Конкурс «био/мол/текст»-2011

Эта работа заняла первое место в номинации «Своя работа» конкурса «био/мол/текст»-2011.

Скачет зайка по лужайке:
Прыг да скок, прыг да скок,
Ну, а клетка в это время
Синтезирует белок.
Биотеатр Белгосуниверситета

Биосинтез белка

В общих чертах, синтез белка происходит одинаково во всех живых клетках, начиная от бактерий и заканчивая человеком. Для начала нужна инструкция, молекула РНК.

Малая субъединица рибосомы — молекулярной машины для синтеза белка — соединяется с большой субъединицей на стартовой тройке нуклеотидов информационной, или матричной РНК (мРНК) — кодоне AUG. Синтез происходит на интерфейсе между большой и малой субъединицами, где протянута нитка мРНК (рис. 1).

Первая транспортная РНК (тРНК), к которой присоединена аминокислота метионин, узнав «свои» три нуклеотида (кодон) на мРНК, присоединяется к А-сайту рибосомы (рис. 2). Вторая тРНК узнает следующий кодон, который находится в Р-сайте рибосомы, и рибосома катализирует образование пептидной связи между двумя аминокислотами, находящимися «по соседству». После этого рибосома сдвигается на один кодон, первая тРНК отсоединяется от рибосомы, следующая тРНК с присоединенной к ней аминокислотой узнает следующий кодон и присоединяется к Р-сайту. И так далее — быстро, четко, с несколькими проверками качества, которые позволяют убедиться, что правильная аминокислота будет в правильном месте, и что белок будет работать.

Синтезируемая цепочка аминокислот направляется в рибосомальный тоннель в большой субъединице, словно нитка через игольное ушкó. До того, как вновь синтезированный полипептид выйдет за пределы рибосомы во внутреннее пространство клетки, полипептидная цепочка будет в длину минимум 30 аминокислот. Белок удлиняется до тех пор, пока в конце мРНК рибосома не встретит кодон, который не узнаёт ни одна тРНК — стоп-кодон. Как титры «The End» означают конец фильма, так и стоп-кодон означает конец синтеза белка.

Процесс прекращения синтеза белка, или терминации, как это ни странно, устроен проще у высших организмов, чем у бактерий. И у человека, и у братьев наших меньших — дрожжей — прекращение синтеза белка зависит от двух белков — факторов терминации 1 (ФТ1) и 3 (ФТ3) (ФТ2 у высших организмов отсутствует — история биологии, как любая история, штука нелогичная). По форме напоминающий букву Г, ФТ1 похож на тРНК. В основании «Г» расположены аминокислоты, которые узнают стоп-кодон, горизонтальная ручка «Г» участвует в гидролизе полипетидной цепочки, освобождая её от последней тРНК. В то время, как ФТ1 служит катализатором, ФТ3 поставляет энергию для гидролиза. Ошибочная терминация, когда факторы терминации присоединяются в середине белка, происходит крайне редко — один раз на один миллион присоединённых аминокислот.

Пептид из вируса рогов и копыт

Этой системой пользуются не только живые организмы, но и нечто не совсем живое — вирусы. Вирусы используют аппарат синтеза белка клетки, которую они заразили, для производства своих белков. Однако они, как и вирусы в компьютере, заставляют рибосомы выпускать несвойственную им продукцию.

Пожалуй, один из самых известных вирусов — вирус ящура, который заражает крупный рогатый скот и человека. Эпидемия ящура в 2007 году нанесла многомиллиардный ущерб британской экономике, а такие эпидемии случаются регулярно.

«Программа» вируса ящура заключена в длинной (около 6 тысяч нуклеотидов) молекуле РНК [1]. Поскольку белки вируса ящура считываются с этой молекулы в виде единого полипептида, который потом разделяется на более короткие фрагменты протеазами, «геном» называется последовательность, которая кодирует белок с самостоятельными функциями. С РНК сначала считываются белки оболочки вируса, потом протеазы, а затем вирусные полимеразы, которые скопируют РНК вируса и с этих копий синтезируют много копий вирусного генома. РНК вируса можно представить в виде телеграммы, которая начинается со «здравствуйте» (одного стартового кодона) и где пропущены слова «ЗПТ» или «ТЧК» — между генами отдельных белков.

