биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


«Дизайнерские» ферменты защищают от нервно-паралитических ядов

[2 февраля, 2011 г.]

Несмотря на то, что химическое оружие, к счастью, практически не применяется в военных действиях, наличие средств химической защиты — важная составляющая обороноспособности и обязательное требование для чрезвычайных ситуаций. Одни из самых опасных отравляющих веществ — фосфорорганические яды, обладающие нервно-паралитическим действием, — были созданы еще до Второй мировой войны, однако эффективного противоядия от них до сих пор не существует. Группа ученых в Израиле применила подход направленной эволюции, чтобы «в пробирке» создать фермент, способный стать антидотом для двух самых токсичных ядов этой группы, — зомана и циклозарина.

Рисунок 1. Представители фосфорорганических ядов G-серии. Зоман — самый токсичный из этой серии: среднесмертельная концентрация при действии через органы дыхания составляет 0.03 мг·мин/л. Основная защита от этих ОВ — противогаз и средства защиты кожи. Снизу: Демонстрационная боеголовка американской ракеты Honest John, «нашпигованная» контейнерами M139 с зарином (фото: около 1960-х).

Первое применение боевых отравляющих веществ (ОВ) относится к 1915 году, когда Германия вблизи бельгийского города Ипр использовала химическое оружие (хлор), в связи с чем заняла выигрышную позицию в бою с англо-французскими войсками. Годом позже в этом же месте был опробован иприт, получивший свое название именно по данной местности. После Первой мировой войны химическое оружие применялось лишь эпизодически, хотя долгие годы разрабатывались все новые его поколения и средства химической защиты. (Военные исследования говорят, что химическое оружие крайне низкоэффективно как средство массового поражения, но обладает мощнейшим психологическим эффектом и наносит существенный урон мирному населению.)

Как и иприт, фосфорорганические яды были синтезированы в Германии, но только перед Второй мировой войной. G-серия — это самое первое и старое семейство фосфорорганических ОВ, обладающих нервно-паралитическим действием: к нему относятся табун (GA), зарин (GB), зоман (GD) и циклозарин (GF) (рисунок 1). К счастью, эти ОВ никогда не применялись массово, за исключением конфликтов между Ираном и Ираком. Парижская Конвенция о химическом оружии, вступившая в силу в 1997 году, запрещает использовать, хранить и создавать химическое оружие, в том числе — и зарин с зоманом. Однако, как показали печально известные теракты с применением зарина в Японии в середине 1990-х, всегда нужно быть готовым к опасности, даже если она возникла из-за «нечестного» применения вооружений.

Нервно-паралитическое действие фосфорорганических ОВ обусловлено тем, что они ингибируют ацетилхолинэстеразу — фермент, катализирующий гидролиз нейромедиатора ацетилхолина в синапсах, — вызывая спазм мышц и паралич, приводящий в итоге к смерти от удушья. Основным антидотом в настоящее время является атропин, однако он не только малоэффективен и обладает массой побочных эффектов, но и не спасает от общего отравляющего действия фосфорорганики. Оптимальным антидотом был бы фермент, «перехватывающий» молекулы ОВ до того, как они начнут действовать в конечных органах, «отравляя» ацетилхолинэстеразу; мало того, такие ферменты есть, но их специфическая активность настолько низка, что в разумных дозах они не могут защитить организм от отравления. Дело в том, что фосфорорганические яды — это молекулы, созданные человеком, и поэтому природа не позаботилась о том, чтобы породить высокоэффективные ферменты, их расщепляющие. Подсчитано, что «минимально достаточная» эффективность такого фермента для применения в качестве антидота, должна быть kкат/KM=107 M−1·мин−1.

И вот в Израиле команда исследователей из Института Вейцмана под руководством Дэна Тавфика (Dan Tawfik) с помощью метода «эволюции в пробирке» получила фермент, с требуемой эффективностью расщепляющий фосфорорганику и годный для использования в качестве антидота при поражении этими ОВ [1]. Лаборатория Тавфика занимается изучением эволюционного развития и механизмов работы ферментов, и на её счету уже немало работ, связанных с искусственной эволюцией ферментов для оптимизации у них желаемых качеств. В большинстве случаев удавалось повысить активность в сотни или даже тысячи раз, а в совместном исследовании с американцами использование компьютерного моделирования даже позволило создать фермент с совершенно новой функцией (см. «Дизайнерские ферменты на службе общества» [2]).

