Если проникнуть на обширную территорию Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН со стороны улицы Миклухо-Маклая в Москве и начать обход территории против часовой стрелки, дорога сначала пройдет мимо мемориальной березовой аллеи, потом — вдоль стоящих «книжкой» шестиэтажных корпусов, в которых на фото со спутника без труда различаешь эмблему самого Института и одновременно двойную спираль ДНК. Чуть дальше во внутреннем дворе расположено строение, больше всего напоминающее бывшую компрессорную (потому что это она и есть), куда то и дело из одного из основных корпусов пробегают молодые ребята со странными ампулами, напоминающими больше всего стеклянные трубочки. Это — сотрудники Лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН, которые изучают строение главных биологических молекул — белков — на уровне отдельных атомов.

Ядерный, магнитный, резонансный

В основе арсенала, который используют в этой лаборатории, лежит метод с довольно грозным названием — спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Страшный «ядерный» эпитет в этом названии не имеет никакого отношения к ядерным взрывам, ядерным реакциям и радиоактивности ; более того, физические принципы ЯМР используются в медицине для диагностики, и, чтобы не пугать пациентов, врачи называют этот метод МРТ — магнитно-резонансная томография. Физическая база метода — облучение образцов (раствора белковых молекул) импульсами сильного переменного электромагнитного поля на фоне сильного же, но постоянного, магнитного поля. В результате этого ядра атомов, обладающие собственным магнитным моментом, который неразрывно связан с собственным моментом вращения ядра (спином), переходят в возбужденное состояние. Спины ядер, подобно «магнитикам», «переворачиваются» в пространстве, меняя свою ориентацию относительно направления приложенного постоянного магнитного поля, и начинают сами излучать электромагнитный сигнал, который регистрируется сверхчувствительным датчиком. Так вышло, что в «обычных» биологических молекулах активными с точки зрения ЯМР являются только атомы водорода (протоны), однако по их сигналам восстановить строение крупной биомолекулы невозможно. Для серьезных задач приходится получать изотопно-меченные молекулы, например, содержащие вместо «обычных» углерода или азота (¹²C и ¹⁴N) их изотопные (но не радиоактивные) аналоги (¹³C и ¹⁵N, соответственно); иногда в ход идут и другие изотопы. Результатом являются ЯМР-спектры, расположение пиков в которых говорит о химическом сдвиге отдельных атомных ядер, связях между атомами, и, следовательно, о химическом строении и пространственной структуре образца (некоторые подробности приведены во врезке).

Однажды одну из сотрудниц лаборатории спросили, чем она занимается. Ответ был: «выращиваю мутантов галобактерий для ядерного магнитного резонанса». Звучит страшно для обывателя, но, что характерно, является чистой правдой.

Все эти измерения проводят на очень сложном и дорогом оборудовании — ЯМР-спектрометре, состоящем из сверхпроводящего магнита, внутрь которого помещают образец (те самые ампулы-трубочки из тонкого стекла), импульсной катушки (возбуждающей магнитные ядра для прецессии в заданной последовательности и одновременно регистрирующей магнитные «отклики» атомов), компьютеров и обслуживающего оборудования. Та самая компрессорная, у которой мы остановились в самом начале статьи, была переоборудована в специальное помещение для ЯМР-спектрометров, больше всего напоминающее цех: прецизионные кондиционеры, вход по магнитным картам, прочный фундамент и покрытие пола, балка крана под потолком. А главное, в зале торжественно возвышаются здоровенные «бочки» сверхпроводящих магнитов, установленные на пневматическом основании для компенсации малейших вибраций.