Я расскажу о небольшом — в 20 аминокислот — пептиде, который называется 2A.

«Ген» 2A расположен между генами белков оболочки и полимеразами. 20 аминокислот, составляющие 2A, на первый взгляд, не играют никакой роли в воспроизводстве вируса. 2A не участвует в образовании белковой оболочки вирусных частиц и не попадает внутрь ее. Не принимает он участия и в образовании копий нуклеиновой кислоты. Однако у этих 20 аминокислот есть уникальное свойство.

Если ген, кодирующий 2A, вставить в середине какого-либо гена или между двумя генами любых белков, синтезировать соответствующую мРНК и поместить её в любую клетку с ядром или полученный из неё клеточный экстракт, рибосомы этой клетки начинают выпускать довольно странную продукцию. Это будет не один белок с лишними 20 аминокислотами в середине, как это произошло бы с любыми другими 20 аминокислотами, а два отдельных белка. Первый будет оканчиваться 19-ю аминокислотами от 2A справа (на C-конце), а второй всегда будет начинаться с пролина — последней (20-й) аминокислоты 2A (рис. 3).

Механизм

Если синтезировать короткий белок с 2A в середине искусственно, с помощью химического синтеза, он никогда не распадается на две части и не разрезает другие белки. Это показывает, что 2A не является ферментом-протеазой, который режет полипетидные цепочки, в том числе и собственную . Каким же образом 2A вызывает образование двух белков там, где ДНК, а затем и РНК кодирует один?

А ведь белки способны на самомодификацию — не только «саморазрезание», но и «самовырезание» фрагментов из середины: «Белки против РНК — кто первым придумал сплайсинг?» [5]. — Ред.

Первый намек на механизм действия 2A был получен в экспериментах на пекарских дрожжах — тех самых, которые производят хлеб, вино и пиво [2]. Кроме этой полезной деятельности, дрожжи используются во многих молекулярно-биологических экспериментах, поскольку, как и человеческие клетки, содержат ядро, и многие процессы в них протекают сходно. В то же время, дрожжи растут на более простых, а значит, более дешёвых средах, делятся гораздо быстрее человеческих клеток, и существуют масса возможностей генетических манипуляций с ними.

Одна из клеточных органелл, которые есть и у дрожжей, и у человека — эндоплазматический ретикулум (ЭР). Он состоит из окруженной двуслойной липидной мембраной сети каналов, по которым транспортируются различные вещества.

Белки, которые будут транспортироваться по ЭР, синтезируются рибосомами, прикрепляющимися к ЭР со стороны цитоплазмы через белок-рецептор. При этом синтезируемый белок из рибосомального тоннеля сразу поступает внутрь канала ЭР. Это свойство рибосом было использовано для проверки, не разрезает ли белки, содержащие 2A, какая-нибудь клеточная протеаза, потому что к белку, синтезируемому прикрепленной к ЭР рибосомой, у протеазы доступа нет.

Молекулы ДНК, содержащие модифицированные гены зеленого флуоресцентного белка (ЗФБ), дрожжевого преальфафактора (ПАФ) и 2A были трансформированы в клетки дрожжей (рис. 4). ПАФ имеет сигнальную последовательность, которая вызывает его транспорт в ЭР и при присоединении к любому белку продолжает действовать так же. ЗФБ, мало того, что является стандартным экспериментальным белком в клеточной биологии, так ещё и светится, и его можно увидеть в ЭР клеток дрожжей под микроскопом .

Смотри также: «Флуоресцирующая Нобелевская премия по химии» [6]. — Ред.

Если сигнальная последовательность, которая должна вызывать транспорт белка в эндоплазматическую сеть, была на первом гене, первый белок с прикрепленным к нему 2A транспортировался в ЭР, а второй белок оставался в цитоплазме. Если только второй белок содержал сигнальную последовательность, в ЭР транспортировался только он. Это означает, что:

• Поскольку цитоплазматические протеазы не имеют доступа внутрь рибосомы, реакция, приписываемая 2A, не имеет к этим протеазам отношения;
• Рибосома определяет конец синтеза первой части белка как конец синтеза белка вообще и отсоединяется от белка-рецептора.

