биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


реклама

Пептид 2A: два в одном

[26 октября, 2011 г.]

Статья на конкурс «био/мол/текст»: В статье рассказывается о механизме действия пептида 2А из вируса ящура, при вставке генетической последовательности которого между последовательностями двух других белков, в любой эукариотической клетке произойдет разделение синтезируемой белковой цепочки на две — прямо во время синтеза полипептида внутри рибосомы. Это свойство 2А применяется в биотехнологии для получения нескольких белков с одной РНК. В наших экспериментах показано, что в таком «расщеплении» принимают участие факторы терминации трансляции.

Скачет зайка по лужайке:
Прыг да скок, прыг да скок,
Ну, а клетка в это время
Синтезирует белок.

Биотеатр Белгосуниверситета

Эта статья заняла первое место в номинации «лучший пресс-релиз по теме своей научной работы» конкурса «био/мол/текст», прошедшего в 2011 г.

Биосинтез белка

В общих чертах, синтез белка происходит одинаково во всех живых клетках, начиная от бактерий и заканчивая человеком. Для начала нужна инструкция, молекула РНК.

Малая субъединица рибосомы — молекулярной машины для синтеза белка — соединяется с большой субъединицей на стартовой тройке нуклеотидов информационной, или матричной РНК (мРНК) — кодоне AUG. Синтез происходит на интерфейсе между большой и малой субъединицами, где протянута нитка мРНК (рис. 1).

Рисунок 1. Схема синтеза белка. Малая субъединица рибосомы (2) присоединяется к большой (3) и начинает синтез белка (растущая фиолетовая линия) с кодона AUG (1). На стоп-кодоне UAG факторы терминации гидролизуют последнюю тРНК, белок высвобождается, субъединицы разъединяются. Картинка: Wikipedia.

Первая транспортная РНК (тРНК), к которой присоединена аминокислота метионин, узнав «свои» три нуклеотида (кодон) на мРНК, присоединяется к А-сайту рибосомы (рис. 2). Вторая тРНК узнает следующий кодон, который находится в Р-сайте рибосомы, и рибосома катализирует образование пептидной связи между двумя аминокислотами, находящимися «по соседству». После этого рибосома сдвигается на один кодон, первая тРНК отсоединяется от рибосомы, следующая тРНК с присоединенной к ней аминокислотой узнает следующий кодон и присоединяется к Р-сайту. И так далее — быстро, четко, с несколькими проверками качества, которые позволяют убедиться, что правильная аминокислота будет в правильном месте, и что белок будет работать.

Рисунок 2. Схематическое строение рибосомы и ее «рабочий цикл». Рибосома пошагово синтезирует белок, пока не доходит стоп-кодона, когда вместо тРНК в А-сайт присоединяются факторы терминации, катализирующие расщепление связи между белком и последней тРНК.

Синтезируемая цепочка аминокислот направляется в рибосомальный тоннель в большой субъединице, словно нитка через игольное ушкó. До того, как вновь синтезированный полипептид выйдет за пределы рибосомы во внутреннее пространство клетки, полипептидная цепочка будет в длину минимум 30 аминокислот. Белок удлиняется до тех пор, пока в конце мРНК рибосома не встретит кодон, который не узнаёт ни одна тРНК — стоп-кодон. Как титры «The End» означают конец фильма, так и стоп-кодон означает конец синтеза белка.

Процесс прекращения синтеза белка, или терминации, как это ни странно, устроен проще у высших организмов, чем у бактерий. И у человека, и у братьев наших меньших — дрожжей — прекращение синтеза белка зависит от двух белков — факторов терминации 1 (ФТ1) и 3 (ФТ3) (ФТ2 у высших организмов отсутствует — история биологии, как любая история, штука нелогичная). По форме напоминающий букву Г, ФТ1 похож на тРНК. В основании «Г» расположены аминокислоты, которые узнают стоп-кодон, горизонтальная ручка «Г» участвует в гидролизе полипетидной цепочки, освобождая её от последней тРНК. В то время, как ФТ1 служит катализатором, ФТ3 поставляет энергию для гидролиза. Ошибочная терминация, когда факторы терминации присоединяются в середине белка, происходит крайне редко — один раз на один миллион присоединённых аминокислот.

Пептид из вируса рогов и копыт

Этой системой пользуются не только живые организмы, но и нечто не совсем живое — вирусы. Вирусы используют аппарат синтеза белка клетки, которую они заразили, для производства своих белков. Однако они, как и вирусы в компьютере, заставляют рибосомы выпускать несвойственную им продукцию.

Пожалуй, один из самых известных вирусов — вирус ящура, который заражает крупный рогатый скот и человека. Эпидемия ящура в 2007 году нанесла многомиллиардный ущерб британской экономике, а такие эпидемии случаются регулярно.

