биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


Невидимая граница: где сталкиваются «нано» и «био»

[8 февраля, 2010 г.]

В последние годы приставка «нано» стала известна даже тем, кто не имеет представления о её численном значении, а форсированное развитие нанотехнологий ставит вопросы, связанные с общественной безопасностью манипуляций с частицами, чей размер сопоставим с наиболее мелкими объектами в биологической иерархии наших организмов. Потенциал применения нанотехнологий в медицине огромен, но, как и пресловутая палка, обоюдоостр: за наноскопическим барьером скрываются не только чудеса, но и угрозы. Для адекватной оценки этих опасностей необходимо чётко представлять механизмы взаимодействий, возникающих в области непосредственного контакта искусственных наночастиц и клеток живого организма. Эта статья рассказывает о таких взаимодействиях и иллюстрирует потенциальную пользу и вред от использования нанообъектов в медицине.

Словарик


  • нано- — приставка системы Си, обозначающая множитель 10−9 (от греч. νανος — гном, карлик);
  • Нанотехнология — совокупность методов и приёмов, обеспечивающих возможность контролируемым образом создавать и модифицировать объекты, включающие компоненты с размерами менее 100 нм, и в результате этого получившие принципиально новые качества, позволяющие осуществлять их интеграцию в полноценно функционирующие системы большего масштаба («Концепция развития в Российской Федерации работ в области нанотехнологий на период до 2010 года»);
  • Интерфейс «нано–био». Несколько жаргонное слово «интерфейс» в рамках этой статьи обозначает область контакта двух систем или двух различных фаз. Интерфейс «нано–био» — это граница, разделяющая биологический структуры организма (мембрану, белóк, ДНК) и искусственные наночастицы, в него введённые;
  • Углеродные нанотрубки — протяжённые цилиндрические структуры (Ø 1–50 нм, длина — до нескольких см), состоящие из одной или нескольких свёрнутых (и химически замкнутых) в трубку гексагональных графитовых плоскостей (графенов);
  • Дендримеры — разновидность полимеров, отличительной чертой которых является очень большое число ветвлений (в отличие от белков, ДНК и большинства современных промышленных полимеров). Д. — приблизительно сферические наночастицы, в центре которых находится «корень» всей иерархии, вокруг которого слоями (соответствующими стадиям синтеза, или генерациям) располагается «крона»;
  • «Серая слизь» — гипотетический сценарий конца света, по которому неуправляемые (или вышедшие из-под контроля) самореплицирующиеся нанороботы поглотят всю биомассу Земли;
  • ζ-Потенциал (электрокинетический потенциал) — разность потенциалов, возникающая между диспергированной частицей и дисперсной средой в силу их взаимного перемещения. Является одной из важнейших характеристик двойного электрического слоя;
  • Эндоцитоз — захват клеткой внешнего материала, осуществляемый путём образования мембранных везикул. Типы Э.: фагоцитоз, пиноцитоз и рецептор-опосредованный эндоцитоз;
  • Рецептор-опосредованный эндоцитоз — Вариант Э., при котором рецепторы мембраны связываются либо с молекулами самого поглощаемого вещества, либо с лигандами, находящимися на его поверхности;
  • Эндосома — мембранная внутриклеточная везикула, образующаяся при слиянии и созревании эндоцитозных пузырьков;
  • Фагосома — Большáя внутриклеточная вакуоль, образующаяся вокруг поглощаемого фагоцитозом объекта;
  • Вторичная лизосома — продукт слияния лизосомы и фагосомы — служит «шлюзом» для проникновения веществ из фагосомы в цитоплазму клетки;
  • Аутофагия — процесс постадийного «самопереваривания», с помощью которого клетка избавляется от «клеточного мусора», то есть от повреждённых органелл и дефектных белков;
  • Трансферрины — белки плазмы крови, которые осуществляют транспорт ионов железа. Т. проникает в клетку путём рецептор-опосредованного эндоцитоза, связавшись со своим рецептором, расположенным в мембране. Т. широко используется как вектор для направленной доставки противораковых препаратов белков и генов внутрь опухолевой клетки, которая характеризуется повышенным уровнем экспрессии рецептора Т.;
  • Фармакокинетика — раздел фармакологии, изучающий химические и биологические процессы, происходящие с лекарственным средством в организме млекопитающего;
  • Биосовместимость — свойство вещества или материала, контактирующего с тканями живого организма, определяющее реакцию организма на этот контакт. Хорошая Б. означает отсутствие негативных реакций и иммунного ответа, плохая — иммунизацию, токсичность, отторжение;
  • Минимальная ингибирующая концентрация — наименьшая концентрация препарата, тормозящая рост тест-культуры;
  • Терапевтический индекс — характеристика лекарственного вещества, используемая для сравнения терапевтически активной дозы и дозы, при которой наступает токсичность. Количественно Т. И. равен отношению средней летальной дозы (LD50) и эффективной дозы (ED50);
  • Гемолиз — разрушение эритроцитов крови с выделением в окружающую среду гемоглобина. Часто используется как тест на токсичность различных веществ (например, антимикробных пептидов);
  • Гематоэнцефалический барьер — это гистогематический барьер между кровью, с одной стороны, и цереброспинальной жидкостью и нервной тканью — с другой. Г. Б. — физиологический «фильтр», регулирующий обмен веществ между кровью и тканями мозга;
  • Ретикулоэндотелиальная система — совокупность всех встречающихся в организме фагоцитов (макрофагов + моноцитов). РЭС обеспечивает защиту организма от микробной инфекции и удаление старых клеток крови из циркулирующего кровотока.

Если бы, — говорит, — был лучше мелкоскоп, который в пять миллионов увеличивает, так вы изволили бы, — говорит, — увидать, что на каждой подковинке мастерово имя выставлено: какой русский мастер ту подковку делал.

Н. Лесков «Левша».


Оглавление

Предвестником того, что в наши дни называется нанотехнологией, часто считается знаменитый доклад Ричарда Фейнмана «Там внизу много места» («There’s Plenty of Room at the Bottom»), сделанный им в Калифорнийском технологическом институте на ежегодной встрече Американского физического общества в 1959 году. В 1980-х годах термин «нанотехнология» активно использовался Эриком Дрекслером, известным идеологом расширения горизонтов техносферы с использованием возможности манипуляций нанообъектами.

