Каждый, кто хоть раз в жизни получал царапину или рану, приобретал тем самым замечательную возможность наблюдать превращение крови из жидкости в вязкую нетекучую массу, приводящее к остановке кровотечения. Этот процесс называется свертыванием крови и управляется сложной системой биохимических реакций.

Иметь какую-нибудь систему остановки кровотечения — абсолютно необходимо для любого многоклеточного организма, имеющего жидкую внутреннюю среду. Свертывание крови является жизненно необходимым и для нас: мутации в генах основных белков свертывания, как правило, летальны. Увы, среди множества систем нашего организма, нарушения в работе которых представляют опасность для здоровья, свертывание крови также занимает абсолютное первое место как главная непосредственная причина смерти: люди болеют разными болезнями, но умирают почти всегда от нарушений свертывания крови. Рак, сепсис, травма, атеросклероз, инфаркт, инсульт — для широчайшего круга заболеваний непосредственной причиной смерти является неспособность системы свертывания поддерживать баланс между жидким и твердым состояниями крови в организме.

Если причина известна, почему же с ней нельзя бороться? Разумеется, бороться можно и нужно: ученые постоянно создают новые методы диагностики и терапии нарушений свертывания. Но проблема в том, что система свертывания очень сложна. А наука о регуляции сложных систем учит, что управлять такими системами нужно особым образом. Их реакция на внешнее воздействие нелинейна и непредсказуема, и для того, чтобы добиться нужного результата, нужно знать, куда приложить усилие. Простейшая аналогия: чтобы запустить в воздух бумажный самолетик, его достаточно бросить в нужную сторону; в то же время для взлета авиалайнера потребуется нажать в кабине пилота на правильные кнопки в нужное время и в нужной последовательности. А если попытаться авиалайнер запустить броском, как бумажный самолетик, то это закончится плохо. Так и с системой свертывания: чтобы успешно лечить, нужно знать «управляющие точки».

Вплоть до самого последнего времени свертывание крови успешно сопротивлялось попыткам исследователей понять его работу, и лишь в последние годы тут произошел качественный скачок. В данной статье мы расскажем об этой замечательной системе: как она устроена, почему ее так сложно изучать, и — самое главное — поведаем о последних открытиях в понимании того, как она работает.

Как устроено свертывание крови

Остановка кровотечения основана на той же идее, что используют домохозяйки для приготовления холодца — превращении жидкости в гель (коллоидную систему, где формируется сеть молекул, способная удержать в своих ячейках тысячекратно превосходящую ее по весу жидкость за счет водородных связей с молекулами воды). Кстати, та же идея используется в одноразовых детских подгузниках, в которые помещается разбухающий при смачивании материал. С физической точки зрения, там нужно решать ту же самую задачу, что и в свертывании — борьбу с протечками при минимальном приложении усилий.

Свертывание крови является центральным звеном гемостаза (остановки кровотечения). Вторым звеном гемостаза являются особые клетки — тромбоциты, — способные прикрепляться друг к другу и к месту повреждения, чтобы создать останавливающую кровь пробку.

Общее представление о биохимии свертывания можно получить из рисунка 1, внизу которого показана реакция превращения растворимого белка фибриногена в фибрин, который затем полимеризуется в сетку. Эта реакция представляет собой единственную часть каскада, имеющую непосредственный физический смысл и решающую четкую физическую задачу. Роль остальных реакций — исключительно регуляторная: обеспечить превращение фибриногена в фибрин только в нужном месте и в нужное время.

Фибриноген напоминает стержень длиной 50 нм и толщиной 5 нм (рис. 2а). Активация позволяет его молекулам склеиваться в фибриновую нить (рис 2б), а затем в волокно, способное ветвиться и образовывать трехмерную сеть (рис. 2в).

Активатор фибриногена тромбин (рис. 3) принадлежит к семейству сериновых протеиназ — ферментов, способных осуществлять расщепление пептидных связей в белках. Он является родственником пищеварительных ферментов трипсина и химотрипсина. Протеиназы синтезируются в неактивной форме, называемой зимогеном. Чтобы их активировать, необходимо расщепить пептидную связь, удерживающую часть белка, которая закрывает активный сайт. Так, тромбин синтезируется в виде протромбина, который может быть активирован. Как видно из рис. 1 (где протромбин обозначен как фактор II), это катализируется фактором Xa.

Вообще, белки свертывания называют факторами и нумеруют римскими цифрами в порядке официального открытия. Индекс «а» означает активную форму, а его отсутствие — неактивный предшественник. Для давно открытых белков, таких как фибрин и тромбин, используют и собственные имена. Некоторые номера (III, IV, VI) по историческим причинам не используются.

