...Хорошо помню тот день, когда весной 1963 года я впервые увидел атомную структуру белкá в трёх измерениях. На лекции, которую давал Макс Перутц в большом зале на Медицинском факультете Гарварда, присутствовало более тысячи слушателей. Всем раздали красно-зелёные стереоочки, а на экран, по высоте равный трём ростам Макса, спроецировали слайд со структурой миоглобина. После нескольких мгновений настройки и совмещения изображений, молекула выпрыгнула навстречу аудитории прямо через голову Перутца. По аудитории пронеслось ошарашенное “вау!”.

...Я часто спрашиваю — “Что, если мы будем знать (а мы обязательно будем!) структуры каждого белкá и каждой РНК, закодированных в геноме, и „пришпилим“ их, как бабочек в коллекции, в ряд. Узнаем ли мы тогда, как работают эти молекулы?”. Мы можем сравнивать их общность и различия, и даже строить эволюционные отношения, но вся эта таксономия не расскажет нам, как летает бабочка, что мне лично всегда представлялось намного более интересным вопросом.

В биологии функция определяется формой. А если рассмотреть эту максиму применительно к биохимии и биофизике, — биохимическая функция белкá определяется его строением (трёхмерной, или пространственной, структурой). Чтобы лучше понять функцию универсальных молекул, на которых основывается жизнь, и то, как они взаимодействуют между собой, необходимо знать их строение. В настоящее время известны последовательности геномов уже более чем 600 видов живых существ, и одно из них — человек [2]. (По оперативным данным, геномы отдельных людей (а не «обобщённый» геном Homo sapiens) уже начинают появляться как грибы после дождя [3].) Это разнообразие соответствует более чем шести миллионам известных последовательностей белков, занесённых в компьютерные базы данных. Пространственное же строение известно лишь для ничтожной доли от общего числа — для немногим более чем 55000 белков. (Более подробные данные можно найти в статье «Торжество компьютерных методов: предсказание строения белков» [4].)

Новые веяния в биологии, привнесённые в неё информационными технологиями и развитием компьютеров, основываются на каталогизации различной информации в базах данных, общедоступных через интернет. При этом прогресс инструментальных методов достиг уже того уровня, что позволяет многие исследования проводить «про запас», полностью покрывая какую-либо предметную область и занося результаты в базу «до востребования». Наглядный пример этому — геном человека [2], который, будучи прочитан благодаря совершенствованию высокопроизводительных технологий секвенирования ДНК [5], представляет из себя настоящие залежи информации, в которой ещё долгие годы будут разбираться тысячи исследователей.

Структурная геномика: общемировая инициатива

Логичным продолжением проекта по геному организма может стать проект по определению пространственной структуры всех кодируемых в ДНК белков и молекул РНК. Однако эта область принципиально более сложная, нежели секвенирование линейной молекулы, и задача определения трёхмерной структуры (и даже требуемой подготовки образца) не всегда поддаётся решению «на автомате». В то же время 3D-структуры белков весьма востребованы, поскольку, помимо интереса для фундаментальных исследований, они могут найти применение и в технологии, и в фармацевтике и медицине [6].

Общемировая инициатива, направленная на получение трёхмерных структур как можно большего числа белков, называется структурной геномикой (СГ; также её можно называть структурной протеомикой, — не путать с «обычной» протеомикой [7]). В этом направлении работают как «традиционные» лаборатории, где учёные «по старинке» определяют структуры тех биологических объектов, которые им интересны в данный момент, так и огромные современные центры, в которых структуры определяются «на потоке», по заранее составленному плану.

Уже было сказано, что экспериментально охарактеризовать пространственное строение белкá существенно сложнее, чем прочесть последовательность соответствующей нуклеиновой кислоты. Наиболее часто применяемые методы определения структуры — рентгеноструктурный анализ (РСА) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) — требуют выделения и очистки значительных количеств изучаемого белкá, а в случае РСА — нетривиальной процедуры кристаллизации, в результате которой белок перешёл бы в высокоупорядоченную форму («кристалл») и при облучении рентгеновскими лучами давал чёткую дифракционную картину. Но и всё это ещё не обеспечивает успеха. Кроме того, оборудование для ЯМР и РСА очень сложно и дорого.