В последние годы в России нанотехнологии стали притчей во языцех, и сама приставка «нано-» даже стала частенько использоваться с определённым оттенком издёвки, отражающим несколько нездоровый ажиотаж, раздуваемый государственными корпорациями в этой сфере исследований. Но общественное мнение и правительственные тендеры сами по себе, а нанотехнологии всё же, бесспорно, являются мощнейшей парадигмой, заключающей в себе новый технологический уклад, который в будущем, несомненно, станет основой очередной пост-постиндустриальной революции.

Что же нанотехнологии могут предложить обществу, если отвлечься от сугубо фундаментальных научных исследований? Если перечислять очень кратко, то это и материалы с необычными свойствами (наноматериалы), и наномедицина и фармацевтика, обещающие не только принципиально новые средства диагностики, но и мощную платформу для лечения многих заболеваний, и электроника, и новые приборы и методы исследований, и новый подход к робототехнике, и системы вооружения, и многое другое. Отдельно стоит отметить область так называемых нанобиотехнологий, которой предрекают стать революционной в здравоохранении [1]. Наночастицы начали в массовом порядке применяться и в косметических составах — чаще всего, в солнцезащитных кремах, кондиционерах и лосьонах. В рунете уже появилось множество сайтов, очень подробно освещающих достижения и перспективы нанотехнологий.

Само собой, ни один принципиально новый инструмент, как и оружие, не может сам по себе работать только во благо человечества. Нанотехнологии несут в себе наряду с неслыханными возможностями и потенциальные угрозы, под определённым углом выглядящие тем более устрашающими, поскольку про них (угрозы) очень мало известно. Даже если оставить в стороне «страшилку» под не очень приятным названием «серая слизь» (тоже введённую в обиход Дрекслером) и рассмотреть проблему беспристрастно, нанотехнологии могут таить много опасностей, обезопаситься от которых можно, только основательно их изучив.

Дело в первую очередь в том, что искусственно созданные нанообъекты обладают свойствами, не существовавшими в природе ранее или не встречавшимися в определённом контексте (например, в организме человека). Поскольку организм состоит из сложным образом организованных молекул, на определённом уровне его вполне правомочно описывать в терминах нанообъектов (таких как, например, рибосома, скользящая по нити мРНК или везикулы, перемещающиеся внутри клетки по «канатам» цитоскелета). Возможная опасность искусственных наночастиц связана с тем, что они могут начать взаимодействовать с естественными нанообъектами непредсказуемым образом. Какое, например, действие оказывают дисперсии наночастиц на организм человека при длительном контакте с ними? Или как отразится на работе клетки попадание в межклеточную среду углеродных нанотрубок?

Этот обзор посвящён рассмотрению явлений, возникающих в области контакта искусственных нанообъектов с биологическими системами («интерфейс „нано–био“»), а также физических, физико-химических и биологических эффектов, сопровождающих эти взаимодействия. В заключение будут даны примеры болезнетворного и лечебного влияния нанообъектов на организм человека, которые подтверждают, что окончательный эффект зависит не от самих нанотехнологий, а от умения пользоваться ими в своих интересах. (И будем надеяться, что «свои» интересы и интересы человечества — это одно и то же ;-)

Зона контакта между «нано» и «био»

Коллоидный по своей природе, интерфейс нано–био подразделяется на три динамические компоненты: (1) поверхность самой наночастицы, свойства которой определяются размером и физико-химическими параметрами; (2) интерфейс «твёрдое–жидкость» между наночастицей и окружающей средой и (3) собственно интерфейс нано–био — область, где наночастица взаимодействует с биологическим объектом. Наиболее важные характеристики, определяющие поверхностную активность — химический состав частицы, наличие функциональных химических групп на поверхности, форма и радиус кривизны поверхности, её гетерогенность и пористость, а также гидрофильность / гидрофобность (более подробно — на рис. 1).

Рисунок 1. Пример организации интерфейса «нано–био»: наночастица и липидная мембрана [23]. Основные эффекты являются следствием физико-химических свойств поверхности частицы и модификации этих свойств вследствие контакта с окружающей средой и биологическим объектом. Схематично показаны некоторые процессы, протекающие на поверхности наночастицы. На свойства интерфейса нано–био оказывают влияние следующие факторы:


  • Свойства наночастицы: Размер, форма и площадь поверхности. — Поверхностные заряд и энергия, изрезанность и пористость. — Валентность и проводимость. — Функциональные группы. — Кристалличность и наличие дефектов. — Гидрофильность / гидрофобность;
  • Качества окружающей среды: Молекулы воды. — Кислоты и основания. — Соли и мультивалентные ионы. — Растворённые органические соединения. — Сурфактанты. — Полиэлектролиты;
  • Интерфейс твёрдое–жидкое: Гидратация и дегидратация поверхности. — Реструктуризация поверхности и высвобождение свободной энергии. — Адсорбция зарядов и органических молекул. — Образование двойного электрического слоя, ζ-потенциал, изоэлектрическая точка. — Электростатические и электростерические взаимодействия. — Агрегация, дисперсия и растворение. — Гидрофильные и гидрофобные взаимодействия;
  • Интерфейс нано–био: Специфические и неспецифические взаимодействия с мембраной. — Взаимодействия рецептор–лиганд. — Обволакивание мембраной (инициирующие и блокирующие факторы). — Взаимодействия с биомолекулами (липидами, белкáми, ДНК), ведущие к структурно-функциональным эффектам. — Перенос свободной энергии на биомолекулы и их окислительное повреждение. — Конформационные изменения биомолекул. — Повреждение митохондрий и лизосом.

В отличие от довольно хорошо изученных коллоидной химией «обычных» поверхностей раздела твёрдое–жидкое, соответствующий интерфейс в случае наночастиц в биологическом окружении представляет собой существенно нестационарную систему. Тут уже не действуют формулы для расчёта заряда, изоэлектрической точки, среднего размера агрегатов и других величин, полученные для случая равновесия. Принципиальная нестационарность и негомогенность интерфейса нано–био обусловливается сложной структурой белково-углеводно-липидного матрикса мембраны и постоянно меняющимся из-за клеточной секреции и потоков тканевых жидкостей составом окружающей среды. Эти изменения могут повлечь модификацию свойств поверхности наночастицы, а наночастица, в свою очередь, может повлиять на химический состав среды, частично растворяясь в ней или катализируя различные окислительные процессы и генерацию активных форм кислорода (АФК) (см. рис. 1).

