимаем, интересует не столько состав того, с чем он работает, сколько механизм самой работы.

Пики на спектре КР

Рисунок 3. Выявление различных веществ по ключевым пикам на спектре КР сложной смеси. Рисунок из [4] с изменениями.

КР в биологии

Первые биологические эксперименты с использованием метода КР провели еще в 1935-м году на аминокислотах [5]. Но, как известно, работы на изолированных молекулах не столь интересны, как на целых клетках. Давайте порассуждаем: если мы регистрируем спектр КР целой клетки, то какие колебания мы увидим?

Во-первых, сразу все, что есть в клетке. А клетка — это сложнейший по составу «раствор». Во-вторых, колебания только тех молекул, которых много, потому что сигнал КР обладает низкой интенсивностью (и это один из существенных недостатков метода). Именно поэтому, из-за сложности интерпретации спектров и недостаточно мощного оборудования, метод не получил широкого распространения среди биологов. И только в 1990-м году после совмещения КР-спектрометра с конфокальным микроскопом появилась возможность регистрировать КР целых клеток или отдельных участков клетки [6]. И в последние годы метод наконец-то приобрёл популярность, притом заслуженную, так как спектроскопия КР обладает существенными преимуществами перед другими методами и, главное, позволяет получать эксклюзивную информацию.

Основное преимущество спектроскопии КР — неинвазивность! В чём она проявляется? Во-первых, с помощью КР можно изучать биохимический состав клеток, не разрушая их. Подобную информацию можно получить только «разрушающими» технологиями, такими как масс-спектрометрия и хроматография. Во-вторых, не нужно использовать метки или зонды, как для флуоресцентной микроскопии. Это означает, что мы исследуем систему (в данном случае клетку) в естественных условиях. А это крайне важно, учитывая, что многие из существующих меток (как флуоресцентных, так и изотопных) являются токсичными. К тому же исчезает проблема выцветания меток и появляется возможность исследовать небольшие молекулы, к которым трудно пришить метку. В-третьих, можно отметить, что КР позволяет работать с водными растворами, в т.ч. с физиологическими буферами, в отличие от ИК спектроскопии, так как вода сильно поглощает в ИК-области.

Что касается эксклюзивной информации, то это, в первую очередь, информация о конформации (рис. 4) исследуемых молекул и микроокружении функциональных групп. А от этих параметров может зависеть и активность молекул в клетке, и взаимодействие с другими молекулами, т.е. то, что влияет на работу целой клетки. Исследовать конформацию молекул — это сложная экспериментальная задача. Для её решения можно использовать ИК-спектроскопию, но, опять же, только на высушенных образцах. Можно использовать более сложные и дорогие технологии, такие как рентгеноструктурный анализ и ЯМР. Эти методы позволяют получать целостную картину расположения атомов в молекуле, но очевидно, их пока нельзя использовать для изучения молекул в живой клетке. А спектроскопию КР можно — в зависимости от того, в какой конформации находится молекула, атомы будут колебаться по-разному, что отразится на спектрах [7].

Конформации органических молекул

Рисунок 4. Конформации органических молекул. а — различные конформации циклогексана: 1 — «кресло»; 2 — «полукресло»; 3, 5 — «твист»; 4 — «ванна». б — различные конформации гема. Рисунки из «Википедии» и [8].

In vitro

В настоящее время существует множество работ по исследованию клеток методом КР. Основные направления исследований — это изучение распределения веществ в целой клетке [2]; сравнение нормальных и патологических клеток [9]; изучение динамики некоторых клеточных процессов [3]. Например, КР использовали для выявления патологических или раковых клеток, изучения процессов апоптоза и дифференцировки, изучения распределения лекарств в клетке и т.д. [7, 11–13].

In situ

КР-спектроскопию применяют и для исследования целых органов и тканей, не изымая их из организма. Это возможно благодаря тому, что не нужно специальной подготовки образца, введения специфических меток и т.д. Так, в 2007-м году появился маленький эндоскоп на основе КР-спектрометра для исследования пищевода крыс [14]. А в нашей лаборатории даже удалось зарегистрировать КР от целого сердца [15].

Такая разная спектроскопия КР

Итак, спектроскопия КР позволяет неинвазивно получать уникальную информацию о конформации и микроокружении молекул внутри живых клеток. Однако, как и любой метод, КР имеет свои ограничения. И, в первую очередь, это низкая интенсивность сигнала. Именно эту проблему решают различными модификациями метода КР [9] (рис. 5).