Сотрудники Лаборатории с гордостью рассказывают, что сегодня место их работы — один из крупнейших в мире центров в области изучения строения биополимеров и самая большая ЯМР-лаборатория к востоку от Праги (и, видимо, к западу от Сеула). Инструментальную базу составляют три современных спектрометра фирмы Bruker cерии Avance с рабочими частотами на протонах 600, 700 и 800 МГц, оснащенных криодатчиками (рис. 1). Для одного из приборов (800 МГц) имеется датчик с вращением образца под магическим углом, что позволяет исследовать биополимеры методами ЯМР твердого тела. Впрочем, есть у всего этого великолепия и обратная сторона: каждый такой спектрометр стоит сотни миллионов рублей, а на сумму ежегодного обслуживания трех приборов (закупка жидких газов — азота и гелия, необходимых для работы сверхпроводящего магнита, — сервис криодатчика и всякий ремонт) можно было бы каждый год покупать однокомнатную квартиру в столице. Конечно, поиск средств на поддержание этого арсенала в рабочем состоянии становится непростой задачей, и, честно говоря, является для руководства Лаборатории больной темой.

Зачем нужна структурная биология

Метод ЯМР-спектроскопии — один из трех основных подходов к изучению строения и динамики биологических молекул на уровне отдельных атомов. Исторически самый первый, и, пожалуй, до сих пор лидирующий метод — это рентгеноструктурный анализ, основанный на кристаллизации образца, дифракция рентгеновских лучей от которого позволяет судить о расположении атомов и строении молекул. В последние пять лет на пятки ему наступает метод криоэлектронной микроскопии, в котором картины электронной плотности с единичных частиц (например, крупных белковых комплексов), объединенные с помощью алгоритмов трехмерной компьютерной реконструкции, позволяют получать достаточно качественные структуры биологических молекул. В отличие от этих двух методов, для работы ЯМР белковые молекулы не нужно кристаллизовать или замораживать до близких к абсолютному нулю температур, а достаточно исследовать их водные растворы. Это обстоятельство позволяет надеяться, что биомолекулы изучают в условиях, наиболее близких к природным. Впрочем, как было сказано выше, их почти всегда нужно метить спин-активными изотопами, что привносит в эксперимент довольно сложную стадию биоинженерного получения образца.

Однако зачем же вообще нужно знать трехмерную структуру биомолекул? Дело в том, что одна из ключевых концепций молекулярной биофизики гласит, что функция молекул неразрывно связана с их строением и динамикой, а значит, эту триаду надо изучать в совокупности. И, зная структуру, мы сможем многое сказать о фундаментальных процессах молекулярной биологии, в том числе изучить причины возникновения заболеваний. А знание причины заболевания — уже половина пути к его излечению. Перефразируя, можно сказать, что знание структуры биомолекул и способа их взаимодействия между собой есть бесценное подспорье для поиска или создания лекарства, способного вылечить или скорректировать болезнь. Вот как применение метода описывает заведующий Лабораторией биомолекулярной ЯМР-спектроскопии Александр Сергеевич Арсеньев:

—  Овчинников в свое время создал биологическую станцию в Перу и отправил туда Гришина <Евгений Васильевич Гришин, академик, зам. директора ИБХ РАН>. А он, в свою очередь, привлек своего толкового сотрудника — Кирилла Плужникова, который наловил там местных муравьев, «подоил» их и выделил какой-то белок. Приехал обратно, отсеквенировал его и не знал, что с ним делать. А поскольку у меня с Кириллом были очень хорошие отношения, он пришел ко мне и говорит: «Не глянешь?» — «Ну, давай посмотрим».

Сразу стало ясно, что задача для начала 90-х годов сложная. Белка очень мало (3 мг), и больше его уже не будет (биостанцию в Перу к тому моменту уже сожгли повстанцы), изотопно-меченного белка нет и не будет, да еще и в самом белке 14 из 71 остатков — лизины, а две цепи белка сильно гомологичны друг другу. Все это значило, что сложности в отнесении ЯМР-сигналов гарантированы. Но были и хорошие новости: белок очень хорошо растворим в воде, и примесей в образце не видать. У меня как раз студент диплом защитил, работать летом хотел. Однако боязно было такой редкий образец доверять студенту, и поэтому я попросил научного сотрудника Александра Соболя приглядеть за молодым студентом Дмитрием Нольде.