В этой работе [1] компьютерное моделирование не использовали, а за отправную точку взяли подробно изученный в лаборатории Тавфика фермент PON1, основная функция которого — расщепление продуктов окисления липидов в крови и, в силу этого, противостояние атеросклерозу. Что интересно, оказалось, что PON1 «подрабатывает» и расщеплением фосфорорганических соединений (с очень низкой эффективностью, kкат/KM=8×104 M−1·мин−1), что и стало «целевым свойством», которое решили оптимизировать учёные.

Процедура искусственной эволюции (см. рисунок 2) заключалась во внесении в белок большого количества мутаций — как наперед заданных (остатки активного центра), так и случайных. Результирующие мутантные варианты проверяли на активность сначала по расщеплению малотоксичного аналога зомана, а потом — по эффективности «защиты» ацетилхолинэстеразы от «отравления» циклозарином; такие «эволюционные циклы» повторяли несколько раз. Что интересно, поскольку лаборатория Тавфика не имела доступа к работе с нервно-паралитическими и другими высокотоксичными веществами, был разработан оригинальный способ тестирования: циклозарин нигде не хранился и не добавлялся в пробирку извне, а синтезировался прямо в жидкой фазе, уже не имея возможности отравить сотрудников путем передачи через воздух. Этот способ тестирования позволил выбрать один из мутантных аналогов, эффективно «защищавших» ацетилхолинэстеразу, и эксперименты на животных с инъекцией одного из аналогов зомана показали перспективность использования этого фермента в качестве антидота: выживаемость мышей повысилась более чем в пять раз.

Рисунок 2. Метод направленной эволюции (directed evolution) был разработан в 90-х годах прошлого века Дэном Тавфиком и известным английским ученым Эндрю Гриффитсом (Andrew Griffiths), в ту пору руководившим его диссертацией. В основе этого элегантного метода лежит создание множества изолированных компартментов (например, липосом или ячеек в эмульсии), каждый из которых содержит молекулу ДНК с нужным геном и все компоненты для его транскрипции и трансляции. Что здесь особенно важно, в разных компартментах содержатся не одинаковые копии ДНК: изменчивость для этой «эволюции в пробирке» поставляет реакция ПЦР пониженной точности, копирующая гены с «ошибками» (мутациями). Подбор условий позволил Тавфику и Гриффитсу в конце концов добиться соотношения «один ген — один компартмент», когда в каждой искусственной «клеточке» содержится только один вариант ДНК.
В качестве «искусственного отбора», позволяющего выделить гены, эволюционирующие в верном направлении, в лаборатории Тавфика разработали достаточно много хитроумных способов сканирования; проще всего их проиллюстрировать на примере создания новых вариантов ферментов-рестриктаз, распознающих в последовательности ДНК нужные исследователям сайты расщепления [3]. Отбор здесь проводится по принципу «режет—не режет»: если образовавшийся фермент активен, он будет расщеплять свой же ген по интегрированному в него сайту рестрикции. Затем «липкий конец» ДНК, остающийся после рестрикции, модифицируют хроматографической меткой (например, биотином), что позволяет «выловить» те генетические последовательности, которые кодируют распознающую требуемый сайт новую рестриктазу. Повторные циклы эволюции позволяют получить ферменты, распознающие нужные ДНК-сайты с высокой специфичностью и активностью.
Приблизительное время одного цикла без учета подготовки опыта — всего одна неделя, что позволяет провести «искусственную эволюцию» в достаточно сжатые сроки. Врезка подготовлена Старокадомским П. по материалам [3].

Исследователи собираются в кооперации с врачами усовершенствовать свой фермент, добившись защиты от всех распространенных фосфорорганических ОВ и снизив иммуногенность, а также дополнительно повысив эффективность, чтобы антидот можно было принимать не только заблаговременно, но и уже после контакта с ядом (хотя и в этом случае, понятно, придется поспешить).

Использованы материалы ScienceDaily [4].

