В прибрежных океанических водах среди прочей планктонной мелюзги обитает одноклеточный эукариот Cafeteria roenbergensis. Жизнь кафетерии неспокойна — за ней то и дело охотятся гигантские вирусы семейства Mimiviridae. Они проникают в клетку, организуют там «вирусную фабрику», размножаются и выходят, убивая кафетерию. Но в микромире всё же есть справедливость: у этих мимивирусов есть свои враги — вирофаги семейства Lavidaviridae, которые при случае не брезгуют «рейдерским захватом» вирусной фабрики, останавливая тем самым воспроизводство гигантских вирусов и спасая кафетерий (рис. 1).

Бойцы, встройся!

Маттиас Фишер и Томас Хакл из Института медицинских исследований Макса Планка наблюдали за коинфекцией Cafeteria roenbergensis гигантским вирусом CroV и мавирусом [7]. Не все кафетерии смогли противостоять такой атаке, многие погибли. А 32% выживших изменились навсегда: мавирус проник в ядра клеток и встроил свой геном в их ДНК, став провирофагом. Ученые выбрали клон с самым сильным мавирусным ПЦР-сигналом и использовали его в дальнейших экспериментах (рис. 4а).

После секвенирования ДНК этого клона C. roenbergensis стало понятно, что геном эндогенного мавируса больше генома, представленного в GenBank, на длину дополнительных концевых инвертированных повторов (TIRs), идентичных друг другу на 99,7%. Фишер и Хакл выявили в геноме кафетерии 11 сайтов интеграции мавируса, один из которых детально охарактеризовали (рис. 4б).

Пятая колонна

Известно, что промоторы — регуляторные последовательности, необходимые для начала транскрипции, — мавирусных генов очень похожи на промоторы генов CroV. Поэтому ученые предположили, что заражение гигантским вирусом клеток кафетерии с уже интегрированным мавирусом может активировать экспрессию генов последнего. Для подтверждения предположения коллектив из Института Макса Планка с помощью количественной ОТ-ПЦР измерил уровень экспрессии пяти генов мавируса, трех генов CroV и одного клеточного гена в нулевой точке (сразу же после инфекции) и спустя 24 часа (рис. 5). Транскрипты CroV были обнаружены в зараженных им культурах через 24 часа после инфекции. Геном мавируса не экспрессировался в нормальных условиях и в момент инфекции CroV. Однако через 24 часа в зараженных гигантским вирусом клетках фиксировали большое количество мавирусных транскриптов. Так удалось установить, что CroV активирует экспрессию генома мавируса, причем ответственен за это, скорее всего, поздний транскрипционный фактор CroV, проникающий в ядро кафетерии (рис. 6).

Электронная микроскопия показала, что из разрушенных клеток в среду вместе с частицами гигантских вирусов выходят и мавирусы [7]. Репликация CroV, лизис клеток и количество частиц вируса в лизатах были сходными в культурах с интегрированным мавирусом и без него. А это означает, что активированный провирофаг не ингибирует размножение CroV и не предотвращает лизис инфицированных клеток. Однако ученые задались вопросом: если вирофаги никак не влияют на CroV, то зачем они таятся в клеточной ДНК? Может быть, им просто не хватает времени, чтобы проявить себя, поскольку синтезируются мавирусы лишь в поздней фазе цикла CroV?

Многоходовочка

Чтобы проследить за развитием отношений между вирусами, клетками и вирофагами, Фишер и Хакл взяли культуру кафетерий, не знакомых с мавирусом, и смешали ее с тремя видами лизатов:

• ложно инфицированных клеток (контроль);
• клеток без мавируса, инфицированных CroV;
• клеток с мавирусом, инфицированных CroV.

В первом лизате вирусов не было совсем, во втором присутствовал только CroV, а в третьем среди частиц гигантского вируса притаилась «пятая колонна» мавирусов [7].

На четвертый день эксперимента между исследуемыми культурами клеток C. roenbergensis уже проявись различия (рис. 7):

• в первом случае популяция кафетерий чувствовала себя хорошо и стабильно росла;
• во втором — CroV уже успел истребить треть кафетерий и, размножаясь, продолжал свое черное дело;
• в третьем же случае активированный мавирус подавил репликацию гигантского собрата, и популяция последнего в итоге сократилась на два порядка по сравнению со вторым случаем; при этом кафетерии выживали, и их количество практически не отличалось от контрольного [7].