Мы сделали структуру этого белка — он получил название эктатомин — в воде. Там было: две шпильки α-спиральные, дисульфидные мостики в каждой, а перемычки двух шпилек соединены еще одним мостиком. Стали думать, как этот токсин в клетку лезет. И тут я сказал, так ведь если белок развернется, то он с мембраной может связаться, а потом из нескольких молекул (две или больше) и канал в мембране может образоваться. Мне сначала сказали, что это фигня, но, поскольку в целом доверяли, позволили доказать это. Лёня Барсуков со Славой Сухановым долго мучились, но в конце концов показали, что, если к бислойной мембране добавить эктатомин, появляется проводимость, и зависимость от концентрации квадратичная (значит, из двух молекул канал собирается). То есть, по существу, структура позволяет предположить функцию, а потом и доказать ее. А за этим уже идет дизайн лекарств и так далее. Например, более слабый лиганд станет более активным или какой-то рецептор станет более адекватно реагировать на стимул. А еще оказалось, что эктатомин растворим не только в воде, но и в метаноле, и в хлороформе.

Кстати, Плужников так и не опубликовал работу по секвенированию эктатомина. Поэтому структура белка появилась сначала в базе данных пространственных структур белков (PDB), а оттуда попала в базу данных первичных последовательностей (SwissProt) с тегом «sequence derived by NMR».

Исходно возникший как метод установления химической (а не пространственной!) структуры простых химических веществ, метод спектроскопии ЯМР очень возмужал за последние тридцать лет (см. врезку), и теперь область его преимущественного применения — это изучение строения биологических молекул, в первую очередь, белков и их комплексов. Первые структуры белков, полученные методом ЯМР, относились к небольшим водорастворимым пептидам, но в наши дни потолок размера молекул, поддающихся изучению, существенно поднят, и в эксперимент теперь можно вводить мембраноподобные среды, необходимые для изучения мембранных белков. Кстати, исследование именно мембранных белков, к которым относится множество важнейших рецепторов, — одна из специализаций Лаборатории.

Страницы истории

История создания Лаборатории биомолекулярной спектроскопии неразрывно связана с историей самого Института биоорганической химии и именами его создателей — Михаила Михайловича Шемякина и Юрия Анатольевича Овчинникова. Их чувство предвидения подсказало, что будущее биохимии лежит в области изучения пространственной структуры и динамики биомолекул, и в 1965 году в ИБХ была создана группа ЯМР-спектроскопии под руководством Владимира Фёдоровича Быстрова (рис. 2), одним из первых в мире начавшего заниматься исследованием конформационных состояний белково-пептидных систем в растворе. Под его руководством в 70-х — начале 80-х годов разработаны основы современных методов изучения пространственной структуры белков в растворе, а именно, схема последовательного отнесения сигналов в спектрах ЯМР при помощи гетероядерных констант спин-спинового взаимодействия, классификация аминокислотных остатков по типам спиновых систем и методика определения локальной конформации белков по данным спектроскопии ¹Н-ЯМР.

Начиная с 1990 года и по сей день Лабораторию возглавляет Александр Сергеевич Арсеньев, защитивший в ИБХ сначала кандидатскую, а потом и докторскую диссертации под руководством В.Ф. Быстрова. Арсеньев так рассказывает о становлении в ИБХ методики ЯМР-спектроскопии:

— Овчинников — кажется, в 1978 году это было, — прямо с трибуны критиковал Быстрова за то, что очень уж медленно все это движется. ЯМР он считал перспективным методом, но все же не верил, что при его жизни он «выстрелит», сработает. Что, впрочем, не мешало ему ставить самые амбициозные задачи — уже тогда единственно достойной целью он обозначал получение структуры больших белков, причем желательно — мембранных. Но метод сработал, и даже очень эффектно.

Одним из первых Арсеньев провел полное отнесение сигналов в спектре ЯМР белка (1981 г., ингибитор трипсина) и впервые в мире получил координаты атомов белка в растворе (1984 г., инсектотоксин) (рис. 3). Дополнительный импульс развитию ЯМР-спектроскопии придала стажировка Арсеньева в швейцарской лаборатории Курта Вютриха — пионера биомолекулярной ЯМР-спектроскопии и лауреата Нобелевской премии по химии 2002 года. Кстати, эта командировка, как и многие другие, была инициирована самим Овчинниковым, который настаивал на том, чтобы его молодые сотрудники учились «из первых рук» в самых передовых лабораториях мира. Полученный опыт и умения легли в основу российской школы ЯМР-спектроскопии.