Рисунок 2. Взаимодействия между наночастицами [2]. При суспендировании наночастиц в биологических жидкостях и столкновении с биологическими объектами в ход идут как «обычные» коллоидные силы (такие как электростатика и силы ван-дер-Ваальса), так и другие важные взаимодействия: эффект растворителя (сольватация), гидрофобный эффект и осмотическое обеднение среды при участии неадсорбирующихся молекул. Взаимодействие «простых» коллоидных частиц изучает теория ДЛФО (название происходит от фамилий Дерягина, Ландау, Фервея и Овербека).

При захвате наночастицы внутрь клетки, она встречается со всё новыми и новыми интерфейсами — уже внутриклеточными. Детальная характеризация процессов и действующих сил на этих границах разделов может стать — и уже становится — основой новых высокоточных методов биологических исследований.

Силы, формирующие интерфейс нано–био

На первый взгляд может показаться, что в случае наночастиц в биологической системе действуют все те же силы, что и в классических задачах коллоидной химии. Действительно, тут работают и силы ван-дер-Ваальса, и электростатика, и влияние растворителя, и гидрофобный эффект. Однако требуется существенная корректировка предпосылок с учётом наноскопического масштаба происходящего и наличия в системе биологических объектов. Особенность наносистем заключается в том, что они содержат сравнительно небольшое число атомов, и характер взаимодействия между частицами будет существенно зависеть от их взаимной ориентации и диэлектрической проницаемости (см. рис. 2). Чтобы подчеркнуть био особенности интерфейса нано–био, можно сравнить силы, связывающие две взаимодействующие наночастицы SiO2, и силы между такой же частицей SiO2 и живой клеткой (например, фибробластом).

Две неорганические наночастицы SiO2 в растворе притягиваются под действием сил ван-дер-Ваальса и расталкиваются электростатическим взаимодействием, поскольку поверхности обеих частиц в растворе ионизуются и получают отрицательный заряд. (В биологических жидкостях, имеющих ионную силу порядка 150 мМ, электростатические взаимодействия могут быть экранированы за счёт диэлектрической проницаемости.) Существенную роль играют также сольватационный и гидрофобный эффекты. Эти явления довольно хорошо изучены в коллоидной теории ДЛФО (см. рис. 2, табл. 1).

В случае взаимодействия с фибробластом действующие силы остаются в принципе те же, только существенно меняется конфигурация системы. Прежде всего, мембрана может деформироваться и постоянно меняет форму, что сразу уводит нас очень далеко от решения задачи из учебника. Дополнительную сложность привносит «лоскутная» гетерогенная организация мембраны, в которой и белки, и липиды образуют «островки» (рафты). Ну и, конечно, самое главное отличие — что клетки не являются пассивным объектом из учебной задачи: они постоянно транспортируют ионы, секретируют белки, меняют форму, — словом, образуют с наночастицей динамический интерфейс. Окончательно отказаться от попытки теоретически моделировать эти процессы заставляет возможность эндоцитоза — «захвата» наночастицы внутрь клетки.

Таблица 1. Основные силы, возникающие в области взаимодействия нанообъектов и биологических систем [2]
СилаПрирода возникновенияДальность (нм)Вклад в структуру интерфейса
Гидродинамические силыКонвекционные потоки, деформация и броуновская диффузия в наноскопических интерфейсах часто затруднены или, наоборот, усилены102–106Увеличение частоты столкновений между частицами
Электродинамические взаимодействияВан-дер-Ваальсовы силы между взаимодействующими частицами и средой

1–100

В водных растворах всегда обусловливают притяжение; в биологической среде сила взаимодействия уменьшена
Электростатические взаимодействияЗаряженные поверхности притягивают противоионы и отталкивают ионы того же заряда, формируя двойной электростатический слой1–100Перекрывающиеся двойные слои в большинстве случаев расталкиваются, поскольку поверхности большинства материалов в растворе ионизуются отрицательно; в случае противоположных зарядов возможно притяжение
Эффекты растворителя и гидрофобный эффектГидрофильные материалы выгодно взаимодействуют с растворителем1–10Гидрофильные материалы стабильны в растворе и не агрегируют
Гидрофобные материалы «стараются» экранироваться от растворителяГидрофобные материалы спонтанно выпадают из раствора, образуя нерастворимые агрегаты, оседающие на интерфейсе
Пространственные (стерические) взаимодействияПолимеры, адсорбировавшиеся на поверхности неорганических наночастиц или биополимерной оболочке клетки, «расталкиваются» с другими интерфейсами1–100В целом увеличивают стабильность частиц, но возможны эффекты типа эндоцитоза, особенно в случае «укрывания» водорастворимым полимером
Полимерные мостикиПолимеры с заряженными группами, адсорбировавшиеся на поверхности неорганических наночастиц или биополимерной оболочке клетки, могут притягиваться к участкам противоположно заряженных поверхностей1–100В целом увеличивают агрегацию, особенно при наличии в полимере карбоксильных групп, а в растворе — ионов кальция

В итоге мы имеем дело с практически бесконечным числом разновидностей «интерфейсов» между наночастицами и биологическими объектами, поскольку наночастицы отличаются и геометрическими параметрами, и физико-химическими, и кристаллическими свойствами. (Последние, кстати, тоже очень интересны, поскольку могут придавать материалам необычные фотонные, электронные, полупроводниковые или каталитические свойства.) Изучить в отдельности для каждого типа частиц особенности взаимодействия с биологическими системами совершенно невозможно, так что более глубокое понимание механизмов этих взаимодействий необходимо для успешного дизайна наноматериалов будущего.

