Конкурс «био/мол/текст»-2011

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2011 в номинации «Своя работа».

К сожалению, для современной цивилизации вполне привычными стали экологические катастрофы, связанные с наземными разливами нефтепродуктов. Загрязнение такого рода негативно воздействуют на почвенный слой, поверхностные и подземные воды, геологическую среду. Немалая доля таких происшествий связана с авариями на нефтехранилищах и их ненадлежащей эксплуатацией. При этом даже после прекращения действия таких нефтехранилищ они на долгие годы остаются источниками загрязнений. По степени отрицательного влияния на экосистемы нефть, нефтепродукты и нефтесодержащие промышленные отходы, в том числе пластиковый и полиэтиленовый мусор, занимают второе место после радиоактивного загрязнения. Несовершенство технологий добычи, транспортировки, переработки и хранения нефти приводит к ее значительным потерям, которые достигают 50 млн. т/год, то есть 2% от общей добычи. Так, 20 апреля 2010 г. на буровой платформе Deepwater Horizon нефтегазовой компании British Petroleum в Мексиканском заливе произошел неконтролируемый выброс нефти с глубины 1500 м. Оценки масштабов выброса нефти различны: от 5 до 60 тыс. баррелей в день [1]. Объём разлива нефти, произошедшего в результате аварии на танкере Эксон Вальдез, которая ранее считалась наиболее разрушительной из морских катастроф, составил около 260 тыс. баррелей нефти.

С неуклонным ростом плотности автотранспорта на территории городов увеличивается число заправочных станций и обслуживающих пунктов, а это, в свою очередь, повышает вероятность возникновения разливов нефтепродуктов и создает пожаро- и экологически опасную ситуацию. В настоящее время эти загрязненные территории не подвергаются обработке. Процесс естественного самовосстановления загрязненной среды является очень длительным: при уровне загрязнения 5 г/кг почвы он длится от 2 до 30 лет и выше. В связи с этим, остро стоит вопрос разработки экологически безопасных и экономически обоснованных мероприятий, направленных на интенсификацию процессов биологической очистки и восстановления плодородия земель.

На данный момент существует три способа очистки воды: механический, физико-химический и биологический. Механическая очистка подразумевает отстаивание и фильтрацию загрязнений, что, во-первых, не решает проблему очистки от растворенных элементов, а, во-вторых, не решает проблему утилизации самих загрязнений, которые остаются практически в неизмененном виде. Пример физического способа очистки — сжигание и термическая десорбция (крекинг). Но при сжигании из-за недостаточно высокой температуры в атмосферу попадают продукты возгонки и неполного окисления нефти. Землю после сжигания необходимо вывозить на свалку (так называемая «горелая земля»). Химическая очистка, хотя и решает проблему очистки от растворенных соединений, опять же не решает проблему утилизации отходов. Биологический ущерб от применения диспергаторов оказался больше, чем ущерб, который можно было ожидать от загрязнения только нефтью, так как эти соединения довольно токсичны. Кроме того, необходимо учесть высокую стоимость самих реактивов и необходимость их точной дозировки [2].

На первое место сейчас выходит биоремедиация (bio — жизнь, remedio — лечение) — очищение природной среды от загрязнений при помощи биологических методов. При этом необходимо исходить из главного принципа: не нанести экосистеме больший вред, чем тот, который уже нанесен при загрязнении. Это может быть биостимуляция аборигенной микрофлоры путем внесения удобрений непосредственно в загрязненную экосистему или внесение специализированных препаратов микроорганизмов, созданных для очистки загрязненных экосистем [3].

Использование нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки окружающей среды является не новой, но недостаточно изученной областью исследований. Продолжается поиск новых деструкторов углеводородов нефти и выявление оптимальных условий эффективного использования имеющихся препаратов.

Нефть (через тур. neft, от перс. naft; восходит к аккадскому напатум — вспыхивать, воспламенять) — природная горючая маслянистая жидкость со специфическим запахом, распространенная в осадочной оболочке Земли. Нефть представляет собой смесь около 1000 индивидуальных веществ, из которых большая часть — жидкие углеводороды (УВ) (> 500 веществ; 80–90% по массе) и гетероатомные органические соединения (4–5%), преимущественно сернистые (около 250 веществ), азотистые (> 30 веществ) и кислородсодержащие (около 85 веществ), а также металлоорганические соединения (в основном ванадиевые и никелевые). Минорные компоненты — растворённые углеводородные газы (C1—C4; 0,1–4%), вода (0–10%), минеральные соли (главным образом хлориды; 0,1–4000 мг/л и более), растворы солей органических кислот и механические примеси (частицы глины, песка, известняка) [4].