Согласно заветам Овчинникова, ключевой специализацией Лаборатории стало изучение структуры и функций мембранных и мембрано-активных белков и пептидов, лиганд-рецепторных взаимодействий, а также белок-мембранных комплексов. В частности, в 1985 году впервые в мире установлено строение трансмембранного ионного канала — грамицидина А. Но обо всем по-порядку.

Бактериородопсин и G-белоксопряженные рецепторы

Бактериородопсин — светозависимый протонный насос — был выделен в далеком 1971 году из пурпурной мембраны галобактерий, живущих в соленых озерах. Этот сложный и интересный мембранный белок оказался настолько прост в выделении и удобен для экспериментов, что в науке быстро образовалась отдельная прослойка «бакродопсинщиков» — ученых, которые занимаются исключительно бактериородопсином, изучая все его мутанты при всех возможных условиях всеми возможными методами. В конце 1970-х группа под руководством Ю.А. Овчинникова включилась в соревнование по установлению аминокислотной последовательности бактериородопсина; конкурентом Овчинникова был нобелевский лауреат Г. Корана из США. Группа Овчинникова опередила американских коллег, впервые установив аминокислотную последовательность мембранного белка (1978 г.). К сожалению, Овчинников с коллегами допустили несколько ошибок в последовательности, на которые не замедлили указать конкуренты в последующей публикации.

Бактериородопсин состоит из семи трансмембранных спиралей, каждая из которых была исследована по-отдельности в 1988–2000 годах в лаборатории ЯМР под руководством В.Ф. Быстрова, а затем А.С. Арсеньева. Структура каждой из семи отдельных трансмембранных α-спиралей бактериородопсина стала тем «испытательным стендом», на котором новые сотрудники лаборатории оттачивали свое мастерство в интерпретации сложных ЯМР спектров: Иннокентий Масленников, Эдуард Бочаров, Дмитрий Нольде, Александр Соболь, Андрей Ломизе, Игорь Барсуков, Константин Первушин, Владислав Орехов стали соавторами большой серии публикаций в этой области. Их работа заложила стандарты качества, которые лаборатория держит и по сей день.

В 2010 году после почти 10-летнего перерыва тема бактериородопсина была поднята с запылившейся полки. Сегодня Сергей Гончарук и Максим Дубинный отрабатывают на полноразмерном бактериородопсине методы работы с большим трансмембранным семиспиральным белком в активном и полностью функциональном состоянии. Но бактериородопсин — всего лишь модель для изучения гораздо более интересных объектов — G-белоксопряженных рецепторов (GPCR) , а это мембранные рецепторы света, запаха, вкуса, сенсоры гормонов и сигнальных веществ, разбросанные по всему телу.

Прототипическим GPCR является фоторецептор сетчатки родопсин («Зрительный родопсин — рецептор, реагирующий на свет» [8]), строение которого было установлено в уже далеком 2001 году. Спустя 6 лет упорного труда исследователи Стивенс и Кобилка получили структуру β₂-адренорецептора (в том числе, в активной форме) [9], [10], ну а дальше структуры GPCR посыпались как из рога изобилия [11]. В 2012 году за изучение G-белоксопряженных рецепторов была вручена Нобелевская премия [12].

В 2007 году Лаборатория настолько разрослась (рис. 1, справа внизу и рис. 4), что на ее основе был организован Отдел структурной биологии, куда, кроме самой Лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии, вошли Лаборатория моделирования биомолекулярных систем и Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул, о которых мы как-нибудь расскажем отдельно. Примерно тогда же прежние помещения Лаборатории, в которых были установлены спектрометры предыдущего поколения, перестали устраивать по размеру и техническому оснащению, и был «освоен» находящийся на территории института неподалеку ветшающий корпус бывшей компрессорной станции, который переоборудовали под зал для трех новых ЯМР-спектрометров.