Усиленик сигнала КР

Рисунок 5. Методы, позволяющие усилить сигнал КР. Обозначения: ν1 — частота возбуждения, ν2 — стоксово КР, ν3 — антистоксово КР, ν — переменная частота. Желтый круг — исследуемая молекула, серый многогранник — наночастица. Обсуждение в тексте.

RR

Схема установки RSOT

Рисунок 6. Схема установки для изучения одиночных клеток методом RSOT с двумя лучами захвата. Рисунок из [16].

Первый и самый простой способ усилить сигнал КР — использовать резонансную частоту возбуждения. Т.е. когда частота возбуждения попадает в область поглощения вещества, то наблюдается резонансное комбинационное рассеяние (РКР, англ. resonance Raman spectroscopy, RR), интенсивность которого на несколько порядков превышает обычное КР [3].

RSOT

Второй любопытный способ — это спектроскопия КР с оптическим пинцетом (RSOT — Raman Spectroscopy Optical Tweezers), которая позволяет увеличивать интенсивность КР за счет увеличения времени накопления сигнала от одиночных молекул или клеток в растворе, при этом не осаждая и не фиксируя их [16]. Оптический пинцет — это прибор, который позволяет манипулировать микроскопическими объектами с помощью лазерного света: частички попадают в фокус лазерного луча как в ловушку [17]. Для исследования клеток чаще всего используют два лазерных луча-ловушки, чтобы избежать флуктуаций и вращения объекта (рис. 6). Также с помощью двух лучей можно растягивать клетку. Например, для эритроцита было показано, что растяжение клетки приводит к деоксигенации гемоглобина [18].

CARS

Как было показано выше (рис. 2), стоксовые линии КР (ν0−Δν) гораздо интенсивнее антистоксовых (ν0+Δν). При этом антистоксовые линии представляют больший интерес, потому что в этой области отсутствует люминесценция образца (из-за Стоксова сдвига). Как же получить интенсивный спектр антистоксового КР? Оказывается, способ есть, и называется он КАРС — когерентное антистоксовое рассеяние света (Сoherent anti-stokes Raman scattering, CARS).

В КАРС-спектроскопии используется не один источник света, а три: первый источник называется волной накачки (pump) — ν1, второй представляет собой излучение со стоксовой частотой ν2, а третий — это пробный луч, частота которого плавно изменяется ν’. Эти лучи взаимодействуют друг с другом, а также с колебаниями молекул исследуемого вещества. Если разность частот ν1−ν2 входит в резонанс с собственными колебательными частотами молекулы, то возникает интенсивное когерентное (т.е. согласованное по фазе колебаний) антистоксово излучение (с частотой ν3 = ν1 − ν2 + ν’) [19, 20].

Помимо большей интенсивности и отсутствия люминесценции, на спектрах КАРС легче различать близкорасположенные пики, благодаря когерентности рассеянного света, что особенно важно при изучении структурно схожих биомолекул [19]. Большинство современных приложений данного метода связано с изучением липидов. Так, методом КАРС визуализировали движение везикул внутри клеток; процесс дифференцировки жировой ткани; изучали метаболизм липидов, в т.ч. влияние небезызвестной омеги-3; по липидному составу попытались различить здоровую и раковую нервную ткань и т.д. [20].

SERS и TERS

И, наконец, самый мощный способом добиться усиления сигнала КР — поместить молекулу вблизи наночастиц благородных металлов. Для этого есть два способа: поместить наночастицу (НЧ) на поверхность иглы атомно-силового микроскопа [21] и зондировать исследуемые молекулы, регистрируя с них сигнал КР. В этом случае метод будет называться TERS (tip-enhanced Raman spectroscopy). Во втором случае исследуемые молекулы помещают на поверхность НЧ металла и регистрируют КР обычным способом. Этот метод называется гигантское комбинационное рассеяние (ГКР) или SERS (surface enhanced Raman spectroscopy) [9]. На мой взгляд, ГКР — самая удачная разновидность КР, позволяющая получать наибольшее усиление сигнала и обладающая множеством практических применений, поэтому о ней и пойдет речь.

Метод ГКР основан на эффекте плазмонного резонанса, о котором уже писали в статье на биомолекуле [22]. Плазмонный резонанс — это резонанс частоты падающего света и частоты коллективных колебаний свободных поверхностных электронов металла (квант таких колебаний называется плазмон). Плазмонный резонанс приводит к многократному усилению электрического поля вблизи НЧ металла — таким образом, НЧ металла выступают в качестве «наноантенн». И теоретически это усиление может достигать 14 порядков, т.е. 100 триллионов раз! [23].