Ранее предполагалось, что микроорганизмы, способные разлагать и использовать углеводороды нефти и нефтепродуктов, встречаются только там, где расположены нефтепромыслы, нефтехранилища или нефтепроводы, однако, согласно современным данным, микроорганизмы-нефтедеструкторы распространены в природе очень широко и могут быть выделены из любой почвы, осадочных пород, морской и речной воды. Эти гетеротрофные микроорганизмы могут усваивать разнообразные органические соединения — углеводы, белки, жиры и пр. Численность микроорганизмов-нефтедеструкторов в естественных биоценозах в немалой степени определяется климатическими условиями, типом почв, степенью их обработки, глубиной залегания грунтовых вод.

Необходимо отметить, что некоторые морские микроорганизмы приспособились использовать в пищу даже полиэтилен, еще недавно считавшийся практически неразлагающимся в природе: «Пластик на завтрак». — Ред.

В большинстве случаев метаболизм парафиновых углеводородов начинается с окисления терминальной метильной группы в спирт и, далее, через альдегид до соответствующей жирной кислоты. Дальше процесс идет по пути β-окисления жирных кислот, при котором за каждый цикл длина цепочки жирной кислоты укорачивается на два углеродных атома. Как правило, ферменты, участвующие в этом процессе, обладают низкой специфичностью и могут участвовать в утилизации углеводородов с различным числом углеродных атомов. Конечные продукты метаболизма нефти в почве следующие:

• углекислота (связывается в составе карбонатов) и вода;
• кислородсодержащие соединения (спирты, кислоты, альдегиды, кетоны), которые частично входят в почвенный гумус, частично растворяются в воде и удаляются из почвенного профиля;
  Так, главный продукт окисления нафталина — салициловая кислота; антрацена — 3-гидрокси-2-нафтойная; фенантрена — 1-гидрокси-2-нафтойная; хризена — гидроксифенантренкарбоновая и бензо[a]пирена — гидроксипиренкарбоновая кислоты.
• твердые нерастворимые продукты метаболизма — результат дальнейшего уплотнения высокомолекулярных продуктов или связывания их в органо-минеральные комплексы;
• твердые корочки высокоминеральных компонентов нефти на поверхности почвы (киры).

Именно химический и композиционный состав отдельных компонентов нефти определяют особенности утилизации их микроорганизмами. Решающее значение для использования алифатических углеводородов имеет длина цепи: по мере удлинения цепи парафинов растет число видов микроорганизмов, способных использовать эти соединения, а также активность их использования. После первичной атаки микроорганизмов в нефтезагрязненной среде остаются алканы с очень длинной цепью, полициклические нафтены, полиароматические углеводороды и смеси веществ, составляющие фракцию смол и асфальтенов. Все эти вещества не могут быть метаболизированы отдельными микроорганизмами, и их деструкция в природных условиях связывается с действием смешанных популяций микроорганизмов, — сообществ, для которых характерны отношения кооперации и взаимопомощи.

При этом необязательно чтобы консорциум состоял только из нефтедеструкторов. Возможно, наиболее эффективным будет взаимодействие нескольких активных нефтедеструкторов, ориентированных на разные фракции нефти, и нескольких гетеротрофных микроорганизмов, не обладающих углеводородокисляющей способностью, но способных ассимилировать продукты промежуточного окисления углеводородов, часто токсичных для углеводородокисляющих организмов. Проблема создания подобных консорциумов состоит в том, что очень сложно оценить потенциал углеводородокисляющих ферментных систем, а также трофические связи внутри сообщества. Необходимо отметить, что создание универсального биопрепарата (консорциума микроорганизмов, спроектированного специально для задач биоремециации) невозможно по ряду причин [6]:

• во-первых, нефти разных месторождений отличаются друг от друга по фракционному и композиционному составу;
• во-вторых, в практике биоремедиации приходится сталкиваться не только с нефтяными загрязнениями, но и с загрязнениями нефтепродуктами, которые резко отличаются по химическим свойствам от исходной нефти;
• в-третьих, районы добычи, переработки и хранения нефти и нефтепродуктов значительно отличаются друг от друга по природно-климатическим и гидротермическим условиям.