Мембранные каналы и рецепторы

Сегодня лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии — это крупнейший центр структурной биологии в России, а кроме того, одно из главных мест подготовки научных кадров в области физико-химической биологии. Заведующий лабораторией А.С. Арсеньев возглавляет кафедру физико-химической биологии и биотехнологии на Факультете биологической и медицинской физики в МФТИ, созданную еще Овчинниковым, и поэтому недостатка в молодых дарованиях лаборатория не испытывает. Хотя дело, конечно, не столько в этом, сколько в возможности приобщиться к настоящей науке и поработать на уникальном оборудовании, позволяющем «заглянуть внутрь» биологических молекул и разобраться, как они устроены и работают.

Исторически сложилось (смотри предыдущие разделы), что Лаборатория сильна в первую очередь умением исследовать мембранные белки, и одной из ключевых мишеней изучения в последние десять лет стали трансмембранные (ТМ) домены рецепторных тирозинкиназ — большого семейства рецепторов, играющих особую роль для многоклеточных организмов, поскольку именно они управляют ростом, делением, дифференцировкой и даже смертью клеток, как бы «дирижируя» клеточным ансамблем в составе организма. Например, это рецепторы факторов роста клеток: хотя их вне- и внутриклеточные домены весьма внушительны по размеру, ТМ-домен представляет всего лишь пару скрещенных α-спиралей (по одной из каждой молекулы рецептора — они функционируют в паре, как димер). Сравнительно простое устройство мембранной части позволяло надеяться, что с помощью ЯМР-спектроскопии можно будет быстро расшифровать механизм активации рецепторов, а значит, научиться управлять ими, заодно взяв под контроль процессы роста и деления клеток. А это важно, ведь когда эти процессы выходят из-под контроля, развивается рак.

Самый существенный вклад в эту тематику сделал Эдуард Бочаров : на его счету не менее десяти структур ТМ-димеров, выглядящих как скрещенные на удачу пальцы [13–16]. Заядлый лыжник, любитель попариться в бане и выпить пива в яблоневом саду близ ИБХ за разговорами о науке, Эдик среди фактов своей биографии указывает, что он был когда-то корневщиком и звероловом в тайге Приморья. На работе в кадке у него растет лимон, и он доверительно сообщает многим, что каждый вызревший плод подкрепляется научной публикацией. У Эдика трое детей — все мальчики, — а его жена Ольга работает в этой же лаборатории, только специализация у нее не ЯМР-спектроскопия, а белковая инженерия: прежде чем ампулу с образцами ТМ-доменов (например, рецептора фактора роста фибробластов FGFR3) можно будет опустить в жерло ЯМР-спектрометра, этот образец нужно получить, а это не только биоинженерия и бактериальная наработка белка на обогащенной изотопами среде, но и дополнительные ухищрения, связанные со встройкой фрагментов рецептора в липидную среду, имитирующую мембрану, — например, мицеллы, бицеллы или нанодиски. Вместе с Ольгой работает Сергей Гончарук, а под их шефством — несколько аспирантов и студентов. Их общая задача — обеспечивать Лабораторию образцами исследуемых белков, а также совершенствовать систему бесклеточной трансляции, позволяющую производить белки не в бактериях, а в растворе, содержащем взвесь рибосом и все необходимые вещества. Помимо биоинженерии Сергей активно участвует в работе Совета молодых ученых ИБХ и руководит поддержкой и развитием институтского сайта.

Разумеется, в этой статье не было цели дотошно рассказать обо всех прошлых и текущих проектах, а также обо всех сотрудниках лаборатории. Так что прошу относиться к представленным сведениям как к немного субъективной и поверхностной картине, подернутой налетом импрессионизма. — А.Ч.

Достаточно подробно о значении рецепторных тирозинкиназ (РТК) рассказывается в статье об открытом в ИБХ же (но в другой лаборатории) рецепторе щелочного pH, принадлежащем к этому же классу: «Рецептор “нетрадиционной ориентации”» [17]. Дополнительные детали о РТК, изучаемых в лаборатории Арсеньева, можно найти в пресс-релизе на сайте ИБХ: «Путь к изучению рецепторных тирозинкиназ» [18].