Учитывая всё это, перед структурной геномикой стоит задача определения структуры не всех известных белков, а минимально возможного их числа, достаточного для подробной характеристики основных белковых семейств. Дело в том, что белки возникли не каждый сам по себе: они имеют общих эволюционных предшественников и часто сохраняют высокое сходство пространственного строения. В случае же, если известна структура родственного белкá, структуру интересующего нас часто можно предсказать на компьютере с приемлемой точностью [4]. Рассчитано, что, если задаться оптимальной стратегией выбора «мишеней» для экспериментального определения структуры (такой, чтобы в результате для >90% практически значимых белков был доступен хотя бы один гомолог с уровнем идентичности аминокислотной последовательности >30%), потребуется всего около 16000 структурных экспериментов [8], — что является уже вполне реалистичной цифрой. Само собой, при определении списка мишеней для реального проекта, будет иметь место определённая приоритезация: в первую очередь будут изучаться молекулы, ценные с практической точки зрения, — такие как фармацевтические мишени, важные для разработки новых лекарств [6].

В рамках идеологии структурной геномики на Земле действует много крупных центров, — в Японии, Израиле, Канаде, Европе, США. Они имеют разную специфику работы: одни занимаются в основном «лёгкими» бактериальными водорастворимыми белкáми, другие — эукариотическими, «конёк» третьих — мембранные белки. Программа в США, финансируемая американским Национальным институтом здравоохранения, носит название Protein Structure Initiative (PSI; программа по структурным исследованиям белков). Эта программа направлена не только собственно на исследования строения (результаты которых немедленно депонируются в общедоступную структурную базу Protein Data Bank), но и на совершенствование методик определения структуры, кристаллизации и экспрессии белков, делая протоколы и «материю» всех экспериментов общедоступными (см. врезку), — что также является одним из приоритетов проекта.

Проект PSI сейчас находится во второй фазе (1 июля 2005 г. — 30 июня 2010 г.), переход в которую был осуществлён по результатам экспертизы первой фазы (с сентября 2000-го), в результате которой было обнародовано >1000 структур белков. В рамках PSI-2 в США работают четыре высокопроизводительных центра, «выдающий» каждый по 100–200 новых структур в год, шесть специализированных центров, направленных на усовершенствование технологий, и два центра компьютерного моделирования. В настоящее время центры структурной геномики по всему миру выдают около 50% всех структур белков, из ~2/3 из них — заслуга американских PSI-центров [9], [10] (табл. 1).

Совершенствование экспериментальных методик выводит структурные центры на первое место как по скорости получения структур (к 2010 десятому году ожидается >4000 новых структур в рамках одной только PSI), так и по средним затратам на одну структуру: в центрах PSI это ≈$66 000, в то время как в «традиционных» лабораториях эта цифра составляет ≈$138 000 [9]. Однако следует особо отметить, что это касается, в основном, «простых» мишеней вроде водорастворимых бактериальных белков. Сложные же случаи, такие как знаменитая структура β₂-адренорецептора [11] или особые функциональные состояния белков (например, активация GPCR-рецепторов) [12], оказываются «не по зубам» поточной технологии, и по-прежнему исследуются в «традиционных» научных коллективах. В практическом смысле это может означать, в частности, что вклад структурной геномики в биологию и медицину оказывается существенно ниже, чем надеялись инициаторы программы.

Экскурсия в Объединённый Центр по Структурной Геномике

Объединённый Центр по Структурной Геномике (Joint Center for Structural Genomics, JCSG) — один из четырёх высокопроизводительных (ВП) центров по структуре белкá в рамках PSI — базируется в исследовательском институте Скриппса в Ла-Хойе (Калифорния). Кроме четырёх ВП-центров, в программе задействовано шесть специализированных, ориентированных на сложные или особо важные мишени (табл. 1), а также два центра, занимающиеся компьютерным моделированием [13].