Большой популярностью пользуются микробные препараты, предлагаемые в широком ассортименте биотехнологическими компаниями Европы, США и Японии. Однако, как свидетельствует практика, применение заполнивших российский рынок зарубежных бакпрепаратов, разработанных для районов, по климатическим и экологическим условиям резко отличающихся от регионов России, оказывается малоэффективным. Среди отечественных препаратов наибольшую известность получили «Деворойл», «Ленойл», «Путидойл», «Белвитамил», «Нафтокс», «Биоприн». Эти препараты разрешены к применению Государственным Комитетом санитарно-эпидемиологического надзора при Президенте РФ и экспертной комиссией главного управления государственной экологической экспертизы Минприроды России.

В результате биологической обработки нефтяного загрязнения биопрепаратами в окружающей среде остаются легко разлагающийся бактериальный белок, не требующий последующей утилизации, и нетоксичные продукты разложения нефти. Продукты жизнедеятельности бактерий и сами отмирающие бактерии легко усваиваются аборигенной микрофлорой, давая основу для формирования гумуса (при использовании препарата для очистки почвы) или образуя донный ил (в случае применения на воде). Степень очистки зависит от исходной величины загрязнения, вида нефтепродукта, механического состава грунта.

На Кафедре биохимии и физиологии клетки Воронежского Государственного Университета совместно с Проектной организацией ООО «ВЕГА-эко» разрабатывают биопрепарат, эффективный в условиях местного региона. Были изучены штаммы рода Acinetobacter (B-2838, B-5064 и B-3780), полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (рис. 3).

Грамотрицательные бактерии рода Acinetobacter — свободноживущие гетеротрофы, обнаруженные в почве, воде, сточных водах и пище. Некоторые представители Acinetobacter присутствуют в составе кожной микрофлоры человека. Таким образом, представители Acinetobacter распространены практически повсеместно. Их метаболическая универсальность означает, что они могут играть важную роль в коммерчески важных промышленных процессах, а также в биологическом разложении ряда веществ, загрязняющих окружающую среду, — Acinetobacter (в составе микробных сообществ) разлагает соединения, токсичные для большинства микроорганизмов. Некоторые представители рода способны выделять полимеры, которые эмульгируют углеводороды и нефть, делая эти субстраты доступными для разложения в водной среде [7].

Штаммы Acinetobacter calcoaceticus и Acinetobacter radioresistens эффективно окисляют ароматические и нециклические компоненты. Особенно важной является способность к росту на ароматических углеводородах, таких как толуол, бензол и ксилол, которые в естественных условиях и при биоремедиации разлагаются сложнее всего. При изучении активности в лаборатории степень деградации нефтепродуктов составила от 40,3 до 99,7% для разных штаммов (рис. 4). В микрополевом опыте в течение 60 дней деструкция нефтепродуктов на участке без добавления биопрепарата составила 8,83% за счет деятельности аборигенной микрофлоры, а на участке с внесением биопрепарата — уже 48,37% [8–10].

Бактерии A. calcoaceticus продуцируют биосурфактант эмульсан (рис. 5), а бактерии A. radioresistans — биосурфактант аласан [10], [12]. Эмульсан эмульгирует легкие фракции нефти, дизельное топливо, сырую нефть и газойли. Аласан — высокомолекулярный комплекс белков и полисахаридов, стабилизирующий различные масляно-водные эмульсии, включающие н-алканы с длиной цепи 10 и более углеродных атомов, алкилароматические углеводороды, жидкий парафин и сырую нефть [7].

Для определения изменения биологической активности почвы в процессе биоремедиации часто используют показатели пероксидазной и полифенолоксидазной активности. Пероксидаза участвует в реакции конденсации веществ при образовании гуминовых кислот, а также в окислительно-восстановительных процессах в почве (ее влияние направлено на окисление гумусовых веществ). Полифенолоксидазы участвуют в превращении органических соединений ароматического ряда в компоненты гумуса. Увеличение активности пероксидазы объясняется включением фермента в процесс детоксикации, а полифенолоксидазы — трансформацией продуктов нефтяного разложения в компоненты гумуса. Низкие дозы загрязнения активизируют эти ферменты, средние и высокие — оказывают ингибирующее действие.