Рисунок 3. Взаимное влияние белковой «короны» и наночастицы [2]. Белковая «корона» — первый из интерфейсов нано–био, в котором участвует наночастица, попавшая в организм. Хотя «корона» определяет дальнейшую «судьбу» наночастицы, но и сами белки модифицируются при контакте с частицей. А. Динамический состав «короны» зависит от констант ассоциации/диссоциации, процессов конкурентного связывания, стерических факторов, влияющих на адсорбцию, и состава биологической жидкости, в которой находится наночастица. Б. Варианты модификации структуры и функций белков, вызываемые взаимодействием с наночастицами. В некоторых случаях такие взаимодействия изменяют конформацию белкá, — например, лизоцим из куриного яйца «теряет» α-спираль, необходимую для его каталитической активности. Разноцветные фигурки обозначают разные типы белков: заряженные, гидрофобные, конформационно лабильные, каталитически активные с окисляемыми тиольными группами и образующие фибриллы.

Белковая «корона»

Ещё одной важной особенностью биологического окружения является то, что наночастицы, попав в кровь, лимфу, желудочный сок или любую другую биологическую жидкость, покрываются своего рода «короной» — слоем белков, всё время находящихся в растворе и адсорбирующихся на поверхности частицы. Как следствие взаимного влияния, и свойства частиц меняются под действием «короны», и сами белки, с которыми частица вступает в контакт, могут подвергаться модификациям (рисунок 3).

Отдельно следует заметить, что процесс формирования «короны» зависит от «предыстории» частицы, поскольку она уже может содержать адсорбированные молекулы — будь то остатки от производственного процесса, атмосферные газы, промышленные стабилизаторы эмульсий / дисперсий или вещества из состава буферов, используемых для приготовления растворов наночастиц. Контакт частиц с белкáми короны является первым типом интерфейса нано–био на длительном пути наночастицы внутри живого организма.

Основные белки, образующие «корону» наночастиц — например, нанотрубок, частиц диоксида железа, липосом и наногранул полимеров — это альбумин, иммуноглобулины, факторы комплемента, фибриноген и аполипопротеины. Укрывание наночастиц этими белкáми во многом определяет их дальнейшую судьбу — распределение между тканями и органами, скорость выведения из организма, опсонизацию (фагоцитоз с участием рецепторов мембраны).

Белки и другие органические вещества увеличивают растворимость наночастиц (например, ZnO, CdSe, оксидов железа и алюминия), но и наночастицы могут влиять на белковые молекулы, заставляя их агрегировать, окисляя боковые группы, снижая ферментативную активность или изменяя их конформацию. Это обстоятельство уже вызывает определённые опасения — ведь то, что в лабораторном эксперименте наночастицы оксида церия вызывают образование фибрилл микроглобулина β2, может означать, что в определённых условиях возможен аналогичный процесс и в организме человека, — например, в мозгу это приведёт к развитию болезни Альцгеймера. (На настоящий момент, впрочем, нет ни одного свидетельства, что наночастицы как-то участвуют в развитии нейродегенеративных заболеваний.)

Захват наночастиц биомембранами

Контакт наночастиц с биологическими мембранами нередко заканчивается захватыванием первых внутрь клетки с помощью ряда механизмов — рецептор-опосредованных или не связанных с рецепторами. (Кстати, этот феномен обещает большие перспективы для направленного транспорта лекарств [4].) Захват («обволакивание» мембраной) требует образования как специфических, так и неспецифических взаимодействий с мембраной, и является результатом динамического противостояния механизмов захвата частицы и процессов, препятствующим этому. Модификация поверхности частицы особыми лигандами, стимулирующими рецептор-опосредованный эндоцитоз [5], — пример такого механизма (рисунок 4).

Проникновение внутрь клетки возможно и без участия рецептора: например, наночастицы, модифицированные определёнными амфифильными группами, могут сами проникать через мембрану, нисколько её при этом не повреждая. Схожий механизм используют и амфифильные пептиды-переносчики или поликатионные полимеры, которые могут использоваться для направленной доставки частиц в клетку.

Существует минимальный радиус частицы, при котором она может быть захвачена внутрь клетки, и «оптимальный» радиус, при котором захват происходит с максимальной эффективностью. Для сферических и цилиндрических частиц такие оптимальные размеры равны 15 и 30 нм, соответственно, но для наночастиц, «укрытых» слоем трансферрина, этот радиус составляет ~50 нм. (Трансферрин активно используется для доставки соединений с плохой фармакокинетикой [5].)

С точки зрения чистой термодинамики среди частиц одного объёма легче всего должны захватываться сферы, но на практике во многих случаях оказывается, что другие формы — как, например, цилиндрические частицы гидрогеля полиэтиленгликоля — захватываются с большей скоростью. Однако макрофаги, старающиеся «проглотить» все чужеродные частицы при помощи фагоцитоза, наоборот, часто упускают длинные цилиндрические образования из виду: наверное, поскольку такая форма не встречалась до эры искусственных наночастиц, «тканевые стражи» оказываются сбитыми с толку.

Рисунок 4. Захват наночастицы мембраной клетки [2]. Для осуществления захвата должны образоваться специфические (лиганд–рецептор) и неспецифические (гидрофобные, кулоновы) взаимодействия. Высвобождающаяся при этом свободная энергия служит для «противоборства» силам, препятствующим захвату частицы:

  • Обеспечивают «захват»: Специфическое связывание рецептор–лиганд. — Неспецифические взаимодействия с мембраной. — Высвобождение свободной энергии в месте контакта. — Оптимальные размер и форма частицы. — Энергозависимые механизмы мембраны и цитоскелета (например, формирование клатриновой «сетки»);
  • Препятствуют «захвату»: Эластичность мембраны. — Температурные флуктуации мембраны. — Скорость диффузии рецепторов. — Прочность и эластичность взаимосвязи рецептор–лиганд.

Учитывая, с одной стороны, бóльшую эффективность захвата внутрь клетки, а с другой — меньшую вероятность фагоцитоза, оказывается, что для направленной доставки в клетку лучше всего подходят не сферические, а именно цилиндрические (или дискообразные) частицы, которые лучше ещё тем, что проще проходят через просвет капилляров.