В этой статье не нашлось места крупным шрифтом написать про еще одно направление исследований, целиком посвященное разработке мембраномоделирующих сред [16], [19–22]. Это крайне важно для техники ЯМР-эксперимента, поскольку открывает принципиальную возможность изучить белок, но менее интересно с точки зрения биологии, потому что эти среды имеют не так уж много общего с полноразмерной мембраной клетки, где находятся мембранные белки в природе. — А.Ч.

Главный последователь Эдуарда — Константин Минеев, который, набив руку на определении структуры димеров ТМ-фрагментов этих рецепторов, стал больше внимания уделять биофизике белкового фолдинга, — а именно, как происходит сворачивание белковой молекулы в неполярной среде биомембран [23], [24]. Мембрана вообще — один из ключевых факторов возникновения жизни в ее современной форме [25], а встроенные в мембрану рецепторы и каналы — одни из самых важных белков. Кстати, примерно каждый третий белок в нашем организме — мембранный. Костик считает, что скоро не останется ни театра, ни кино — один сплошной ЯМР. (Ну это шутка сейчас была.) На самом деле, у Константина много увлечений, и одно из них — бридж, на чемпионаты по которому он ежегодно ездит со своим другом, руководящим в ИБХ группой молекулярных инструментов для нейробиологии, — Александром Василевским.

Кстати, самая лучшая дружба у ученых бывает, когда их связывает (кроме бриджа) еще и научная работа. Саша часто приносит Костику свои образцы для исследований, а это в основном нейротоксины из ядов различных животных и защитные пептиды растений , и таким образом в ИБХ формируется полный цикл исследований биологически активных веществ: от открытия и биохимической характеристики до установления пространственной структуры и выяснения механизмов действия. Правда, в последнее время что Саша, что Костик как-то повзрослели и имеют под своим началом собственных студентов и аспирантов, и теперь уже их подопечные ходят друг к другу с научным сотрудничеством, — конечно, после утвердительного звонка одного «шефа» другому.

История так сложилась, что в Институте биоорганической химии (ранее — Институте химии природных соединений) очень любят изучать яды, поскольку это неистощимые источники биологически активных веществ, обладающих, как правило, активностью в отношении целого спектра мишеней в нервной системе. Поэтому еще со времен Овчинникова изучением этих молекул занимается не одна, а по меньшей мере пять лабораторий Института. В этой связи возникло немало коллабораций внутри ИБХ [26]. — А.Ч.

Но мы отвлеклись. Другим учеником Эдуарда является Кирилл Надеждин (тоже приятель Костика и Саши), главной темой которого стал предшественник β-амилоида — белок, которому приписывают роковую роль в развитии печально известной болезни Альцгеймера, которая многих оставляет без ума [27]. Этот предшественник также является мембранным белком (хотя сам β-амилоид — нет), и методика его изучения во многом напоминает исследования ТМ-димеров рецепторов факторов роста. Эдуард и Кирилл исследуют, как мутации, которые влияют на вероятность возникновения болезни Альцгеймера, отражаются на структуре белка-предшественника и его способности к димеризации [28], [29]. Возможно, когда этот пазл будет собран, ребятам удастся предложить лекарство, тормозящее развитие этого заболевания.

Кстати, Кирилл активно способствует воплощению образовательной миссии Лаборатории — несмотря на молодой возраст, он занимает пост заместителя декана на факультете ФБМФ на Физтехе — том самом, на котором Арсеньев заведует «овчинниковской» кафедрой.

Впрочем, что предшественник β-амилоида, что димеры ТМ-фрагментов рецепторных тирозинкиназ — белки маленькие. Захар Шенкарев пытается выжать из метода ЯМР-спектроскопии максимум, изучая с ее помощью ионные каналы — мембранные белки, проводящие через непроницаемую в норме мембрану ионы и воду. В частности, потенциал-чувствительные каналы натрия и калия играют ключевую роль в формировании и проведении нервного импульса, и Захар с коллегами пытаются разобраться в строении вольт-сенсоров этих каналов, а также в распознавании их нейротоксинами — молекулами животных ядов, вмешивающихся в работу этих каналов и способных вызвать судороги или паралич (а попробуйте отличить одно от другого!) [30], [31].