Из литературных данных известно, что внесение в почву структурообразующих субстратов, таких как опилки, торф и т.д., благотворно влияет на биоремедиацию, поскольку такие субстраты, во-первых, служат сорбентами нефтепродуктов, а во-вторых, улучшают аэрацию почвы [13]. Но при этом может возникнуть конкуренция между нефтедеструкторами и целлюлозолитиками за источники азота. Поэтому одним из решений данной проблемы является добавление к консорциуму штаммов диазотрофов, способных к фиксации азота и накоплению его в более доступной форме для нефтедеструкторов. Таким образом, использование консорциума из штаммов Acinetobacter и диазотрофов, таких как Azospirillum, может стать очень перспективным способом очистки нефтяных загрязнений (рис. 6).

Наше исследование показало, что использования консорциума данных штаммов в составе биопрепарата весьма целесообразно. Основная роль Acinetobacter radioresistens — ферментативное окисление нефтепродуктов (штамм В-5064 эффективно окисляет нефть, штамм В-2838 — бензин), а A. calcoaceticus В-3780 продуцирует эффективный биосурфактант. Преимуществом предлагаемого консорциума штаммов микроорганизмов является способность расти на обедненной питательной среде, а также высокая скорость окисления нефти и нефтепродуктов, что позволяет эффективно использовать его при биологической очистке почв, почвогрунтов и вод, загрязненных нефтепродуктами.

Литература

1. Кинвер М. (2011). «Экология Мексиканского залива: год после разлива нефти». BBC Russian;
2. Технология восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Справочник. М.: РЭФИА. НИА. Природа, 2003. — 258 с.;
3. Вельков В.В. (1995). Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы. Биотехнология. 3–4, 20–27;
4. «Состав нефти и классификация». Сайт нефтеперерабатывающей установки класса МНПУ;
5. Иваненко Н.В. Экологическая токсикология. Учебное пособие. Владивосток: Изд-во ВГУЭС, 2006. – 108 с.;
6. Карасева Э.В., Гирич И.Е., Худокормов A.A., Алешина Н.Ю., Карасев С.Г. (2009). Биоремедиация черноземной почвы, загрязненной нефтью. Биотехнология. 2;
7. Кононова В.В., Самсонова А.С., Семочкина Н.Ф. (2007). Cурфактантобразующая микрофлора: свойства и практическое использование. Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. Сборник научных трудов ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси»;
8. Логинова О.О., Данг Т.Т., Белоусова Е.В., Шевченко М.Ю., Грабович М.Ю. (2011). Перспективы использования штаммов В-3780, В-2838, В-5064 бактерий рода Acinetobacter для деградации почвенных нефтяных загрязнений. Проблемы региональной экологии 2011;
9. Логинова О.О., Данг Т.Т., Белоусова Е.В., Шалимова С.С., Шевченко М.Ю., Грабович М.Ю. (2010). Биодеградация нефтепродуктов в почве штаммами микроорганизмов рода Acinetobacter // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегиональный сборник научных работ. Воронеж, 2010. С. 129–136;
10. Логинова О.О., Данг Т.Т., Белоусова Е.В., Грабович М.Ю. (2011). Использование штаммов рода Acinetobacter для биоремедиации нефтезагрязненных почв на территории Воронежской области. Вестник ВГУ. 2, 127–133;
11. Логинова О.О., Данг Т.Т., Пояркова Т.Н., Вязникова О. С., Белоусова Е.В., Шевченко М.Ю., Грабович М.Ю. (2011). Поверхностно-активные свойства сурфактантов, полученных из представителей консорциума нефтедеструкторов, состоящего из Acinetobacter radioresistens штамм BCБ-567 (В-5064), штамм ACKS-1(В-2838) и A. calcoaceticus штамм 134 (В-3780). Экология урбанизированных территорий;
12. A. Toren, S. Navon-Venezia, E. Z. Ron, E. Rosenberg. (2001). Emulsifying Activities of Purified Alasan Proteins from Acinetobacter radioresistens KA53. Applied and Environmental Microbiology. 67, 1102-1106;
13. Рахимова Э.Р., Осипова А.Л., Зарипова С.К. (2009). Очистка почвы от нефтяного загрязнения с использованием денитрофицирующих углеводородокисляющих микроорганизмов. Прикладная биохимия и микробиология. 40.