Углеродные нанотрубки также обладают цилиндрической формой. Если говорить о достаточно длинных (>20 μм) и жёстких (многослойных) нанотрубках, то их присутствие в ткани как раз вызывает «сбои» в поведении макрофагов. Эти клетки оказываются неспособными «проглотить» такую большую частицу и лишь выбрасывают в среду токсичные формы кислорода (АФК) и гидролитические ферменты, вызывая хроническое воспаление. И хотя для нанотрубок пока не существует однозначных доказательств, в принципе они могут вызывать развитие мезотелиомы, поскольку асбестовая пыль приводит к этому типу опухоли по весьма схожему механизму. В таблице 2 приведены данные по возможным механизмам токсичности разных типов наночастиц, а также область их использования — если удастся токсичность преодолеть.

Таблица 2. Механизмы цитотоксичности различных наноматериалов и приёмы, потенциально позволяющие достичь безопасного применения [2]
НаноматериалПрименениеМеханизм цитотоксичностиПриёмы, потенциально позволяющие избежать токсичности
TiO2УФ-фильтр в защитных кремах от солнцаПродукция АФК. — Истощение пула глутатиона и окислительный стресс из-за фотоактивности. — Образование фибрилл белков. — Разрушение мембраныКэпирование сурфактантами, полимерами или лигандами. — Покрытие низкомолекулярными антиоксидантами (аскорбатом, глутатионом, тиолами) или ферментами-антиоксидантами (например, супероксиддисмутазой)
ZnOУФ-фильтр в защитных кремах от солнцаПродукция АФК. — Растворение и выделение токсичных катионов. — Повреждение лизосом. — Воспалительные реакцииПокрытие наночастиц инертными материалами
AgДиагностика рака, ДНК-диагностика. Антибактериальная обработка ран. Лечение атопического дерматитаРастворение и выделение Ag+ ингибирует ферменты клеточного дыхания и синтез АТФ. — Продукция АФК. — Разрушение мембраны и нарушение транспорта
Наночастицы AuДиагностика рака, ДНК-диагностика. Инертная основа для других наночастиц. Фототермическая терапияНарушение конформации белковПодбор размера, заряда и гидрофобных свойств
CdSe«Квантовые точки»: флуоресценция с параметрами, контролируемыми размером частиц. «Нано-штрихкоды»Растворение и выделение токсичных ионов Cd и SeПокрытие токсичного ядра биосовместимыми полимерами или неорганической оболочкой
SiO2ДНК- и РНК-анализаторы (нуклеиновые кислоты «пришивают» к поверхности частиц)Продукция АФК из-за дефектов поверхности. — Нарушение сворачивания белков. — Разрушение мембраныСтимулирование агрегации частиц. — Подбор размера и/или заряда. — Модификация поверхности лактатом алюминия или поливинилпиридин-N-оксидом
Fe3O4Визуализация опухолевых процессовПродукция АФК и окислительный стресс. — Выделение токсичных ионов Fe2+. — Нарушение трансмембранного транспортаМодификация поверхности биосовместимыми материалами. — Покрытие полимерами (альгинатом, хитозаном)
CeO2Защита от окислительного стресса и радиационного поврежденияАгрегация белков, образование фибриллМодификация частиц с целью получения антиоксидантного эффекта
Многослойные углеродные нанотрубкиНаносенсоры с ферментами, «спрятанными» внутрь трубки«Тупиковые» попытки фагоцитоза (см. в тексте) вызывают хроническое воспаление и окислительное повреждение ДНКИзменение структуры для уменьшения жёсткости. — Использование нанотрубок длиной <5 μм. — Использование альтернативных структур (таких как многослойные нано-«луковицы»)
Углеродные нанотрубки (одно- и многослойные)Наносенсоры. Доставка лекарств внутри трубки. Гипертермия опухолей. Антибактериальные агенты. «Молекулярная вакцинация»Продукция АФК из-за ионов металла внутри трубок. — Про-воспалительное действиеМодификация поверхности антиоксидантами или комплексонами. — Покрытие полимерной оболочкой, чтобы предотвратить выделение ионов металлов. — Очистка от примесей металлов. — Присоединение лигандов для ускорения рецептор-опосредованного эндоцитоза
Воспалительный гранулематоз из-за агрегации гидрофобных частиц. — Интерстициальный лёгочный фиброз из-за продукции коллагена фибробластамиУсиление дисперсии частиц (например, электростатическим расталкиванием при соответствующей модификации поверхности)
Фуллерены

Лоставка лекарств. Фотоактивируемые антимикробные агенты. Нейропротекторная и антиоксидантная активности. Фотодинамическая терапия опухолейСпонтанная или фотоактивируемая продукция АФК. — Гидрофобная поверхность вызывает агрегациюУменьшение гидрофобности покрытием или модификацией поверхности анионными соединениями
Катионные наносферы и дендримерыУникальный носитель для направленной доставки лекарствПовреждение и утончение мембраны. — Повреждение эндосом и лизосом (см. далее)Уменьшение плотности катионного (положительного) заряда. — Замена катионных групп амфифильными. — Уменьшение вероятности неспецифических внутриклеточных взаимодействий путём специальных химических модификаций
Ni/Co ферритовые наночастицы, магнитные наночастицыКонтрастирование в томографии, разделение сложных биологических образцов (молекул, клеток)Выделение токсичных катионовПокрытие частиц полимерами, углеродом, фосфоновыми кислотами. — Заключение в полимерную капсулу или липосому
Al2O3Продукция АФК. — Про-воспалительная активностьПокрытие биосовместимыми материалами
Cu/CuOАнтибактериальные качестваПовреждение ДНК и окислительный стресс
MoO3Разрушение мембраны

Наночастицы внутри клетки: в процессе эндоцитоза

Рисунок 5. Схема механизма «протонной губки», приводящего к разрушению лизосом и лежащему в основе цитотоксичности некоторых наночастиц [2]. Катионные частицы (например, полиэтиленимин или дендримеры) связываются с липидными головками мембраны и захватываются внутрь клетки путём эндоцитоза. Попав в кислое окружение вторичной лизосомы, ненасыщенные аминогруппы присоединяют протоны, закачиваемые внутрь этой органеллы АТФазами v-типа. (На один протон в лизосому попадают также один ион хлора и одна молекула воды.) В результате лизосома «набухает» и, в конечном счёте, лопается, изливая своё содержимое в цитоплазму.