Литература


  1. Gupta R.D., Goldsmith M., Ashani Y., Simo Y., Mullokandov G., Bar H., Ben-David M., Leader H., Margalit R., Silman I., Sussman J.L., Tawfik D.S. (2011). Directed evolution of hydrolases for prevention of G-type nerve agent intoxication. Nat. Chem. Biol. 7, 120–125;
  2. биомолекула: «Дизайнерские ферменты на службе общества»;
  3. Tawfik D.S., Griffiths A.D. (1998). Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat. Biotechnol. 16, 652–656;
  4. ScienceDaily — «Accelerated Evolution Used to Develop Enzymes That Provide Protection Against Nerve Gas».

Автор: Чугунов Антон.

Число просмотров: 1229.

Вернуться в раздел «Новости»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Re: «Дизайнерские» ферменты защищают от нервно-паралитических ядов

Михаил Карбышев — 6 мая, 2011 г. 03:15. (ссылка) (свернуть ветвь)

Интересная статья, но,если поглубже копнуть, то приоритет получения ферментов-инактиваторов фосфоорганических ядов принадлежит не израильским ученым.
задолго до этого...в 2007-2009 г, сотрудник Института биофизической химии при Университете Франкфурта на Майне-Марк Михаэль Блюм, под руководством профессора Джулиана Чена работал над "направленной эволюцией" диизопропилфторфосфатазы....причем,весьма успешно, насколько я знаю...диссер его прошел на ура.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Blum%20MM

(ответить)

Re: Re: «Дизайнерские» ферменты защищают от нервно-паралитических ядов

Старокадомский Петр — 6 мая, 2011 г. 04:29. (ссылка) (свернуть ветвь)

И правда интересно, спасибо. Я неслыхал о его работах, а судя по количеству публикаций - ученый довольно успешный

(ответить)

Re: Re: Re: «Дизайнерские» ферменты защищают от нервно-паралитических ядов

Михаил Карбышев — 6 мая, 2011 г. 23:26. (ссылка)

Всегда рад поделиться информацией.
А Марк Михаэль очень успешный деятель, уже серьезное консалтинговое агенство в области биотехнологии открыл...в Мюнхене...и монографию выпустил в 2009 как раз по ферментам-детоксикантам СДЯВ.

(ответить)

Re: «Дизайнерские» ферменты защищают от нервно-паралитических ядов

Cергей — 5 февраля, 2011 г. 04:47. (ссылка) (свернуть ветвь)

Биотин это аффинная метка. И хотелось бы знать, как хранить чудо фермент до применения. И как долго он, фермент проживет в кровотоке.

(ответить)

Re: Re: «Дизайнерские» ферменты защищают от нервно-паралитических ядов

irina89 — 23 февраля, 2011 г. 10:11. (ссылка) (свернуть ветвь)

эт че постоянно егонужно вводить?

(ответить)

Re: Re: Re: «Дизайнерские» ферменты защищают от нервно-паралитических ядов

Чугунов Антон — 23 февраля, 2011 г. 14:20. (ссылка)

Нет, не постоянно. Антидоты вводят либо заблаговременно (за какое-то время от предположительного столкновения с токсином), либо сразу после отравления.
Первое, конечно, предпочтительнее.

(ответить)

Re: copy from LJ

Старокадомский Петр — 6 февраля, 2011 г. 07:18. (ссылка)

Аффинная хроматография - один из видов хроматографии. Конечно, биотин используют только для аффинной, но оба синонима - "аффинный" и "хроматографический" суть одного. Ваш вариант более точный, но для популярных статей он требовал бы дополнительной расшифровки, что утяжеляет текст -мы такое стараемся избегать.

На счет остальных ваших вопросов - это только первая публикация, т.е. метод отработан достаточно поверхностно (даже ФОВ они использовали самопальное), и возьмет ли израильская армия этот фермент на вооружение - не известно. В публикации ответов на ваши вопросы не было. Если хотите, я вам могу ее прислать - напишите мне в личку ваш электроадрес. Другая возможность - можете написать Тавфику лично - он приятный человек и обычно отвечает быстро.

(ответить)

Re: Re: «Дизайнерские» ферменты защищают от нервно-паралитических ядов

Чугунов Антон — 5 февраля, 2011 г. 10:12. (ссылка)

Биотин тут присоединяют к гену, а не к ферменту. А что делать с ферментом -- уже второй вопрос, но что-то подсказывает мне, что не вводить его в кровь.
Так что, на мой взгляд, оба вопроса мимо цели.

(ответить)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.