Спектроскопия ГКР: от молекул к клеткам

Впервые явление усиления сигнала КР наблюдал Флейшманн с коллегами, которые опубликовали свое открытие в 1974 году. Они получили сигнал ГКР молекул пиридина, адсорбированного на шероховатом серебряном электроде [24]. Довольно долгое время существовала концепция усиления сигнала КР от молекул, адсорбированных на поверхности электродов и наноструктур. Но для биологии, очевидно, это не самый удачный подход.

В начале 90-х годов с развитием КР-микроскопии метод ГКР применили к живым клеткам. Для изучения живых клеток с помощью спектроскопии ГКР существовало несколько подходов, но все они предполагали введение в клетку НЧ. Одной из первых работ по введению НЧ в клетку путём эндоцитоза была работа нашего соотечественника И.Р. Набиева с соавт. по изучению взаимодействия антибиотика доксорубицина с ДНК на культуре клеток [25]. Позже появляются работы по помещению клеток на особые наноструктурированные поверхности [26, 27]. Однако все они были сопряжены с одной трудностью — расстояние между исследуемой молекулой и наноструктурой должно быть очень маленьким — до 10 нм. Поэтому в этих работах либо изучалось распределение в клетке некоторых веществ, которые сами по себе имели очень интенсивный сигнал КР, либо изучались строение и динамика плазматических мембран, которые как раз и адсорбировались на наноповерхностях. Это значительно ограничивало исследователей, и интерес к использованию ГКР-подложек временно угас.

Тем не менее работы по внутриклеточному ГКР продолжались и на эукариотических клетках, и на бактериях. Основные стратегии эксперимента ГКР на живых клетках показаны на рисунке 7 в хронологическом порядке.

Метод ГКР

Рисунок 7. Типы используемых ГКР-наносенсоров (а) и хронология применения метода ГКР на живых клетках и органеллах (б). а — Типы используемых наночастиц (НЧ): 1 — Простые НЧ разного размера (10–80 нм) и морфологии (в виде палочек, многогранников, звёзд, но чаще всего — сферические); 2 — Комплексы [НЧ + Молекула-репортер*]; 3 — Простые НЧ или комплексы, покрытые оболочкой (полимером, белком, кремнием или др.); 4 — Простые НЧ или комплексы, функционализированные лигандами к определённым клеточным рецепторам, антителами к белкам, последовательностью ядерной локализации (ПЯЛ) для адресной доставки в ядро [28] и др. По материалам обзоров [23, 29]. б — Схемы экспериментов: 1 — Введение НЧ в клетку путём эндоцитоза (используется с 1990-х гг.). Это самый распространенный способ доставки НЧ, который применяют для оценки изменений рН при созревании лизосом [30, 31]; анализа состава эндосом в разных участках клетки [23, 32]; для исследования проникновения лекарств в ядро [25, 28]. 2 — Если клетки эукариот поместить в раствор солей серебра или золота, то в некоторых случаях клетки поглощают катионы Au3+ или Ag+, восстанавливают их, формируя НЧ разного диаметра in vivо (с 2000-х гг.) [33]. 3 — Специальные чипы на основе наноструктур серебра, часто функционализированные антибиотиками, позволяют детектировать различные Г+ и Г-бактерии и вирусы в биологических жидкостях (с 2000-х гг.) [34]. 4 — Катионы Au3+ проникают в клетку Г-бактерий, формируют внутриклеточные НЧ и позволяют регистрировать ГКР примембранной области (2008 г.), тогда как из Ag+ формируются ГКР-активные экстраклеточные НЧ (2004 г.) [35]. 5 — Регистрация ГКР эритроцитов в смеси с коллоидным раствором (2009 г.) [36] и на серебряной наноструктурированной поверхности (2012 г.) [37] позволяет селективно исследовать примебранный гемоглобин. 6 — Помещение изолированных митохондрий на серебряную наноструктурированную поверхность позволяет селективно исследовать цитохром с (2015 г.) [38].

* — Спектр ГКР данной молекулы-репортера известен, а также известно, как он меняется в зависимости от ближайшего окружения молекулы.