Пути и взаимодействия наночастиц после того, как они попадут внутрь клетки, изучены пока довольно слабо, хотя это и представляет огромный интерес в смысле направленной доставки лекарств в клетку [4]. Не очень понятно и как клетка выбирает конкретный путь захвата: это может быть фагоцитоз, пиноцитоз, рецептор-опосредованный или кавеолин-опосредованный эндоцитоз, причём этот выбор зависит как от клетки, так и от параметров частицы.

Первоначальное расположение захваченной внутрь клетки частицы — это фагосома или эндосома (в зависимости от того, каким способом был произведён «захват»). Следующим этапом эти везикулы сливаются с лизосомой, образуя вторичную лизосому, и уже на этом этапе наночастицы могут начать оказывать на клетку аномальное влияние. В частности, внутри лизосомы такие наноматериалы как катионные дендримеры, полимеры в комплексе с ДНК, производные полистирола могут вызывать эффект протонной губки. Часто содержащиеся в наноматериалах (например, дендримерах или полиэтиленимине) ненасыщенные аминогруппы присоединяют протоны, в обилии содержащиеся в кислой среде лизосом, что заставляет протонные помпы (равно как и каналы ионов хлора) продолжать работать до тех пор, пока лизосома не набухнет и, в конце концов, не лопнет (рисунок 5). При этом, конечно, всё содержимое лизосомы попадает в цитоплазму — и наночастицы, и кислота. Кроме этого, разрыв лизосомы чреват активацией Ca2+-зависимых пор в митохондриях, что приводит к снижению синтеза АТФ и даже апоптозу. Многие другие механизмы токсичности наночастиц также связаны с происходящим в лизосомах.

Эффект наночастиц на организм в целом

Наноматериалы, благодаря своим уникальным свойствам (и не в последнюю очередь интерфейсу нано–био), имеют широчайшие перспективы применения в биологии и медицине:

  • флуоресцентные метки для исследований и диагностики (особенно любопытны в этом смысле полупроводниковые квантовые точки, чьими оптическими параметрами легко управлять, просто меняя размер частицы);
  • направленная доставка лекарств и генов (эта область — самая активно развивающаяся в наномедицине. Для доставки используют даже... капсиды аденовирусов, содержащие не инфекцию, а полезный «груз»);
  • детектирование патогенов на молекулярном уровне;
  • изучение взаимодействий белков и нуклеиновых кислот;
  • разрушение опухолей селективным нагреванием (гипертермия или фототермическая терапия);
  • выделение и очистка биомолекул и клеток — уникальные возможности для этой задачи дают магнитные наночастицы;
  • контрастирование при томографии;
  • изучение фармакокинетики и многое другое.

Первостепенное значение на настоящий момент имеют системы направленной доставки лекарств, созданные на основе нанотехнологий — на них приходится около ¾ всех выпущенных на рынок продуктов [6]. Это обстоятельство объясняется тем, что доставка — это, хотя и сложный, но далеко не единственный момент в молекулярной медицине. Куда сложнее разработать активное вещество, которое излечило бы болезнь, будучи доставлено по адресу. (Область разработки лекарственных веществ, называемую драг-дизайном [7], формально тоже можно отнести к наномедицине и нанотехнологиям — ведь такие разработки ведутся с учётом структуры белка-мишени и действующего вещества на атомном, то есть на «нано» уровне.) Сами лекарственные вещества, применяемые на настоящее время, в большинстве случаев были разработаны ещё десятилетия назад, но усовершенствованные системы доставки дают им «второе дыхание».

Впрочем, на конвейере у фармацевтических концернов разрабатывается много новых лекарств, так что объём наномедицинского рынка в ближайшие годы превысит 10–15 млрд. $ ежегодно. (И это только в «большом мире» — без учёта «нанолекарств», «разработанных» отечественными самородками и «окодемегами».) Только по данным 2006 года, в мире насчитывается около 200 фармацевтических компаний, занимающихся разработками в области наномедицины, и ими выпущено около 40 продуктов, так или иначе классифицируемых как «наномедицинские» [8]. (Большая часть этих разработок производится в США.) На текущий момент можно смело эти цифры удвоить.

Однако полноценно эксплуатировать преимущества, которые сулит применение нанотехнологий в медицине, можно только адекватно оценив связанные с наноматериалами опасности и приняв соответствующие меры по защите. Свойства барьера нано–био непосредственно определяют биосовместимость наноматериала в целом — то есть, будет ли он токсичным, какой способ введения наночастиц в организм (например, с диагностической или терапевтической целью) будет наиболее эффективным, насколько активно частицы будут выводиться из организма.

Интересно отметить, что наноматериалы — в частности, знаменитые углеродные нанотрубки, — ведут себя подобно двуликому Янусу — уникальные терапевтические и диагностические свойства (см. табл. 2) сочетаются с токсическим эффектом, оказываемым на лёгкие.

В повреждении лёгких виноваты нанотрубки и дендримеры

При слежении за «судьбой» меченных частицами золота однослойных углеродных нанотрубок после вдыхания их аэрозоля оказывается, что альвеолярные макрофаги реагируют на них по-разному в зависимости от свойств поверхности. «Сухие» нанотрубки оставались практически незамеченными и мигрировали за стенку альвеол, где, взаимодействуя с фибробластами, стимулировали выработку коллагена (что приводит к фиброзу лёгочной ткани). Но если принимать суспензию нанотрубок в 10–15% растворе альбумина, макрофаги начинают идентифицировать их как инородные объекты и захватывают внутрь себя.

Реакция организма на наночастицы сильно зависит от их размера: на примере TiO2 продемонстрировано, что частицы более мелкого «помола» вызывают значительно более сильное воспаление лёгочной ткани и имеют бóльшую токсичность, чем та же масса более крупных частиц. Оказалось, что всё дело в поверхности: одинаковой токсичностью обладают образцы с равной общей площадью поверхности, а не с равной массой. (Зависимость получается настолько сильная, что площадь поверхности даже можно использовать в качестве меры токсичности.)