Активатором свертывания служит белок, называемый тканевым фактором, присутствующий в мембранах клеток всех тканей, за исключением эндотелия и крови. Таким образом, кровь остается жидкой только благодаря тому, что в норме она защищена тонкой защитной оболочкой эндотелия. При любом нарушении целостности сосуда тканевой фактор связывает из плазмы фактор VIIa, а их комплекс — называемый внешней теназой (tenase, или Xase, от слова ten — десять, т.е. номер активируемого фактора) — активирует фактор X.

Тромбин также активирует факторы V, VIII, XI, что ведет к ускорению его собственного производства: фактор XIa активирует фактор IX, а факторы VIIIa и Va связывают факторы IXa и Xa, соответственно, увеличивая их активность на порядки (комплекс факторов IXa и VIIIa называется внутренней теназой). Дефицит этих белков ведет к тяжелым нарушениям: так, отсутствие факторов VIII, IX или XI вызывает тяжелейшую болезнь гемофилию (знаменитую «царскую болезнь», которой болел царевич Алексей Романов); а дефицит факторов X, VII, V или протромбина несовместим с жизнью.

Такое устройство системы называется положительной обратной связью: тромбин активирует белки, которые ускоряют его собственное производство. И здесь возникает интересный вопрос, а зачем они нужны? Почему нельзя сразу сделать реакцию быстрой, почему природа делает ее исходно медленной, а потом придумывает способ ее дополнительного ускорения? Зачем в системе свертывания дублирование? Например, фактор X может активироваться как комплексом VIIa—TF (внешняя теназа), так и комплексом IXa—VIIIa (внутренняя теназа); это выглядит совершенно бессмысленным.

В крови также присутствуют ингибиторы протеиназ свертывания. Основными являются антитромбин III и ингибитор пути тканевого фактора. Кроме этого, тромбин способен активировать сериновую протеиназу протеин С, которая расщепляет факторы свертывания Va и VIIIa, заставляя их полностью терять свою активность.

Протеин С — предшественник сериновой протеиназы, очень похожей на факторы IX, X, VII и протромбин. Он активируется тромбином, как и фактор XI. Однако при активации получившаяся сериновая протеиназа использует свою ферментативную активность не для того, чтобы активировать другие белки, а для того, чтобы их инактивировать. Активированный протеин С производит несколько протеолитических расщеплений в факторах свертывания Va и VIIIa, заставляя их полностью терять свою кофакторную активность. Таким образом, тромбин — продукт каскада свертывания — ингибирует свое собственное производство: это называется отрицательной обратной связью. И опять у нас регуляторный вопрос: зачем тромбин одновременно ускоряет и замедляет собственную активацию?

Подводя итог, система свертывания изучена очень хорошо. В ней уже пятнадцать лет не открывали новых белков или реакций, что для современной биохимии составляет вечность. Конечно, нельзя совсем исключить вероятность такого открытия, но пока что не существует ни одного явления, которое мы не могли бы объяснить при помощи имеющихся сведений. Скорее наоборот, система выглядит гораздо сложнее, чем нужно: мы напомним, что из всего этого (довольно громоздкого!) каскада собственно желированием занимается только одна реакция, а все остальные нужны для какой-то непонятной регуляции.

Именно поэтому сейчас исследователи-коагулологи, работающие в самых разных областях — от клинической гемостазиологии до математической биофизики, — активно переходят от вопроса «Как устроено свертывание?» к вопросам «Почему свертывание устроено именно так?», «Как оно работает?» и, наконец, «Как нам нужно воздействовать на свертывание, чтобы добиться желаемого эффекта?». Первое, что необходимо сделать для ответа — научиться исследовать свертывание целиком, а не только отдельные реакции.

Как исследовать свертывание?

Для изучения свертывания создаются различные модели — экспериментальные и математические. Что именно они позволяют получить?

С одной стороны, кажется, что самым лучшим приближением для изучения объекта является сам объект. В данном случае — человек или животное. Это позволяет учитывать все факторы, включая ток крови по сосудам, взаимодействия со стенками сосудов и многое другое. Однако в этом случае сложность задачи превосходит разумные границы. Модели свертывания позволяют упростить объект исследования, не упуская его существенных особенностей.

Попытаемся составить представление о том, каким требованиям должны отвечать эти модели, чтобы корректно отражать процесс свертывания in vivo.

В экспериментальной модели должны присутствовать те же биохимические реакции, что и в организме. Должны присутствовать не только белки системы свертывания, но и прочие участники процесса свертывания — клетки крови, эндотелия и субэндотелия. Система должна учитывать пространственную неоднородность свертывания in vivo: активацию от поврежденного участка эндотелия, распространение активных факторов, присутствие тока крови.