Новые концепты

Следует заметить, что большинство стратегий ГКР-измерений на живых клетках представляют собой либо изучение распределения внутри клеток определенной чужеродной молекулы (например, какого-то лекарства), к которой пришиты НЧ. Но то же самое можно сделать и другими более распространенными методами — например, флуоресцентной микроскопией. К тому же внедрённая в клетку металлическая НЧ вряд ли менее токсична, чем флуорофор. Другой подход применения ГКР на живых клетках — регистрация спектров от собственных молекул клетки, например, от всех липидов и всех белков (пептидных связей), находящихся в плазматической мембране или в эндосоме, что тоже сужает круг возможных практических применений метода.

Основная сложность при работе методом ГКР — это необходимость комплексного междисциплинарного подхода. Помимо того, что нужно хорошо разбираться в объекте исследования, для каждого объекта нужны свои уникальные параметры регистрации спектров и самое главное — специальные наноструктуры. Поэтому, чтобы поставить хороший эксперимент, нужно знать и химию, и биологию. И вполне естественно, что любая успешная попытка зарегистрировать какой-то сигнал от биомолекулы — уже большое достижение.

Однако для исследования фундаментальных биологических процессов этого мало. Новый концепт исследований клеток методом ГКР был предложен в 2009-ом году сотрудниками нашей лаборатории Н.А. Браже с соавт. Они показали, что есть сигнал от молекул (собственных молекул клетки), которые находятся непосредственно под мембраной клеток, смешанных с коллоидным раствором наночастиц серебра [36].

И произошло это из любопытства, когда вместо того, чтобы смешать с НЧ серебра раствор гемоглобина, исследователи использовали суспензию эритроцитов — и получили при этом сигнал ГКР гемоглобина. Поначалу это казалось странным, ведь толщина мембраны эритроцита около 10 нм — это как раз то предельное расстояние, на котором может возникать усиление сигнала. Однако такое открытие было связано как с выбором частоты излучения (вспомним резонансное КР), так и с удачной морфологией агрегатов наночастиц серебра на поверхности эритроцитов, ведь от этого зависит расстояние, на котором происходит усиление сигнала КР, и в данном случае оно было заведомо больше 10 нм. А сам сигнал соответствовал не всему гемоглобину в клетке, а только тем молекулам гемоглобина, которые были вблизи мембраны — примембранному гемоглобину (рис. 8).

Срез эритроцита

Рисунок 8. Срез эритроцита в области контакта с НЧ. В эритроците есть два типа гемоглобина: цитоплазматический и примембранный (который составляет не более 0,5% от всего гемоглобина в клетке). Спектр КР эритроцитов — это спектр всего гемоглобина в клетке, точнее, того, которого больше (т.е. цитоплазматического). А спектр ГКР — это спектр того гемоглобина, который ближе к поверхности НЧ, т.е. примембранного гемоглобина. Этого гемоглобина так мало, что увидеть его конформацию другими методами in vivo невозможно. Рисунок из [36].

Но одной удачи далеко не достаточно. Несовершенством коллоидных растворов являлось уже то, что они все в некоторой степени токсичны для клеток и, кроме того, могут приводить к осмотическому шоку. И прошло более тех лет после первого наблюдения ГКР на эритроцитах, прежде чем совместно с группой материаловедов под руководством член-корр. РАН д.х.н. Гудилина Е.А. был разработан новый тип нетоксичных наноструктурированных поверхностей, позволяющих исследовать примембранный гемоглобин в интактных эритроцитах [37]. «Большинство работ, использующих метод ГКР в биологии, имеют описательный характер», — говорит к.б.н. Н.А. Браже. — «Но в идеале ГКР спектроскопия должна быть использована не только с маркерными целями, но и для проведения фундаментальных исследований функциональных изменений в структуре и свойствах молекул в клетках и тканях».

Избрав свою стезю фундаментального применения метода ГКР, учёные совершили следующее открытие в 2015-м году. Было обнаружено, что спектр ГКР целых функционирующих митохондрий — это спектр исключительно гема цитохрома с — мобильного переносчика электронов в митохондриях [38]. Его конформация постоянно изменяется во время работы (рис. 4б), и от этого зависит скорость электронного транспорта в митохондриях и, следовательно, эффективность обеспечения клеток энергией. Кроме того, определённое изменение конформации цитохрома с вызывает его выход из митохондрий, что запускает процесс апоптоза — запрограммированной клеточной гибели. Поэтому изучение такого фундаментального процесса как конформационные изменения цитохрома с представляет практический интерес. И это открытие означает, что можно изучать конформационные изменения такого важного белка в естественной «среде обитания», не выделяя его и не модифицируя, а просто помещая суспензию митохондрий на серебряную подложку и регистрируя спектр ГКР.