Ещё один тип наночастиц, которые могут быть токсичными при накоплении в лёгких, — это сверхразветвлённые полимеры (дендримеры), в частности — дендример полиамидоамина (PAMAM). (Оказывается, что лёгкие — это одно из основных мест накопления наночастиц в организме.) Дендримеры уже довольно активно применяются для доставки лекарств в клетку, переноса генов в задачах генной терапии и в других областях. Среди их преимуществ можно назвать точно контролируемые размеры и форму частиц, что связано с особенностями их получения: дендримеры синтезируются «по слоям» и напоминают дерево, «корень» которого находится в центре сферической частицы, а «крона» покрывает всю поверхность. В зависимости от числа таких «слоёв» говорят о «генерации» (G) конкретного дендримера, имея в виду число стадий синтеза и размер результирующих частиц. Дендримеры PAMAM генераций G7–G10 имеют схожий размер с гистонами, из-за чего они хорошо связывают ДНК, — и это обусловливает их способность работать в качестве переносчика генов.

Поскольку дендримеры накапливаются преимущественно в лёгких, исследования их эффекта in vitro проводили на культуре клеток аденокарциномы лёгких A549. Токсический эффект обнаружен только на катионных дендримерах, — в частности, на дендримере PAMAM G3 [9]. Исследование механизма токсичности показало, что дендример запускает программу гибели клетки, но это, против ожиданий, оказался не апоптоз, а аутофагия, активируемая в сигнальном пути Akt–TSC2–mTOR. В то время как основным диагностическим признаком апоптоза является «нарезание» генома клетки на части (чего в этом случае не наблюдалось), при аутофагии характерно образование специальных органелл с двойной мембраной — аутофагосом, в которых клетка фактически «переваривает» себя по частям. То, что это именно аутофагия, было подтверждено использованием 3-метиладенина (3-МА) — ингибитора этого варианта «самоубийства» клетки, — как in vitro, так и in vivo: мыши, получавшие 3-МА на фоне приёма PAMAM G3, меньше страдали от токсического действия дендримера.

К сожалению, 3-МА нестабилен в организме человека и не может использоваться для снижения токсичности наночастиц; однако наверняка будут открыты и другие ингибиторы, применение которых сделает использование наночастиц в медицине более безопасным, — главное, механизм токсичности (по крайней мере, один из них) уже стал известен. «Наше открытие является перспективной отправной точкой для снижения побочных эффектов от использования наноматериалов в лечении людей. Наномедицина обещает невероятные возможности в лечении таких сложнейших заболеваний, как рак и вирусные инфекции, однако вопрос безопасности встаёт тут как никогда остро», — говорит автор исследования по PAMAM G3 Ченгу Жанг (Chengyu Jiang) [10].

Не только вред: антимикробные наночастицы на основе катионных пептидов

Есть у наночастиц и положительные стороны. Учёные из сингапурского Института биоинженерии и нанотехнологий разработали самособирающиеся наночастицы на основе катионных антимикробных пептидов (АМП), которые более активны и менее токсичны, чем «обычные» АМП (а они уже давно привлекают внимание как альтернатива традиционным антибиотикам [11], утратившим свой ореол из-за выработки микроорганизмами резистентности).

Рисунок 6. Структура пептида, образующего наночастицы с антимикробными свойствами [12]. Показана схема образования мицеллы пептида составом ХолG3R6TAT, в которой холестерол (Хол) образует гидрофобное ядро, а положительно заряженные в растворе остатки устилают поверхность наночастицы. На врезке — сканирующая электронная микрофотография, позволяющая оценить размер образующихся наночастиц (≈100–150 нм).

Катионные (положительно заряженные в растворе) антимикробные пептиды интересуют учёных всё больше из-за их способности действовать сразу на множество микроорганизмов и уничтожать даже те из них, которые выработали устойчивость против большинства современных антибиотиков. В основе их действия лежат главным образом неспецифические взаимодействия с отрицательно заряженной клеточной стенкой бактерий и разрушение мембраны, за которым следует лизис и гибель микроорганизма.

Сингапурские учёные взяли за основу пептид TAT (последовательность YGRKKRRQRRR) — минимальный фрагмент белкá TAT ВИЧ-1, способный проникать через мембрану, — и оптимизировали его, добавив «для верности» ещё шесть положительно заряженных остатков аргинина и — через глициновый «линкер» — молекулу холестерола, предназначенного для формирования гидрофобного «ядра» наночастицы [12] (рисунок 6). Для пептида TAT известны его свойства доставлять через мембрану белки, киРНК, липосомы, мицеллы и квантовые точки, и исследователи решили, что в составе наночастицы, где концентрация положительного заряда будет выше, и эффект будет сильнее.

Испытания новых наночастиц на ряде микроорганизмов — бактерий (в том числе, устойчивых к антибиотикам), грибов и дрожжей — показали высокую активность (минимальная ингибирующая концентрация ~10 μМ) и, что самое главное, не обнаружили вредных побочных эффектов: гемолиз практически отсутствовал, равно как и токсическое действие наночастиц на почки и печень (проверено на животных). Под электронным микроскопом в мембранах убитых бактерий видны многочисленные поры, образованные наночастицами, что, видимо, привело к обнажению протопласта и лизису микроорганизмов.

Лечебное действие пептидных наночастиц проверили и на живых организмах: подопытным мышам вводили в мозг минимальную летальную дозу золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus), вызывающего острое воспаление мозга — менингит — и 100%-гибель в течение 48 часов при отсутствии лечения. Однако одновременное введение этих наночастиц (и ещё одно — через сутки) позволило сохранить жизнь многим животным. Высокий терапевтический индекс (отношение летальной концентрации (LD50) к терапевтической концентрации (ED50), равное в этом случае 50) объясняется ещё и тем, что наночастицы с лёгкостью преодолевают гематоэнцефалический барьер — что недоступно «обычным» антибиотикам, — и борются с инфекцией уже «на местах» (это было подтверждено на препаратах мозговой ткани подопытных кроликов).

Сконструированные сингапурцами наночастицы являются весьма перспективным средством лечения различных инфекционных заболеваний, причём это касается не только менингита. (Кстати, «выигрывают» от разработки таких препаратов и пациенты со СПИДом, ведь одной из главных причин смертности в этом случае является контаминация ослабленного организма грибковой инфекцией.) «Полученный нами олигопептид — уникальное вещество, которое само образует наночастицы, способные проникать через мембраны», — говорит И-Ян Янг (Yi-Yan Yang), руководитель этого исследования и заведующий лабораторией в институте, финансируемом сингапурским агентством по науке A*Star. — «Эти наночастицы с лёгкостью „пробивают“ мембраны бактерий, дрожжей и грибов и дестабилизируют и убивают клетки» [13].