«Программа» вируса ящура заключена в длинной (около 6 тысяч нуклеотидов) молекуле РНК [1]. Поскольку белки вируса ящура считываются с этой молекулы в виде единого полипептида, который потом разделяется на более короткие фрагменты протеазами, «геном» называется последовательность, которая кодирует белок с самостоятельными функциями. С РНК сначала считываются белки оболочки вируса, потом протеазы, а затем вирусные полимеразы, которые скопируют РНК вируса и с этих копий синтезируют много копий вирусного генома. РНК вируса можно представить в виде телеграммы, которая начинается со «здравствуйте» (одного стартового кодона) и где пропущены слова «ЗПТ» или «ТЧК» — между генами отдельных белков.

* * *

Я расскажу о небольшом — в 20 аминокислот — пептиде, который называется 2А.

«Ген» 2А расположен между генами белков оболочки и полимеразами. 20 аминокислот, составляющие 2А, на первый взгляд, не играют никакой роли в воспроизводстве вируса. 2А не участвует в образовании белковой оболочки вирусных частиц и не попадает внутрь ее. Не принимает он участия и в образовании копий нуклеиновой кислоты. Однако у этих 20 аминокислот есть уникальное свойство.

Если ген, кодирующий 2А, вставить в середине какого-либо гена или между двумя генами любых белков, синтезировать соответствующую мРНК и поместить её в любую клетку с ядром или полученный из неё клеточный экстракт, рибосомы этой клетки начинают выпускать довольно странную продукцию. Это будет не один белок с лишними 20 аминокислотами в середине, как это произошло бы с любыми другими 20 аминокислотами, а два отдельных белка. Первый будет оканчиваться 19-ю аминокислотами от 2А справа (на C-конце), а второй всегда будет начинаться с пролина — последней (20-й) аминокислоты 2А (рис. 3).

Рисунок 3. Схематическое действие 2А на синтез белка. 1) «Нормальный синтез» — с одной РНК считывается она полипетидная цепь. При синтезе белков вируса ящура, когда 2А наиболее эффективен, этот продукт не образуется, но при использовании ровно 20 аминокислот этот продукт можно увидеть; 2) Образуется два независимых белка, причем 2А прикреплен к С-концу первого. Продукт «нормального синтеза» никогда не превращается в два независимых полипептида (то есть, это не автокаталитическое расщепление).

Механизм

Если синтезировать короткий белок с 2А в середине искусственно, с помощью химического синтеза, он никогда не распадается на две части и не разрезает другие белки. Это показывает, что 2А не является ферментом-протеазой, который режет полипетидные цепочки, в том числе и собственную. (А ведь белки способны на самомодификацию — не только «саморазрезание», но и «самовырезание» фрагментов из середины: см. «Белки против РНК — кто первым придумал сплайсинг?». — Ред.) Каким же образом 2А вызывает образование двух белков там, где ДНК, а затем и РНК кодирует один?

Первый намек на механизм действия 2А был получен в экспериментах на пекарских дрожжах — тех самых, которые производят хлеб, вино и пиво [2]. Кроме этой полезной деятельности, дрожжи используются во многих молекулярно-биологических экспериментах, поскольку, как и человеческие клетки, содержат ядро, и многие процессы в них протекают сходно. В то же время, дрожжи растут на более простых, а значит, более дешёвых средах, делятся гораздо быстрее человеческих клеток, и существуют масса возможностей генетических манипуляций с ними.

Одна из клеточных органелл, которые есть и у дрожжей, и у человека — эндоплазматический ретикулум (ЭР). Он состоит из окруженной двуслойной липидной мембраной сети каналов, по которым транспортируются различные вещества.

Белки, которые будут транспортироваться по ЭР, синтезируются рибосомами, прикрепляющимися к ЭР со стороны цитоплазмы через белок-рецептор. При этом синтезируемый белок из рибосомального тоннеля сразу поступает внутрь канала ЭР. Это свойство рибосом было использовано для проверки, не разрезает ли белки, содержащие 2А, какая-нибудь клеточная протеаза, потому что к белку, синтезируемому прикрепленной к ЭР рибосомой, у протеазы доступа нет.

Молекулы ДНК, содержащие модифицированные гены зеленого флуоресцентного белка (ЗФБ), дрожжевого преальфафактора (ПАФ) и 2А были трансформированы в клетки дрожжей (рис. 4). ПАФ имеет сигнальную последовательность, которая вызывает его транспорт в ЭР и при присоединении к любому белку продолжает действовать так же. ЗФБ, мало того, что является стандартным экспериментальным белком в клеточной биологии, так ещё и светится, и его можно увидеть в ЭР клеток дрожжей под микроскопом. (См. также: «Флуоресцирующая Нобелевская премия по химии». — Ред.)

Если сигнальная последовательность, которая должна вызывать транспорт белка в эндоплазматическую сеть, была на первом гене, первый белок с прикрепленным к нему 2А транспортировался в ЭР, а второй белок оставался в цитоплазме. Если только второй белок содержал сигнальную последовательность, в ЭР транспортировался только он. Это означает, что:

  • Поскольку цитоплазматические протеазы не имеют доступа внутрь рибосомы, реакция, приписываемая 2А, не имеет к этим протеазам отношения;
  • Рибосома определяет конец синтеза первой части белка как конец синтеза белка вообще и отсоединяется от белка-рецептора.