Рассмотрение моделей свертывания естественно начать с методов исследования свертывания in vivo. Основа практически всех используемых подходов такого рода заключается в нанесении подопытному животному контролируемого повреждения с тем, чтобы вызвать гемостатическую или тромботическую реакцию. Данная реакция исследуется различными методами:

• наблюдение за временем кровотечения;
• анализ плазмы, взятой у животного;
• вскрытие умерщвленного животного и гистологическое исследование;
• наблюдение за тромбом в реальном времени с использованием микроскопии или ядерного магнитного резонанса (рис. 4).

Классическая постановка эксперимента по свертыванию in vitro заключается в том, что плазма крови (или цельная кровь) смешивается в некоторой емкости с активатором, после чего производится наблюдение за процессом свертывания. По методу наблюдения экспериментальные методики можно разделить на следующие типы:

• наблюдение за самим процессом свертывания;
• наблюдение за изменением концентраций факторов свертывания от времени.

Второй подход дает несравненно больше информации. Теоретически, зная концентрации всех факторов в произвольный момент времени, можно получить полную информацию о системе. На практике исследование даже двух белков одновременно дорого и связано с большими техническими трудностями.

Наконец, свертывание в организме протекает неоднородно. Формирование сгустка запускается на поврежденной стенке, распространяется с участием активированных тромбоцитов в объеме плазмы, останавливается с помощью эндотелия сосудов. Адекватно изучить эти процессы с помощью классических методов невозможно. Вторым важным фактором является наличие потока крови в сосудах.

Осознание этих проблем привело к появлению, начиная с 1970-х годов, разнообразных проточных экспериментальных систем in vitro. Несколько больше времени потребовалось на осознание пространственных аспектов проблемы. Только в 1990-е годы стали появляться методы, учитывающие пространственную неоднородность и диффузию факторов свертывания, и только в последнее десятилетие они стали активно использоваться в научных лабораториях (рис. 5).

Наряду с экспериментальными подходами для исследований гемостаза и тромбоза также используются математические модели (этот метод исследований часто называется in silico [8]). Математическое моделирование в биологии позволяет устанавливать глубокие и сложные взаимосвязи между биологической теорией и опытом. Проведение эксперимента имеет определенные границы и сопряжено с рядом трудностей. Кроме того, некоторые теоретически возможные эксперименты неосуществимы или запредельно дороги вследствие ограничений экспериментальной техники. Моделирование упрощает проведение экспериментов, так как можно заранее подобрать необходимые условия для экспериментов in vitro и in vivo, при которых интересующий эффект будет наблюдаем.

Регуляция системы свертывания

Сделаем следующий логический шаг и попробуем ответить на вопрос — а как описанная выше система работает?

Каскадное устройство системы свертывания

Начнем с каскада — цепочки активирующих друг друга ферментов. Один фермент, работающий с постоянной скоростью, дает линейную зависимость концентрации продукта от времени. У каскада из N ферментов эта зависимость будет иметь вид t^N, где t — время. Для эффективной работы системы важно, чтобы ответ носил именно такой, «взрывной» характер, поскольку это сводит к минимуму тот период, когда сгусток фибрина еще непрочен.

Запуск свертывания и роль положительных обратных связей

Как упоминалось в первой части статьи, многие реакции свертывания медленны. Так, факторы IXa и Xa сами по себе являются очень плохими ферментами и для эффективного функционирования нуждаются в кофакторах (факторах VIIIa и Va, соответственно). Эти кофакторы активируются тромбином: такое устройство, когда фермент активирует собственное производство, называется петлей положительной обратной связи.

Как было показано нами экспериментально и теоретически, положительная обратная связь активации фактора V тромбином формирует порог по активации — свойство системы не реагировать на малую активацию, но быстро срабатывать при появлении большой. Подобное умение переключаться представляется весьма ценным для свертывания: это позволяет предотвратить «ложное срабатывание» системы.

Роль внутреннего пути в пространственной динамике свертывания

Одной из интригующих загадок, преследовавших биохимиков на протяжении многих лет после открытия основных белков свертывания, была роль фактора XII в гемостазе. Его дефицит обнаруживался в простейших тестах свертывания, увеличивая время, необходимое для образования сгустка, однако, в отличие от дефицита фактора XI, не сопровождался нарушениями свертывания.