Как видим, наночастицы несут и угрозы (правда, не такие уж леденящие, как пресловутая «серая слизь»), и преимущества. Если попытаться резюмировать вопрос о биосовместимости наночастиц, то оказывается, что самыми главными параметрами, позволяющими оценить токсичность, являются размер наночастиц, их гидрофобность и электрокинетический потенциал (ζ-потенциал) частицы в растворе (рисунок 7). (Это выявилось в процессе анализа биосовместимости более 130 различных типов наночастиц.)

Рисунок 7. Биосовместимость наночастиц в зависимости от их физических характеристик [2]. Эта качественная картина получена на основе анализа >130 видов наночастиц, используемых в терапевтических целях. Основные параметры, определяющие биосовместимость (изображённую цветовым спектром) — размер, ζ-потенциал в растворе и гидрофобность. Так, катионные частицы небольшого размера и с высокой реакционной способностью поверхности почти всегда оказываются токсичными — по сравнению с более крупными гидрофобными частицами, которые довольно быстро и безопасно выводятся из организма при участии ретикулоэндотелиальной системы (РЭС). Частицы, избегающие немедленного вывода почками или печенью, обладают средними размерами и нейтральным поверхностным зарядом; они имеют тенденцию аккумулироваться в опухолевой ткани из-за эффекта повышенной проницаемости и удерживания (EPR-эффекта). Именно это свойство делает их оптимальными агентами для терапии онкологических заболеваний.

Гидрофобные частицы имеют очень небольшое время жизни в кровотоке, поскольку они оперативно выводятся из организма печенью и селезёнкой. Размер наночастиц также является определяющим фактором в этом вопросе: частицы размером менее 8 нм выводятся почками, в то время как печень «специализируется» на более крупных образованиях — она удаляет из кровяного русла любые частицы диаметром >200 нм. (Правда, вывод с желчью ограничен размером желчных протоков (30 нм), и более крупные частицы «дожидаются своей очереди», пока не раздробятся до приемлемого размера.) Частицы же промежуточного диаметра (от 30–40 до 200 нм) могут пассивно аккумулироваться, причём в опухолевых очагах (!), — по механизму, известному как увеличенная проницаемость и удерживание (EPR, enhanced permeation and retention). Происходит это из-за повышенного кровоснабжения и пониженного лимфатического дренажа в опухоли.

Что касается поверхностного заряда частиц, то катионные (положительно заряженные) частицы в большинстве случаев токсичны и вызывают гемолиз и агрегацию эритроцитов. (Однако если вспомнить предыдущий пример с антимикробными катионными частицами, станет понятно, что зависимость не абсолютная.)

Безопасные наноматериалы будущего

Уже сегодня, по данным промышленной аналитики, на рынке >800 продуктов, при изготовлении которых использовались нанотехнологии. (Если бы эта аналитика охватывала и российский «рынок», то цифра, скорее всего, возросла бы на порядок.;-) Очевидно, что в ближайшем будущем эта тенденция не только сохранится, но и усилится — и не в последнюю очередь за счёт нанобиотехнологий. Чтобы избежать потенциальных опасностей со стороны «нанолекарств» и наноматериалов, необходимо иметь полные сведения о структуре интерфейсов «нано–био», в которых принимают участие наночастицы, оказавшись внутри живого организма. Видимо, эти знания станут хрестоматийными для первого поколения «наноучёных», которые обеспечат человечество неслыханными — в хорошем смысле — наноматериалами. Главное, чтобы не получилась ненароком «серая слизь».

Первоначально адаптированная версия этой статьи была опубликована в №1 журнала «Косметика и медицина»’2010.

Литература


  1. STRF.ru: «Медицина и фармацевтика в наномире»;
  2. Nel A.E., Mädler L., Velegol D., Xia T., Hoek E.M.V., Somasundaran P., Klaessig F., Castranova V., Thompson M. (2009). Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials 8, 543–557;
  3. Auffan M., Rose J., Bottero J.-Y., Lowry G.V., Jolivet J.-P., Wiesner M.R. (2009). Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology 4, 634–641;
  4. биомолекула: «Наномедицина будущего: трансдермальная доставка с использованием наночастиц»;
  5. биомолекула: «Доставка лекарственных препаратов на основе рецептор-опосредованного эндоцитоза»;
  6. Farokhzad O.C., Langer R. (2009). Impact of nanotechnology on drug delivery. ACS Nano 3, 16–20;
  7. биомолекула: «Драг-дизайн: как в современном мире создаются новые лекарства»;
  8. Wagner V., Dullaart A., Bock A.K., Zweck A. (2006). The emerging nanomedicine landscape. Nat. Biotechnol. 24, 1211–1217;
  9. Li C., Liu H., Sun Y., Wang H., Guo F., Rao S., Deng J., Zhang Y., Miao Y., Guo C., Meng J., Chen X., Li L., Li D., Xu H., Wang H., Li B., Jiang C. (2009). PAMAM nanoparticles promote acute lung injury by inducing autophagic cell death through the Akt-TSC2-mTOR signaling pathway. J. Mol. Cell. Biol. 1, 37–45;
  10. ScienceDaily: “Health Risks Of Nanotechnology: How Nano-particles Can Cause Lung Damage, And How The Damage Can Be Blocked”;
  11. биомолекула: «Антимикробные пептиды — возможная альтернатива традиционным антибиотикам»;
  12. Liu L., Xu K., Wang H., Tan P.K., Fan W., Venkatraman S.S., Li L., Yang Y.Y. (2009). Self-assembled cationic peptide nanoparticles as an efficient antimicrobial agent. Nat. Nanotechnol. 4, 457–463;
  13. ScienceDaily: “Nanotechnology Combats Fatal Brain Infections”.

Автор: Чугунов Антон.

Число просмотров: 8677.

Creative Commons License — условия использования и распространения материалов сайта.
Вернуться в раздел «Структуры»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.