Рисунок 4. Схема действия 2А при транс-порте белков. Сигнальная последовательность на N-конце белка вызывает транспорт первого, но не второго белка в эндоплазматическую сеть. СП — сигнальная последовательность; ПАФ — проальфафактор; ЗФБ — зеленый флуоресцентный белок.

Следующим этапом исследования механизма действия 2А был поиск клеточных белков, которые принимают участие в реакции. Как сказал предтеча «C.S.I.: Место преступления» Шерлок Холмс: «Если отбросить невозможное, то всё, что останется, каким бы невероятным оно не казалось, должно быть истиной». Участие факторов терминации в гидролизе тРНК на смысловом кодоне было маловероятно, поскольку разделение белков, вызываемое 2А, происходит с вероятностью, близкой к единице, в то время как вероятность терминации на любом смысловом кодоне — около 10−6. Однако мы решили проверить эту возможность.

Для проверки вероятного участия факторов теминации в реакции, вызываемой 2А, уже упоминавшийся ген-«склейка» ПАФ—2А—ЗФБ экспрессировали в дрожжевых клетках [3]. Оказалось, что в клетках, мутантных по факторам терминации ФТ1 или ФТ3, продукция большого числа молекул 2А приводит к гибели клеток, — вероятно, потому что факторы терминации не могут действовать эффективно на клеточных РНК в присутствие большого числа синтезируемых молекул 2А. Осаждение отдельных частей белка с помощью антител показало, что клетках, мутантных по ФТ1 или ФТ3, а также клетках, в которых образование прионов уменьшает количество активного ФТ3, образуется меньше двух продуктов реакции с 2А и больше — «нормального», не разрезанного, белка. Эти эксперименты показывают, что факторы терминации принимают участие в разделении синтезируемого белка с 2A надвое.

Одним из контрольных экспериментов для подтверждения этой гипотезы было воспроизведение реакции in vitro. В бесклеточных экстрактах было показано, что для прохождения реакции РНК, кодирующей 2А, достаточно было иметь все кодоны, включая кодирующий последнюю аминокислоту 2А, P19 [4]. В этом случае можно видеть, как пептид отделяется от последней тРНК. Последующие кодоны не нужны, то есть достаточно иметь кодон в последнем, А-сайте рибосомы, где обычно присоединяются факторы терминации.

К нашему удивлению, замена кодона для P19 стоп-кодоном привела к остановке реакции, то есть тРНК оставалась прикрепленной к пептиду. Очевидно, в случае «странного пептида 2А» конфигурация рибосомы позволяет факторам терминации либо узнавать стоп-кодон, либо выполнять свою обычную функцию: катализировать отделение тРНК от пептида.

Многие белки человека состоят из нескольких отдельных субъединиц (полипептидов), и для лечения некоторых заболеваний нужно экспрессировать все эти полипептиды одновременно, причем — в равной пропорции. Поскольку 2А предложено использовать в генной терапии для одновременного производства нескольких отдельных белков с одного вектора (вместо использования нескольких векторов), данные эксперименты поднимают пока неотвеченный вопрос о том, что произойдет с клетками человека, в которых 2А продуцируется долго и в больших количествах.

Второй вопрос еще менее изучен: каким образом рибосома остается прикрепленной к мРНК после терминации на 2А, и что позволяет ей начинать синтез второй части белка в отсутствие стартового AUG.

Литература


  1. de Felipe P., Luke G.A., Hughes L.E., Gani D., Halpin C., Ryan M.D. (2006). E unum pluribus: multiple proteins from a self-processing polyprotein. Trends Biotechnol. 24, 68–75;
  2. de Felipe P., Hughes L.E., Ryan M.D., Brown J.D. (2003). Co-translational, intraribosomal cleavage of polypeptides by the foot-and-mouth disease virus 2A peptide. J. Biol. Chem. 278, 11441–11448;
  3. Doronina V.A., Wu C., de Felipe P., Sachs M.S., Ryan M.D., Brown J.D. (2008). Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol. Cell Biol. 28, 4227–4239;
  4. Yan F., Doronina V.A., Sharma P., Brown J.D. (2010). Orchestrating ribosomal activity from inside: effects of the nascent chain on the peptidyltransferase centre. Biochem Soc Trans. 38, 1576–1580.

Автор: Доронина Виктория.

Число просмотров: 886.

Creative Commons License — условия использования и распространения материалов сайта.
Вернуться в раздел «Клетка»

Поделиться ссылочкой:

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Re: Пептид 2A: два в одном

V.??? — 30 октября, 2011 г. 15:06. (ссылка)

спасибо за интересную историю;
Факторы терминации в начале текста называются ФТ1-ФТ3, а в конце говорится про РФ1-РФ3 - это не опечатка?
Вообще, я ни в коем случае не сторонник засилия англицизмов, но для давно устоявшихся аббревиатур типа GFP, как мне кажется, "исходный" английский вариант воспринимается всё-таки проще.

(ответить)

Re: Пептид 2A: два в одном

ivan2kh — 27 октября, 2011 г. 08:15. (ссылка)

Спасибо, статья захватывает.

(ответить)

Яндекс.Метрика

© 2007–2014 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k14.

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.