Директор JCSG — Йен Вильсон (Ian Wilson, рис. 1) — считает, что сейчас настало как нельзя более благоприятное время для работы каких центров: «С учётом того, что новые последовательности ДНК продолжают накапливаться лавинообразно, перспективы для изучения структуры белков открываются просто фантастические» [13]. Ведущий биоинформатик JCSG — Адам Годзик (Adam Godzik) — так комментирует ситуацию: «Большинство крупных белковых семейств уже структурно охарактеризовано, но для около 70% общего числа семейств структурные данные всё ещё недоступны». Число потенциальных мишеней крайне велико, и перед исследователями встаёт вопрос: «какие семейства и каких их представителей выбрать для изучения?» [13].

Цель — вселенная белков

«Мы имеем дело с постоянно расширяющейся „вселенной белков“, так что для выбора конкретных мишеней требуются весьма чёткие правила», — говорит Вильсон. В PSI введён такой регламент: для каждого центра 70% мишеней определяется централизованно, через специальную комиссию PSI по выбору мишеней. В её задачи входит определение списка мишеней с учётом некоторой оптимальной стратегии, — чтобы число структур, на которые можно рассчитывать после завершения проекта (с учётом определённого процента неудач), оставаясь реалистичным, было всё-таки достаточно большим, чтобы «дать структурного представителя» большинству практически важных и интересных семейств белков. Оставшиеся 30% делятся пополам: 15% — на выбор самого центра и 15% — по предложениям сторонних исследователей, не занятых в программах по структурной геномике.

По словам Годзика, эффективнее всего получается, когда каждый центр сам решает, какой конкретный белок в «выданном» ему семействе исследовать экспериментально, поскольку в разных местах работают на разных наборах геномных ДНК. В JCSG именно Годзик и его команда биоинформатиков отвечает за этот выбор: сначала они составляют список гомологов в тех 100 геномах, ДНК которых у них «имеется в наличии», а потом с использованием собственных программ проводят эмпирическую оценку вероятности того, что тот или иной белок удастся успешно закристаллизовать. «Мы берём те мишени, для которых, по нашим предсказаниям, вероятность провала меньше всего, и с ними уже работаем дальше», — говорит Годзик.

Иногда случается, что ни один вариант не кажется достаточно надёжным. Однако с прогрессом технологий секвенирования ДНК [5] и развитием метагеномики (см. врезку) становится возможным преодолеть и эти препятствия: для каждого семейства непрерывно производится обновление списка мишеней, и это одна из причин, по которым структурные центры постоянно расширяют «ассортимент» доступных им геномов.

...и белки для всех

Центры по определению структуры белков хороши лишь настолько, насколько высокó качество и великó количество очищенных образцов белкá. Каждую неделю в JCSG получают 25–50 новых очищенных образцов, готовых к кристаллизации, — и чтобы достичь такой впечатляющей производительности, исследователям пришлось существенно модернизировать и оптимизировать существующие подходы.

В JCSG предложили оригинальную стратегию бактериальной экспрессии, основанную на ПЦР (полимеразной цепной реакции), которая позволяет клонировать тысячи вставок в векторы для экспрессии в кратчайшее время. Технология получила название PIPE (polymerase incomplete primer extension, — неполная полимеразная достройка праймера) — созвучно со словом «pipeline», обозначающим «конвейер». В этом подходе для амплификации векторов и вставок используются праймеры с перекрывающимися 5′-концами, которые затем могут быть объединены в одну смесь, используемую для трансформации бактерий с последующим скринингом посредством ПЦР с колоний [14].

Для простоты дальнейшей очистки продукта в начало гена белкá-мишени вставляют специальный «тэг» (метку высокоаффинной хроматографии), что позволяет сравнительно просто «выловить» нужный белок из смеси практически любого состава. После очистки на аффинной колонке этот тэг отщепляют по встроенному между ним и «настоящим началом» целевого белка сайту протеолитического расщепления, используя специальные ферменты-протеазы.

Для «черновой» оценки, нормально ли трансформированный штамм бактерий производит целевой белок, применяется метод сканирования микроэкспрессии. Менеджер команды по экспрессии и кристаллизации JCSG Марк Кнут (Mark Knuth) поясняет значимость этой технологии: «самое главное тут — толчок в нужном направлении, то есть на самых ранних стадиях понять, где экспрессия идёт, а где — нет». Метод микроэкспрессии позволяет очень точно и быстро предсказать успешную экспрессию нужного белкá в большом ферментёре JCSG (рис. 2), в 96 лунках которого происходит рост культур микроорганизмов прямо в 100-миллилитровых центрифужных пробирках. «Даже с учётом того, сколько пробирок мы можем установить в этот ферментёр, потери времени, связанные с тем, что экспрессия „не пошла“, были бы непростительны», — говорит Кнут.

