биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


Миграция энергии плазмонного резонанса: вторая жизнь оптической спектроскопии

[29 ноября, 2007 г.]

Спектроскопия оптического поглощения — один из старейших методов физико-химического анализа биомолекул. Однако невысокие его чувствительность и пространственное разрешение не позволяют изучать процессы с участием низких концентраций белка. Учёным из Беркли удалось «продлить век» оптическому методу за счёт сопряжения его с другим принципом, применяемым в биофизических и биохимических исследованиях, — плазмонным резонансом. Оказалось, что в спектре упругого рассеяния на наночастицах золота, введённых в клетку, могут появляться специфические «провалы», соответствующие частотам, на которых поглощают некоторые биологические молекулы (например, металлопротеины). Исследователи называют этот эффект миграцией энергии плазмонного резонанса и объясняют его непосредственным взаимодействием частиц золота с адсорбирующимися на них молекулами белка. Предложенный метод обладает невиданной ранее чувствительностью: с его помощью можно определять если и не единичные молекулы белка, то, по крайней мере, их десятки.

Поверхностный плазмонный резонанс

Мы стояли на плоскости
С переменным углом отражения,
Наблюдая закон,
Приводящий пейзажи в движение.

Повторяя слова,
Лишенные всякого смысла,
Но без напряжения,
Без напряжения.
Б.Г.

Плазмон является квазичастицей, возникающей за счёт квантования плазменных колебаний, которые представляют собой коллективные колебания свободного электронного газа. Плазмоны играет большую роль в оптических свойствах металлов. Свет с частотой ниже плазменной частоты отражается, потому что электроны в металле экранируют электрическое поле в световой электромагнитной волне. Свет с частотой выше плазменной частоты проходит, потому что электроны не могут достаточно быстро ответить, чтобы экранировать его. В большинстве металлов, плазменная частота находится в ультрафиолетовой области спектра, делая их блестящими в видимом диапазоне. Поверхностные плазмоны сильно взаимодействуют со светом, приводя к образованию поляритонов. Они играют роль в поверхностном усилении рамановского (комбинационного) рассеяния света и флуоресценции [1].

Поверхностный плазмонный резонанс возникает на поверхности металла при условии полного внутреннего отражения и характеризуется специфическим углом отражения и, следовательно, показателем преломления. Этот эффект, возникая на поверхности металлической пленки, распространяется вглубь раствора, затухая экспоненциально как функция расстояния. Взаимодействия между молекулами изменяют затухающую волну, что приводит к изменению характеристик поверхностного плазмона, которые выражаются в изменении резонансного угла и показателя преломления в поверхностном слое. По изменению показателя преломления судят о взаимодействии биомолекул [2].


Оптическая спектрометрия позволяет изучать белки, обладающие оптической плотностью в видимом диапазоне электромагнитного излучения (хромопротеины) с помощью измерения поглощения света на определённых («характеристических» для конкретных молекул) длинах волн. Однако для таких измерений требуются довольно высокие концентрации белкá, да и пространственное разрешение этого метода весьма низкое (обычно изучают растворы молекул, находящиеся в спектрометрических кюветах, и речи о том, где именно в клетке расположены изучаемые молекулы, просто не идёт). Гораздо большей чувствительностью обладают методы, основанные на измерении флуоресценции (вместе с конфокальной микроскопией они позволяют определять месторасположение молекул внутри живой клетки), но тут необходимо модифицировать изучаемые молекулы специальными молекулами-метками, что не всегда желательно и возможно. Другой часто используемый в биологии метод — спектроскопия ядерного магнитного резонанса — также требует довольно больших концентраций белка и часто — изотопного мечения объекта, сложного в условиях живых систем.

Предлагаемая учёными из Беркли методика (статья опубликована в журнале Nature Methods [3]) основана на введении в живые клетки наноскопических частиц золота контролируемого размера (20–30 нм). Электроны на поверхности частиц из таких металлов как золото или серебро коллективно осциллируют в ответ на облучение светом определённой длины волны — это явление известно как плазмонный резонанс (см. врезку). Резонансные частоты этих наночастиц зарегистрировать намного легче, чем слабый (из-за очень низких концентраций) оптический сигнал от биологических молекул, что и позволяет проводить измерения.

