биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


Нано-pH-метр

[22 мая, 2009 г.]

За последнее десятилетие на волне повсеместного развития нанотехнологий исследователи создали массу прототипов «нанороботов» — это наноскопические моторы и шестерни, регуляторы и переключатели, работающие пока что в искусственно созданных условиях. Одним из перспективных материалов, пригодных для изготовления наномашин, является... ДНК. Индийские учёные использовали эту молекулу для создания сенсора кислотности среды, меняющего цвет флуоресценции в зависимости от pH раствора. Наиболее примечательным в разработке является то, что это первый пример автономной работы наноустройства не в искусственной среде, а внутри живой клетки.

Известным полуфантастическим сценарием конца света, связанным с бесконтрольным развитием нанотехнологий, является серая слизь, воплощающая в себе идею нанороботов, самореплицирующихся до полного истощения субстрата (в данном случае, всей пригодной для этого материи на Земле). В наши дни нанороботы уже начинают появляться, но вряд ли им будет позволено уметь самостоятельно размножаться — для них есть задачи и более приближенные к народному хозяйству. Перспективными направлениями применения нанороботов считают медицину (молекулярная диагностика и лечение онкологических и других заболеваний), промышленность (контроль и регуляция химических и технологических процессов) и военную отрасль (шпионаж, вооружение).

Но пока не только до «серийных» нанороботов, но и до полнофункциональных исследовательских образцов ещё очень далеко, и в лабораториях появляются лишь отдельные компоненты этих устройств, вряд ли способных поразить своей функциональностью праздную публику. Кроме того, несмотря на громкие заявления о медицинском применении нанороботов, бóльшая часть разработок тестируется в искусственных условиях, а не в живой клетке, что также оставляет массу вопросов об их реальном применении.

Индийские учёные из Института фундаментальных исследований TATA в Бангалоре первыми продемонстрировали работоспособность наноробота не «в пробирке», а в живой клетке. Разработанная ими машина представляет собой наносенсор pH — показателя кислотности растворов [1]. Оригинальность их разработки заключается в том, что рабочей молекулой является специальным образом сконструированная ДНК, меняющая конформацию в зависимости от кислотности раствора и, в соответствии с этим, длину волны (или, проще говоря, цвет) флуоресценции «пришитых» к ней молекул-флуорофоров. Описанная наномашина состоит из трёх олигонуклеотидов — двух «коротких» и одного «длинного», самопроизвольно собирающихся в рабочую конструкцию согласно принципу комплементарности оснований ДНК. Короткие олигонуклеотиды соединяются «встык» на матрице длинного, и оба имеют «висящие» концы, обогащённые цитозином, к которым на этапе синтеза дополнительно присоединяют флуоресцентные метки (см. рисунок). При повышении кислотности основания цитозина, обычно связывающиеся с гуанином, присоединяют протон и соединяются друг с другом в форме тетраплекса — и таким образом «висящие» концы наномашины «слипаются», образуя из «распрямлённой» конформации подобие треугольника. При этом расстояние между ними уменьшается, и интенсивность и длина волны флуоресценции, испускаемой молекулами-флуорофорами, изменяется за счёт резонансной миграции энергии флуоресценции (FRET), измеряемой в эксперименте.

Схема работы «pH-наносенсора» Сенсор состоит из трёх олигонуклеотидов: коротких O1 и O2 и длинного O3. O1 и O2 гибридизуются на смежные сайты на поверхности O3 с «зазором» в одно основание; также оба имеют «висящие» концы, обогащённые основаниями цитозина. В условиях повышения кислотности (до pH 5 по сравнению с «физиологическим» pH 7) цитозин протонируется, и «висящие» концы соединяются между собой, переводя всю наномашину из «распрямлённой» формы в вид «треугольника». При этом по спектрам флуоресценции присоединённых к «висящим» концам O1 и O2 флуорофоров можно сделать вывод о резонансном переносе энергии с эффективностью ≈55%, что соответствует расстоянию между метками ≈4 нм. Эта же закономерность использовалась для определения pH in vivo.


Вследствие резонансного переноса энергии флуоресценции с донора на акцептор, расположенных на разных «висящих» концах наномашины, регистрируемый цвет флуоресценции меняется с зелёного («распрямлённая» конформация при нейтральном pH 7) на красный («треугольник» при pH ~5). Регистрация флуоресценции позволяет точно определять pH в диапазоне 5.8–7 с достаточной скоростью, а «превращения» наномашины являются обратимыми (то есть, она подходит для повторных циклов измерений).

В этом месте можно задать вопрос, а не напоминает ли полученный результат стрельбу из пушки по нановоробьям, — ведь существуют и более точные и быстрые способы измерения pH в значительно более широком диапазоне (начиная со «школьного» лакмуса и заканчивая серийными pH-метрами)! Однако, кроме доказательства концептуальной работоспособности наномашин, результат индийских учёных имеет и серьёзное практическое применение — ведь сконструированное ими устройство может использоваться внутри живой клетки: ДНК, в отличие от многих pH-чувствительных органических красителей, не является токсичной. Кроме того, охватываемый диапазон (pH 5.8–7), хоть и выглядит узким, на самом деле является максимально «востребованным»: закисление цитоплазмы именно в этих рамках часто сопровождает различные клеточные процессы — от апоптоза до злокачественного перерождения.

«Измерения pH, проводимые с помощью сконструированного нами наноустройства, интересны не сами по себе», — говорит Ямуна Кришнан (Yamuna Krishnan), руководитель исследования. — «Что является действительно новым, — так это демонстрация работоспособности подобных наномашин внутри живой клетки» [2].

Измерение pH цитоплазмы клетки может говорить о многом — в частности, закисление сопровождает заражение клетки вирусами, эксплуатирующими механизм эндоцитоза, а также онкологическую трансформацию клетки. Работоспособность наномашины в клетке и её чувствительность к кислотности среды исследовали, доставив разработанные pH-чувствительные сенсоры в эндосомы клеток дрозофилы, «пришив» их к белку трансферрину, захватываемому клеткой внутрь в процессе эндоцитоза. С помощью конфокального микроскопа учёные проследили путь эндосом, которые через какое-то время превращаются в лизосомы, и сопровождающее этот процесс снижение pH («закисление» до pH 5).

Кроме очевидных преимуществ, которыми обладает основанная на ДНК система регистрации небольших изменений внутриклеточного pH, эта работа сигнализирует об определённой степени зрелости навыков «наноконструирования» и предвещает появление более изощрённых наноскопических устройств на службе общества.

«Живые системы»

Литература


  1. Modi S., Swetha M.G., Goswami D., Gupta G.D., Mayor S., Krishnan Y. (2009). A DNA nanomachine that maps spatial and temporal pH changes inside living cells. Nature Nanotechnology 4, 325–330;
  2. Новости Nature — «A tiny litmus test for cells».

Автор: Чугунов Антон.

Число просмотров: 680.

Вернуться в раздел «Новости»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.