Протоколы очистки тоже не стоят на месте: «мне представляется, что в нашем центре мы достигли определённой ступени совершенства в интенсивной ферментации, но зато мы меньше внимания уделяем очистке образцов», — признаётся Кнут. Используемая процедура состоит в очистке образца на никелевом композите с последующим отщеплением хроматографического «тэга» протеазой вируса табачной мозаики, и ещё одного раунда очистки на никеле. Дело в том, что в JCSG было замечено, что с точки зрения эффективности кристаллизации дальнейшее усложнение процедуры ничего не даёт, и было решено остановиться на этом, несколько «упрощённом» варианте.

Непосредственно перед попытками закристаллизовать очищенный образец его дополнительно характеризуют, чтобы убедиться в чистоте и правильности сбора фракций, — определяют масс-спектр и поводят гель-электрофорез.

Универсальные протоколы для экспрессии и очистки МБ пока не открыты, — по сравнению с растворимыми белкáми, для которых это уже стало рутинным моментом. Основной трудностью является то, что, будучи извлечёнными из своей нативной «среды обитания» (мембраны), МБ норовят денатурировать или агрегировать, после чего изучать их строение, очевидно, бессмысленно. Так что подходящие смеси детергентов и эффективные протоколы, позволившие бы провести мембранные белки через весь конвейер определения структуры, не теряя нативного состояния, ещё предстоит создать.

Однако самым сложным моментом в структурной геномике МБ является кристаллизация, что ещё более усложняет подбор детергентов. Часто для увеличения стабильности белкá или улучшения дифракционных качеств кристалла эксперимент проводят на генно-инженерных конструкциях, обеспечивающих большее число кристаллографических контактов, — как это было сделано, например, в случае β₂-адренорецептора [11].

Кристаллизация

Около 90% процентов белков в рамках программ PSI исследуется с помощью рентгеновской дифракции, и лишь ≈10% приходится на долю спектроскопии ЯМР. Последней, впрочем, отводится большáя роль во вспомогательных задачах: идентификации типа пространственной укладки, определении стабильности и взаимодействий белкá с другими молекулами (например, лигандами) и других.

«Подбор условий кристаллизации проводится специальной машиной, в которой четыре блока с набором из 96 „условий“ (всего 384 варианта) „прогоняются“ при двух разных температурах», — объясняет Марк Элслигер (Mark Elsliger), ответственный за эту часть «конвейера». Сама кристаллизация также роботизирована, — в ней нанолитровые объёмы растворов белков в различных средах и при разных условиях изучаются на предмет образования кристаллов, пригодных для изучения дифракции (рис. 3, видео 1). Спустя некоторое время плашки перемещаются в комнаты с температурой, поддерживаемой на уровне 4 °C или 20 °C на 28 дней под контроль автоматической системы видеонаблюдения за ростом кристаллов. Суммарная производительность центра — до 4000 96-луночных плашек с растущими кристаллами в месяц.

Но даже с учётом автоматизации, находящейся на грани фантастики, Элслигер отмечает, что как минимум с двумя операциями роботы не справляются: «Во-первых, довольно сложно „на глаз“ определить, в какой капле возник качественный кристалл, а второй сложный момент — это собственно сборка кристаллов». В висячей капле, внутри которой зарождаются (или не зарождаются:-() столь желанные белковые кристаллы, очень сложно что-либо разобрать, — из-за кривизны поверхности, неоптимального освещения и других оптических факторов.

В Объединённом Центре JCSG натренировали нескольких специальных людей, функцией которых является «уборка урожая», — аккуратное извлечение из капель около 2500 кристаллов в месяц, помещение их в специальные алюминиевые кассеты и отправка всего этого на север — на стэнфордский синхротрон (Stanford Synchrotron Radiation Laboratory), где происходит сбор данных по дифракции рентгеновских лучей.