Получается, что активированный вирофаг, смешавшись с популяцией CroV после первого заражения, в следующем раунде инфекции подавлял воспроизводство гигантского вируса и предотвращал его распространение. Для проверки этой гипотезы Фишер и Хакл провели эксперимент, в котором облучали частицы мавируса ультрафиолетом (λ = 254 нм) перед инфицированием. После такой обработки вирофаги бездействовали, и события развивались по типу обычной инфекции CroV [7].

Примечательно, что почти каждая клетка, зараженная CroV, погибала независимо от того, содержала она провирофаг или нет. То есть мавирус, скорее всего, останавливает распространение гигантского вируса, каким-то образом блокируя выход его вирионов из лизирующейся клетки. Как это происходит — пока не известно, но благодаря мавирусу поведение отдельных кафетерий соответствует альтруистической модели: они жертвуют собой, защищая соседей, а значит, и популяцию в целом от уничтожения вирусом CroV [7], [9].

Заключение

По мнению Евгения Кунина, эксперта NCBI в области биоинформатики и эволюционной биологии, использование кафетериями мавируса как защитного агента может быть одним из видов адаптивного иммунитета, хранящего память о прошлых инфекциях. У бактерий есть свой вариант — системы CRISPR-Cas , — где фрагменты ДНК бактериофагов (вирусов, поражающих бактериальные клетки) и плазмид сохраняются и используются для борьбы с повторной инвазией тех же молекулярных агентов. Не исключено, что кафетерии «хранят» эндогенных мавирусов как косвенную память об агрессоре, CroV. Косвенную — потому что провирофаг не содержит кусочки врага кафетерии, а просто активируется его транскрипционным фактором [9]. Если для протиста вторжение CroV — трагедия, то для мавируса — удачная возможность размножиться, а спасение популяции кафетерий будет скорее «побочным эффектом», хотя и вполне желательным — нельзя же вовсе без хозяина остаться...

Узнать, что собой представляет система CRISPR-Cas, можно из статьи «Просто о сложном: CRISPR/Cas» [10]. Об истории открытия и изучения этой системы рассказывает материал «CRISPR-эпопея и ее герои» [11]. — Ред.

Однако в случае системы CroV-мавирус не ясно, как клетки могут сохранять иммунологическую память, если инфекция CroV для них чаще всего смертельна. В системе CRISPR-Cas иммунологическая память предположительно формируется, когда бактерий атакуют дефектные фаги. От подобной неудачи при инфицировании кафетерий не застрахован и CroV. Кроме того, мавирус может проникать в клетку независимо от CroV, интегрироваться в ядерный геном и далее спокойно передаваться потомкам. Так приобретенный иммунитет может персистировать в популяции кафетерий [9].

Мавирус относится к классу Полинтон-подобных мобильных генетических элементов, которые могут интегрироваться в геномы разнообразных организмов. Обеспечивают ли защиту от вирусных инфекций и его родственники? Случайны ли для эукариотических геномов эндогенные вирусные элементы или клетка «специально» сохранила их в качестве иммунологической памяти? Пока вопросов больше, чем ответов, и основные исследования еще впереди [9].

Тем не менее отношения между C. roenbergensis, CroV и мавирусом иллюстрируют два фундаментальных биологических принципа:

• существование паразитов почти у всех реплицирующихся биологических объектов;
• использование альтруистических способов защиты, которые, вероятно, свойственны клеточной жизни вообще [9].

Литература

1. Википедия: Cafeteria roenbergensis (англ.);
2. Fenchel T. (1988). Marine plankton food chains. Annu. Rev. Ecol. Syst. 19, 19–38;
3. Изучен чрезвычайно крупный морской вирус. (2010). Сайт Nanonewsnet.ru;
4. Википедия: Cafeteria roenbergensis virus (англ.);
5. Fischer M.G. and Suttle C.A. (2011). A virophage at the origin of large DNA transposons. Science. 332, 231–234;
6. …А на блохе — блошиночка поменьше;
7. Fischer M.G. and Hackl T. (2016). Host genome integration and giant virus-induced reactivation of the virophage mavirus. Nature. 540, 288–291;
8. Krupovic M., Kuhn J.H., Fischer M.G. (2016). A classification system for virophages and satellite viruses. Arch. Virol. 161, 233–247;
9. Koonin E.V. and Krupovic M. (2016). A parasite’s parasite saves host’s neighbours. Nature. 540, 204–205;
10. Просто о сложном: CRISPR/Cas;
11. CRISPR-эпопея и ее герои.