Измерения основаны на явлении, называемом миграцией энергии плазмонного резонанса (введём аббревиатуру МЭПР), которое заключается в том, что молекулы белка, адсорбирующиеся на поверхности золотых частиц, как бы «оттягивают» на себя часть энергии плазмонного резонанса, что достаточно легко зарегистрировать по специфическим «провалам» в спектрах рассеяния, «снимаемых» с этих частиц. Главным условием этого эффекта является перекрывание частоты плазмонного резонанса и частот оптического поглощения белка, — требование, аналогичное тому, которое накладывается и в более широко известном методе резонансного переноса энергии флуоресценции (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET [4]). Именно этим условием и определяется то, что частицы состоят из золота, и их размер (частицы этого размера имеют пик плазмонного резонанса в области 530–580 нм, перекрывая диапазон поглощения цитохрома c, который был выбран для исследования). Предполагается, что механизм миграции энергии аналогичен таковому при миграции энергии флуоресценции (так называемое Фёрстеровское диполь-дипольное взаимодействие).

В установке, созданной учёными, наночастицы золота освещаются под определённым углом через фазово-контрастный конденсор. Изучаемым параметром является светорассеяние (на величину которого как раз и влияет плазмонный резонанс), регистрируемое цветной камерой и анализируемое с помощью спектрофотометра (см. рис. 1).

«Тушение» плазмонно-резонансного спектра, обусловленное миграцией энергии на адсорбирующиеся на поверхности наночастиц биомолекулы, проявляется в виде специфических «провалов» на спектрах рассеяния в диапазонах длин волн, совпадающих с пиками оптического поглощения молекул белка (рис. 1г). (Как уже говорилось, для эффективного переноса энергии необходимо, чтобы спектры рассеяния и поглощения перекрывались.) Поскольку такая резонансная миграция является прямым переносом, и, следовательно, происходит быстрее и эффективнее, чем оптическое поглощение, спектры МЭПР могут быть зарегистрированы обыкновенной оптической системой, что было бы невозможно при использовании «обычной» оптической спектроскопии.

Рисунок 1. «Тушение» плазмонного резонанса вследствие миграции энергии на биомолекулы. А. Схема установки. Б. Типичный спектр рэлеевского (упругого) рассеяния наночастиц золота. Для частиц размером 30 нм характерен пик на 530–580 нм. В. Типичный спектр оптического поглощения белка (цитохрома c). Характерные пики — 530 нм для окисленной формы (Fe III) и 525 нм и 550 нм для восстановленной (Fe II). Г. «Провалы» на спектре плазмонного резонанса (рассеяния), вызванные миграцией энергии на биомолекулу в диапазонах длин волн, соответствующих пикам оптического поглощения белкá.

Для проверки возможностей нового метода учёными был выбран цитохром c — металлопротеин, ассоциированный с внутренней митохондриальной мембраной. Основные его биохимические функции — перенос заряда как элемент дыхательной цепи и в некоторых случаях инициация апоптоза. Как переносчик заряда, цитохром c может находиться в двух формах: окисленной и восстановленной, отличающихся спектроскопически (см. рис. 2б). Будучи ковалентно присоединён к наночастицам золота, цитохром c модифицирует спектры рассеяния этих частиц: в зависимости от того, какая форма молекулы изучалась, на пике плазмонного резонанса наблюдались характерные «провалы» на частотах, соответствующих частотам поглощения цитохрома (см. рис. 2в,г). Молекулы линкера, с помощью которых цитохром присоединялся к частицам, не изменяли форму спектра рассеяния (рис. 2а).

Рисунок 2. Результаты экспериментов по измерению миграции энергии плазмонного резонанса с индивидуальной 30-нм наночастицы золота на молекулы цитохрома c. А. Спектр рэлеевского рассеяния наночастицы, модифицированной молекулами линкера (используется для ковалентной пришивки молекул цитохрома). Б. Спектры оптического поглощения окисленной и восстановленной форм цитохрома c (8 μМ). В,Г. Спектры рассеяния наночастицы, модифицированной (посредством линкера) окисленной и восстановленной формами цитохрома c. Пунктиром показаны характеристические частоты поглощения этих форм. На врезках: цветные микрофотографии рассеивающих наночастиц (длина нормировочного отрезка: 2 μм). (Дополнительный анализ, посвящённый точной идентификации спектральных «провалов», тут приводить не будем.)