И в этом основная прелесть и новшество — теперь методом ГКР можно изучать молекулы, которые находятся непосредственно под мембраной живых клеток и мембранных органелл. При этом именно изучать их: исследовать изменения, которые с ними происходят в норме и при патологии.

Подводя итоги

Спектроскопия КР — это яркий пример метода, который обретает вторую жизнь с появлением новых технических возможностей. Благодаря различным модификациям КР, которые позволяют значительно усиливать сигнал, появилась возможность исследовать конформацию различных биомолекул в живых клетках и органах, что недоступно другим методам. А это значит, что с помощью КР мы каждый раз получаем принципиально новые знания о живой системе. Не в этом ли смысл науки?

Литература

  1. биомолекула: «Сверхпроводящие магниты и рецепторы биомембран: Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН»;
  2. Горелик В. (1997). Комбинационное рассеяние света. Соросовский образовательный журнал6, 91–96;
  3. Абатурова А.М., Багров Д.В., Байжуманов А.А., Бонарцев А.П., Браже А.Р., Браже Н.А. и др. Нанобиотехнологии: практикум / под ред. Рубина А.Б. — М.: Бином. Лаборатория знаний, 2012. — 384 с.;
  4. Li D.-W., Zhai W.-L., Li Y.-T., Long Y.-T. (2014). Recent progress in surface enhanced Raman spectroscopy for the detection of environmental pollutants. Microchimica Acta181, 23–43;
  5. Carey P.R. (1999). Raman spectroscopy, the sleeping giant in structural biology, awakes. J. Biol. Chem. 274, 26625–26628;
  6. Puppels G.J., de Mul F.F., Otto C., Greve J., Robert-Nicoud M., Arndt-Jovin D.J., Jovin T.M. (1990). Studying single living cells and chromosomes by confocal Raman microspectroscopy. Nature347, 301–303;
  7. Huser T. and Chan J. (2015). Raman spectroscopy for physiological investigations of tissues and cells. Adv. Drug Deliv. Rev. 89, 57–70;
  8. Ma J.G., Zhang J., Franco R., Jia S.L., Moura I., Moura J.J. et al. (1998). The structural origin of nonplanar heme distortions in tetraheme ferricytochromes c3. Biochemistry37, 12431–12442;
  9. Вересов А.Г. и Стрелецкий А.В. (2011). Спектроскопия комбинационного рассеяния. Словарь нанотехнологических терминов;
  10. Brazhe N.A., Treiman M., Brazhe A.R., Find N.L., Maksimov G.V., Sosnovtseva O.V. (2012). Mapping of redox state of mitochondrial cytochromes in live cardiomyocytes using Raman microspectroscopy. PLoS One7, e41990;
  11. Okada M., Smith N.I., Palonpon A.F., Endo H., Kawata S., Sodeoka M., Fujita K. (2012). Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 28–32;
  12. Harada Y., Dai P., Yamaoka Y., Ogawa M., Tanaka H., Nosaka K. et al. (2009). Intracellular dynamics of topoisomerase I inhibitor, CPT-11, by slit-scanning confocal Raman microscopy. Histochem. Cell Biol. 132, 39–46;
  13. Brauchle E. and Schenke-Layland K. (2013). Raman spectroscopy in biomedicine — non-invasive in vitro analysis of cells and extracellular matrix components in tissues. Biotechnol. J. 8, 288–297;
  14. Hattori Y., Komachi Y., Asakura T., Shimosegawa T., Kanai G.I., Tashiro H., Sato H. (2007). In vivo Raman study of the living rat esophagus and stomach using a micro-Raman probe under an endoscope. Appl. Spectrosc. 61, 579–584;
  15. Brazhe N.A., Treiman M., Faricelli B., Vestergaard J.H., Sosnovtseva O. (2013). In situ Raman study of redox state changes of mitochondrial cytochromes in a perfused rat heart. PLoS One8, e70488;
  16. Petrov D.V. (2007). Raman spectroscopy of optically trapped particles. J. Opt. A Pure Appl. Opt. 9, S139–S156;
  17. биомолекула: «Фолдинг "воочию"»;
  18. Chan J.W. (2013). Recent advances in laser tweezers Raman spectroscopy (LTRS) for label-free analysis of single cells. J. Biophotonics6, 36–48;