Посмотрите, без рук!

В Стэнфорде прибывшую туда кассету с кристаллом белкá помещают в автоматическую систему для кристаллизации (Stanford Auto-Mounter; рис. 4), и на этом вмешательство людей практически кончается! «Этот проект — испытание пилотной версии очень сложной автоматической системы, которую можно использовать практически так же легко, как и кофеварку», — говорит Элслигер, обсуждая преимущества использования автоматизированной радиационной линии. (Другие высокопроизводительные центры также используют похожие системы.)

Фактически, вмешательство человека требуется только при замене кассеты, которую опускают в охлаждающий контейнер, соединённый с сосудом Дьюара (содержащим жидкий азот). Дальше роботизированная рука сама открывает контейнер, достаёт оттуда кассету и помещает её на пути сфокусированного рентгеновского луча. Исследователи в JCSG могут наблюдать всё это через интернет, что позволяет использовать отведение более эффективно, — почти 24 часа в сутки, за исключением коротких перерывов, когда нужно переставить кассету или заменить дьюар. Когда сбор данных оканчивается, автоматически запускается программа для первичной обработки структурных данных.

Далеко не из всякого кристалла удаётся получить структуру: около 50% кристаллов оказываются слишком мелкими, чтобы изучать дифракцию, и лишь около 50% внешне пригодных дают достаточно чёткую картину дифракции для определения трёхмерного строения. Но, несмотря на все трудности, JCSG «выложил» в базу PDB уже более 700 структур, и около 200 из них принадлежат к исходному списку 1269 «приоритетных» мишеней, определённому PSI в 2005-м.

«Из этих цифр можно заключить, что PSI уже хорошо „застолбила территорию“ по структурам белков, — улыбается Вильсон. — Результаты работы кажутся мне весьма обнадёживающими».

Экскурсию провели Натану Блоу, корреспонденту Nature Methods [13].

Заключение

Надо сказать, что далеко не все испытывают энтузиазм по поводу инициативы PSI, — достаточно посмотреть хотя бы на эпиграф, являющийся выдержкой из эссе [1], выпущенного в специальном номере журнала Structures, посвящённом PSI. Одной из основных концепций PSI, наиболее часто подвергающейся критике, является тезис о том, что достаточно иметь структуру достаточно близкого гомолога интересующего белкá, чтобы на компьютере, применяя идеологию сопоставительного моделирования [4], предсказать структуру той молекулы, которая нас интересует. По мнению оппонентов структурной геномики (по крайней мере, в первоначальном понимании её целей), никогда нельзя быть полностью уверенным в результате компьютерного моделирования, а если всё равно результат придётся проверять экспериментально, — зачем тогда зря тратить время и деньги? Лучше потратить то финансирование, которое получает PSI, на поддержку индивидуальных исследователей-структурщиков, считает Питер Мур (Peter Moore), один из ведущих специалистов по структуре рибосомы [17]. (Подробнее с его возражениями можно познакомиться в разделе «НеЗдоровый скепсис» статьи «Торжество компьютерных методов: предсказание строения белков» [4].)

На самом деле существенного противоречия между структурной геномикой и «традиционными» подходами к определению структуры нет: СГ позволяет всему научному сообществу накопить «багаж» структурных знаний по всем основным белковым семействам, с которыми исследователям приходится сталкиваться ежедневно, а также тем, с которыми ещё только предстоит начать работу. Структура из базы может послужить отличной отправной точкой, подарить идею хорошего эксперимента, — который будет проводиться уже с гораздо большей тщательностью и продуманностью, нежели может обеспечить автомат по очистке и кристаллизации белкá. Например, изучение особых конформационных состояний, — таких как активированная конформация рецептора, связанного с лигандами или эффекторными молекулами [12], — вовсе не входит в задачи структурной геномики, и поэтому является на 100% областью, в которой в обозримом будущем будет «вкалывать человек, а не роботы».