Один из наиболее правдоподобных вариантов разгадки роли внутреннего пути был предложен нами с помощью пространственно неоднородных экспериментальных систем. Было обнаружено, что положительные обратные связи имеют большое значение именно для распространения свертывания. Эффективная активация фактора X внешней теназой на активаторе не поможет сформировать сгусток вдали от активатора, так как фактор Xa быстро ингибируется в плазме и не может далеко отойти от активатора. Зато фактор IXa, который ингибируется на порядок медленнее, вполне на это способен (и ему помогает фактор VIIIa, который активируется тромбином). А там, куда сложно дойти и ему, начинает работать фактор XI, также активируемый тромбином. Таким образом, наличие петель положительных обратных связей помогает создать трехмерную структуру сгустка.

Путь протеина С как возможный механизм локализации тромбообразования

Активация протеина С тромбином сама по себе медленна, но резко ускоряется при связывании тромбина с трансмембранным белком тромбомодулином, синтезируемым клетками эндотелия. Активированный протеин С способен разрушать факторы Va и VIIIa, на порядки замедляя работу системы свертывания. Ключом к пониманию роли данной реакции стали пространственно-неоднородные экспериментальные подходы. Наши эксперименты позволили предположить, что она останавливает пространственный рост тромба, ограничивая его размер.

Подведение итогов

В последние годы сложность системы свертывания постепенно становится менее загадочной. Открытие всех существенных компонентов системы, разработка математических моделей и использование новых экспериментальных подходов позволили приоткрыть завесу тайны. Структура каскада свертывания расшифровывается, и сейчас, как мы видели выше, практически для каждой существенной части системы выявлена или предложена роль, которую она играет в регуляции всего процесса.

На рисунке 7 представлена наиболее современная попытка пересмотреть структуру системы свертывания. Это та же схема, что и на рис. 1, где разноцветным затенением выделены части системы, отвечающие за разные задачи, как обсуждалось выше. Не все в этой схеме является надежно установленным. Например, наше теоретическое предсказание, что активация фактора VII фактором Xa позволяет свертыванию пороговым образом отвечать на скорость потока, остается пока еще непроверенным в эксперименте.

Вполне возможно, что эта картина еще не вполне полна. Тем не менее, прогресс в этой области в последние годы вселяет надежду, что в обозримом будущем оставшиеся неразгаданные участки на схеме свертывания обретут осмысленную физиологическую функцию. И тогда можно будет говорить о рождении новой концепции свертывания крови, пришедшей на смену старинной каскадной модели, которая верно служила медицине на протяжении многих десятилетий.

Статья написана при участии А.Н. Баландиной и Ф.И. Атауллаханова и была в первоначальном варианте опубликована в «Природе» [10].

Литература

1. Mikhail A. Panteleev, Anna N. Balandina, Elena N. Lipets, Mikhail V. Ovanesov, Fazoil I. Ataullakhanov. (2010). Task-Oriented Modular Decomposition of Biological Networks: Trigger Mechanism in Blood Coagulation. Biophysical Journal. 98, 1751-1761;
2. Cristina Fuss, Julio C. Palmaz, Eugene A. Sprague. (2001). Fibrinogen: Structure, Function, and Surface Interactions. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 12, 677-682;
3. Pratt K.P., Côté H.C., Chung D.W., Stenkamp R.E., Davie E.W. (1997). The primary fibrin polymerization pocket: three-dimensional structure of a 30-kDa C-terminal gamma chain fragment complexed with the peptide Gly-Pro-Arg-Pro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 7176–7181;
4. Joseph D. Mills, Robert A.S. Ariëns, Michael W. Mansfield, Peter J. Grant. (2002). Altered Fibrin Clot Structure in the Healthy Relatives of Patients With Premature Coronary Artery Disease. Circulation. 106, 1938-1942;
5. Crawley J.T., Zanardelli S., Chion C.K., Lane D.A. (2007). The central role of thrombin in hemostasis. J. Thromb. Haemost. 5 Suppl 1, 95–101;
6. Russell F. Doolittle, Yong Jiang, Justin Nand. (2008). Genomic Evidence for a Simpler Clotting Scheme in Jawless Vertebrates. J Mol Evol. 66, 185-196;
7. Shahrokh Falati, Peter Gross, Glenn Merrill-Skoloff, Barbara C. Furie, Bruce Furie. (2002). Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat Med. 8, 1175-1180;
8. In vivo — in vitro — in silico;
9. Mikhail A. Panteleev, Mikhail V. Ovanesov, Dmitrii A. Kireev, Aleksei M. Shibeko, Elena I. Sinauridze, et. al.. (2006). Spatial Propagation and Localization of Blood Coagulation Are Regulated by Intrinsic and Protein C Pathways, Respectively. Biophysical Journal. 90, 1489-1500;
10. Баландина А.Н., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. (2011). Система свертывания крови и ее регуляция. «Природа». 3, 32–38.