  19. Фишман А.И. (2001). Спектроскопия когерентного антистоксова рассеяния света. Соросовский образовательный журнал7, 105–110;
  20. Evans C.L. and Xie X.S. (2008). Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: Chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883–909;
  21. биомолекула: «Атомно-силовая микроскопия: увидеть, прикоснувшись»;
  22. биомолекула: «Миграция энергии плазмонного резонанса»;
  23. Kneipp J., Kneipp H., Wittig B., Kneipp K. (2010). Novel optical nanosensors for probing and imaging live cells. Nanomedicine6, 214–226;
  24. Fleischmann M., Hendra P.J., McQuillan A.J. (1974). Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode. Chem. Phys. Lett. 26, 2–5;
  25. Nabiev I., Morjani H., Manfait M. (1991). Selective analysis of antitumor drug interaction with living cancer cells as probed by surface-enhanced Raman spectroscopy. Eur. Biophys. J. 19, 311–316;
  26. Nabiev I., Chourpa I., Manfait M. (1994). Applications of Raman and surface‐enhanced Raman scattering spectroscopy in medicine. J. Raman Spectrosc. 25, 13–23;
  27. Sockalingum G.D., Beljebbar А., Morjani H., Angiboust J.F., Manfait M. (1998). Characterization of island films as surface-enhanced Raman spectroscopy substrates for detecting low antitumor drug concentrations at single cell level. Biospectroscopy4, S71—S78,
  28. Liang L., Huang D., Wang H., Li H., Xu S., Chang Y. et al. (2015). In situ surface-enhanced Raman scattering spectroscopy exploring molecular changes of drug-treated cancer cell nucleus. Anal. Chem. 87, 2504–2510;
  29. Guerrini L. and Graham D. (2012). Molecularly-mediated assemblies of plasmonic nanoparticles for Surface-Enhanced Raman Spectroscopy applications. Chem. Soc. Rev. 41, 7085–7107;
  30. Talley C.E., Jusinski L., Hollars C.W., Lane S.M., Huser T. (2004). Intracellular pH sensors based on surface-enhanced raman scattering. Anal. Chem. 76, 7064–7068;
  31. Kneipp J., Kneipp H., McLaughlin M., Brown D., Kneipp K. (2006). In vivo molecular probing of cellular compartments with gold nanoparticles and nanoaggregates. Nano Lett. 6, 2225–2231;
  32. Pissuwan D., Hobro А.J., Pavillon N., Smith N.I. (2014). Distribution of label free cationic polymer-coated gold nanorods in live macrophage cells reveals formation of groups of intracellular SERS signals of probe nanoparticles. RSC Adv. 4, 5536–5541;
  33. Willets K. (2009). Surface-enhanced Raman scattering (SERS) for probing internal cellular structure and dynamics. Anal. Bioanal. Chem. 394, 85–94;
  34. Liu T.Y., Tsai K.T., Wang H.H., Chen Y., Chen Y.H., Chao Y.C. et al. (2011). Functionalized arrays of Raman-enhancing nanoparticles for capture and culture-free analysis of bacteria in human blood. Nat. Commun. 2, 538;
  35. Jarvis R.M., Law N., Shadi I.T., O’Brien P., Lloyd J.R., Goodacre R. (2008). Surface-enhanced Raman scattering from intracellular and extracellular bacterial locations. Anal. Chem. 80, 6741–6746;
  36. Brazhe N.A., Abdali S., Brazhe A.R., Luneva O.G., Bryzgalova N.Y., Parshina E.Y. et al. (2009). New insight into erythrocyte through in vivo surface-enhanced Raman spectroscopy. Biophys. J. 97, 3206–3214;
  37. Semenova A.A., Goodilin E.A., Brazhe N.A., Ivanov V.K., Baranchikov A.E., Lebedev V.A. et al. (2012). Planar SERS nanostructures with stochastic silver ring morphology for biosensor chips. J. Mater. Chem. 22, 24530;
  38. Brazhe N.A., Evlyukhin A.B., Goodilin E.A., Semenova A.A., Novikov S.M., Bozhevolnyi S.I. et al. (2015). Probing cytochrome c in living mitochondria with surface-enhanced Raman spectroscopy. Sci. Rep. 5, 13793.

Автор: Никельшпарг Эвелина.

Число просмотров: 1687.

Creative Commons License — условия использования и распространения материалов сайта.
Вернуться в раздел «Технология»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.