Следующим этапом исследования механизма действия 2A был поиск клеточных белков, которые принимают участие в реакции. Как сказал предтеча «C.S.I.: Место преступления» Шерлок Холмс: «Если отбросить невозможное, то всё, что останется, каким бы невероятным оно не казалось, должно быть истиной». Участие факторов терминации в гидролизе тРНК на смысловом кодоне было маловероятно, поскольку разделение белков, вызываемое 2A, происходит с вероятностью, близкой к единице, в то время как вероятность терминации на любом смысловом кодоне — около 10⁻⁶. Однако мы решили проверить эту возможность.

Для проверки вероятного участия факторов теминации в реакции, вызываемой 2A, уже упоминавшийся ген-«склейка» ПАФ—2A—ЗФБ экспрессировали в дрожжевых клетках [3]. Оказалось, что в клетках, мутантных по факторам терминации ФТ1 или ФТ3, продукция большого числа молекул 2A приводит к гибели клеток, — вероятно, потому что факторы терминации не могут действовать эффективно на клеточных РНК в присутствие большого числа синтезируемых молекул 2A. Осаждение отдельных частей белка с помощью антител показало, что клетках, мутантных по ФТ1 или ФТ3, а также клетках, в которых образование прионов уменьшает количество активного ФТ3, образуется меньше двух продуктов реакции с 2A и больше — «нормального», не разрезанного, белка. Эти эксперименты показывают, что факторы терминации принимают участие в разделении синтезируемого белка с 2A надвое.

Одним из контрольных экспериментов для подтверждения этой гипотезы было воспроизведение реакции in vitro. В бесклеточных экстрактах было показано, что для прохождения реакции РНК, кодирующей 2A, достаточно было иметь все кодоны, включая кодирующий последнюю аминокислоту 2A, P19 [4]. В этом случае можно видеть, как пептид отделяется от последней тРНК. Последующие кодоны не нужны, то есть достаточно иметь кодон в последнем, А-сайте рибосомы, где обычно присоединяются факторы терминации.

К нашему удивлению, замена кодона для P19 стоп-кодоном привела к остановке реакции, то есть тРНК оставалась прикрепленной к пептиду. Очевидно, в случае «странного пептида 2A» конфигурация рибосомы позволяет факторам терминации либо узнавать стоп-кодон, либо выполнять свою обычную функцию: катализировать отделение тРНК от пептида.

Многие белки человека состоят из нескольких отдельных субъединиц (полипептидов), и для лечения некоторых заболеваний нужно экспрессировать все эти полипептиды одновременно, причем — в равной пропорции. Поскольку 2A предложено использовать в генной терапии для одновременного производства нескольких отдельных белков с одного вектора (вместо использования нескольких векторов), данные эксперименты поднимают пока неотвеченный вопрос о том, что произойдет с клетками человека, в которых 2A продуцируется долго и в больших количествах.

Второй вопрос еще менее изучен: каким образом рибосома остается прикрепленной к мРНК после терминации на 2A, и что позволяет ей начинать синтез второй части белка в отсутствие стартового AUG.

Литература

1. Pablo de Felipe, Garry A. Luke, Lorraine E. Hughes, David Gani, Claire Halpin, Martin D. Ryan. (2006). E unum pluribus: multiple proteins from a self-processing polyprotein. Trends in Biotechnology. 24, 68-75;
2. Pablo de Felipe, Lorraine E. Hughes, Martin D. Ryan, Jeremy D. Brown. (2003). Co-translational, Intraribosomal Cleavage of Polypeptides by the Foot-and-mouth Disease Virus 2A Peptide. J. Biol. Chem.. 278, 11441-11448;
3. V. A. Doronina, C. Wu, P. de Felipe, M. S. Sachs, M. D. Ryan, J. D. Brown. (2008). Site-Specific Release of Nascent Chains from Ribosomes at a Sense Codon. Molecular and Cellular Biology. 28, 4227-4239;
4. Fu Yan, Victoria A. Doronina, Pamila Sharma, Jeremy D. Brown. (2010). Orchestrating ribosomal activity from inside: effects of the nascent chain on the peptidyltransferase centre: Figure 1. Biochm. Soc. Trans.. 38, 1576-1580;
5. Белки против РНК — кто первым придумал сплайсинг?;
6. Флуоресцирующая Нобелевская премия по химии.