То, что «провалы» на спектре обусловлены именно присутствием цитохрома c, было подтверждено электрохимическими методами, а то, что механизмом, ответственным образование спектральных «провалов», является именно резонансный перенос энергии, подтвердили:

  • ставя эксперимент на неметаллических частицах (тоже рассеивающих свет) — в их спектре рассеяния не наблюдается никаких провалов;
  • значительно увеличивая диаметр золотых частиц, смещая тем самым максимум спектра рассеяния в область 650 нм (уже не перекрывающуюся с диапазоном поглощения цитохрома) — делая «провалы» на левом «крыле» спектра практически незаметными и
  • модифицируя частицы золота не цитохромом, а синтетическими пептидами, не поглощающими свет в видимой области — и опять же, форма спектра рассеяния оставалась неизменённой.

Кстати, для исследований не обязательно брать именно золото: аналогичные эксперименты были проведены на серебряных наночастицах, взаимодействующих с гемоглобином (частота плазмонного резонанса серебряных частиц и полоса Соре гемоглобина (~407 нм) находятся в одной спектральной области). Если же использовать другие металлы, то можно изучать аналогичный эффект в ультрафиолетовой или ближней инфракрасной областях спектра — например, чтобы идентифицировать взаимодействие с нуклеиновыми кислотами или большинством белков, не поглощающих свет в видимой области.

Руководитель исследования — Люк Ли (Luke P. Lee), занимающий должности в двух калифорнийских университетах, — так отзывается о разработанной ими технологии: «До настоящего времени ещё не было придумано ни одной неразрушающей методики, способной дать информацию о биомолекулах на наноскопических масштабах в одной-единственной живой клетке. Существует надежда, что стволовые клетки помогут однажды против многих болезней, однако самое сложное в этой области — это понять, как именно дифференцируется клетка. Что происходит внутри неё, когда она развивается в клетку сердечной мышцы, а не в зубную эмаль или волос? Чтобы понять это, нам нужно повнимательнее „приглядеться“ к химическим сигналам, сопровождающим работу белков и генов в клетке».

Исследователи считают, что наиболее перспективная область использования нового метода (учитывая его беспрецедентную чувствительность и возможность применения в живой клетке) — это генетический анализ низко-копийных молекул РНК и продуктов экспрессии генов, редко включающихся в «нормальных» условиях и про работу которых почти ничего не известно. Кроме того, можно будет определять белки-спутники различных форм рака, токсины и вирусные частицы. «Наша работа „убивает сразу двух зайцев“», — говорит Ли. — «Мы одновременно на порядки уменьшили пространственное разрешение, необходимое для идентификации отдельных молекул, и смогли получить физико-химическую информацию об изучаемых молекулах — и всё это в живой клетке! В общем, использованные нами частицы золота похожи на „нано-звёзды“, потому что они освещают внутреннюю вселенную живой клетки» [5].

Список литературы

  1. Википедия: «Плазмон»;
  2. Wikipedia: «Surface plasmon resonance»;
  3. Liu, G.L., Long, Y.-T., Choi, Y., Kang, T., Lee, L.P. (2007). Quantized plasmon quenching dips nanospectroscopy via plasmon resonance energy transfer. Nature Methods, Published online: 18 November 2007 (в интернете);
  4. Wikipedia: «Fluorescence Resonance Energy Transfer»;
  5. ScienceDaily: “New Nanoparticle Technique Captures Chemical Reactions In Single Living Cell With Amazing Clarity”.

Автор: Чугунов Антон.

Число просмотров: 5950.

Creative Commons License — условия использования и распространения материалов сайта.
Вернуться в раздел «Технология»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Re: Миграция энергии плазмонного резонанса: вторая жизнь оптической спектроскопии

Полянский Антон — 29 ноября, 2007 г. 14:27. (ссылка) (свернуть ветвь)

Красивая технология. Приятно, когда исследователи так глубоко копают и ищут новые аспекты в уже, казалось бы, освоенных методиках. Оптическая спектроскопия уже используется лет сто, а до сих пор оказывается настолько мощным инструментом. Вообщем, молодцы - одно слово.

(ответить)

Re: Re: Миграция энергии плазмонного резонанса: вторая жизнь оптической спектроскопии

Kalnoi Sergei — 25 декабря, 2013 г. 16:18. (ссылка)

Вероятно, если поискать и испытать, могут обнаружиться новые пределы разрешения белок-белковых взаимодействий с позиций энергии и информативности (энергоинформации)биомолекулярных взаимодействий.У

(ответить)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.