Или, например, проведение таких тонких экспериментов как определение структуры биомолекул в различных условиях, выборочно стабилизирующих совершенно различные, и при том функциональные конформации [18], — тоже задача, с которой автоматике в ближайшее время не справиться. То же самое касается и строения макромолекулярных комплексов, в состав которых входят десятки или даже сотни субъединиц, — «на автомате» такие задачи решить не удастся, и им обязательно найдётся место на обложках ведущих научных журналов. Ну и наконец, многие мишени оказываются просто «не по зубам» структурным консорциумам (см. строчку «работы прекращены» в таблице), — высокопроизводительные центры, фактически, проходятся «по верхушкам», получая структуры наиболее «лёгких», но не всегда самых интересных с практической точки зрения мишеней. Кстати, структурные работы, сделанные людьми (а не роботами ;-)), и цитируются значительно чаще, отражая больший вклад в биологию, сделанный их авторами [19].

Не следует относиться к технологии как к Святому Граалю, — чтобы избежать типичного обывательского разочарования, с которым часто можно столкнуться, например, обсуждая геномные технологии: «Ну, прочитали геном, и чего?» Действительно, чего? От всех болезней людей не вылечили, лишней пары рук не изобрели, только мышей светящихся понавыводили, да холодоустойчивые помидоры с генами лосося. Технология — а структурная геномика это, несомненно, всего лишь поставленная «на поток» технология, — очередной этап, который позволит более эффективно двигаться в бесконечном пути научного познания. А практические приложения нового знания долго ждать себя не заставят.

Литература

1. Thomas A. Steitz. (2007). Collecting Butterflies and the Protein Structure Initiative: The Right Questions?. Structure. 15, 1523-1524;
2. Геном человека: как это было и как это будет;
3. Скверный анекдот: негр, китаец и Крейг Вентер...;
4. Торжество компьютерных методов: предсказание строения белков;
5. 454-секвенирование (высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК);
6. Драг-дизайн: как в современном мире создаются новые лекарства;
7. Миллиард на протеомику;
8. Dennis Vitkup, Eugene Melamud, John Moult, Chris Sander. (2001). . Nat. Struct Biol.. 8, 559-566;
9. Stephen K. Burley, Andrzej Joachimiak, Gaetano T. Montelione, Ian A. Wilson. (2008). Contributions to the NIH-NIGMS Protein Structure Initiative from the PSI Production Centers. Structure. 16, 5-11;
10. Brian G Fox, Celia Goulding, Michael G Malkowski, Lance Stewart, Ashley Deacon. (2008). Structural genomics: from genes to structures with valuable materials and many questions in between. Nat Methods. 5, 129-132;
11. Новый рубеж: получена пространственная структура β2-адренорецептора;
12. Рецепторы в активной форме;
13. Nathan Blow. (2008). Structural genomics: inside a protein structure initiative center. Nat Methods. 5, 203-207;
14. Heath E. Klock, Eric J. Koesema, Mark W. Knuth, Scott A. Lesley. (2008). Combining the polymerase incomplete primer extension method for cloning and mutagenesis with microscreening to accelerate structural genomics efforts. Proteins. 71, 982-994;
15. Умелые руки: как доставить полипептид через мембрану?;
16. T. P. Roosild. (2005). NMR Structure of Mistic, a Membrane-Integrating Protein for Membrane Protein Expression. Science. 307, 1317-1321;
17. Peter B. Moore. (2007). Let's Call the Whole Thing Off: Some Thoughts on the Protein Structure Initiative. Structure. 15, 1350-1352;
18. Одна последовательность — одна структура: был ли Анфинсен неправ?;
19. J.-M. Chandonia. (2006). The Impact of Structural Genomics: Expectations and Outcomes. Science. 311, 347-351;
20. Johan Weigelt, Linda DB McBroom-Cerajewski, Matthieu Schapira, Yong Zhao, Cheryl H Arrowmsmith. (2008). Structural genomics and drug discovery: all in the family. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 32-39;
21. Jerónimo Bravo, Patrick Aloy. (2006). Target selection for complex structural genomics. Current Opinion in Structural Biology. 16, 385-392;
22. K. Lundstrom. (2006). Structural genomics for membrane proteins. Cell. Mol. Life Sci.. 63, 2597-2607;
23. Alexey Bochkarev, Wolfram Tempel. (2008). High Throughput Crystallography at SGC Toronto: an Overview. Methods in Molecular Biology. 515-521.