ЯМР и нейротоксины

Другой фронт работы Захара — определение 3D-структур небольших растворимых белков, чаще всего нейротоксинов [32–36] (в сноске выше по тексту объясняется, откуда в ИБХ такая повсеместная страсть к данным ядовитым молекулам). Чаще всего это «заказ» от дружественных лабораторий, — например, учебно-научного центра, в котором его руководитель Татьяна Владимировна Овчинникова возглавляет направление по изучению антимикробных пептидов, или от жены самого Захара Екатерины Люкмановой, совместная работа которых в настоящее время посвящена эндогенным нейромодуляторам человека [37], [38], по загадочной причине структурно напоминающим некоторые токсины из ядов змей, также в свое время плотно исследованных в Лаборатории. Захар и Катя вместе заканчивали Физтех, и в свое время соревновались, кто первым защитит диссертацию. Кандидатскую диссертацию первой защитила Катя, но она же первой родила ребенка (теперь их уже трое), а поэтому на докторской Захар обошел-таки супругу.

С Захаром и Катей плотно работает Саша Парамонов, который, кроме таланта структурного биолога, известен также страстью к ремонту электроники (например, перепайке разъемов в сломанных смартфонах). Саша, как в шутку говорит Захар, — единственный сотрудник лаборатории, который «не боится» осциллографа. Между прочим, Саша — выпускник Биофака МГУ, в то время как «боящиеся» электроники научные сотрудники — в большинстве своем, выпускники Физтеха (МФТИ), который славится своей технической подготовкой и специальными «радиолабами» на 3-м курсе. Ну а если серьезно, то Саша под руководством Захара впервые в лаборатории получил полное отнесение сигналов крупного мембранного белка — вольт-сенсорного домена калиевого канала, про который мы говорили выше.

Разработкой новых разновидностей ЯМР-эксперимента, а также изучением нейротоксинов в Лаборатории занимается Дмитрий Лесовой, а Светлана Нольде использует тонкие данные, получаемые из этих экспериментов, для отработки протоколов молекулярной динамики (это компьютерные расчеты «поведения» молекул) и сравнивает различные силовые поля на предмет совместимости с экспериментальными данными, получаемыми в подходе ЯМР.

Светящаяся химия

Биомакромолекулы — не единственный прицел Лаборатории ЯМР. Исходной задачей метода было установление химической структуры малых молекул, и с ней удается хорошо справляться до сих пор. Максим Дубинный (рис. 5), главный специалист по спектроскопии низкомолекулярных соединений как ученик и преемник вышедшей уже на пенсию Тамары Андреевны Балашовой, принимает активное участие в установлении химической структуры природных люциферинов — веществ, подобных тому, благодаря которому светится светлячок [39–43]. Эта задача стала предметом еще одного сотрудничества — на этот раз с группой синтеза природных соединений ИБХ, возглавляет которую Илья Ямпольский. Несколько лет назад Илья познакомился в Красноярске с исследователями, много лет потратившими на изучение светящегося червяка сибирских почв Fridericia heliota. Люминесцентный червь привлек к себе внимание красноярских биологов Валентина Петушкова и Натальи Родионовой, — так началась совместная работа двух лабораторий ИБХ и Красноярского института биофизики.

Метод ЯМР хотели применить для того, чтобы установить химическую формулу люциферина — вещества, светящегося в процессе своего окисления ферментом люциферазой. Но люциферина было крайне мало, и по спектрам ЯМР удалось установить лишь исходные «строительные блоки», а полная картина вырисовалась лишь после того, как в группе Ямпольского на основе ЯМР- и масс-спектрометрических данных синтезировали несколько возможных вариантов люциферина, и один из них засветился, как природная молекула. Самый нервический момент во всей истории был, когда Максим держал в руках пробирку с 5 микрограммами люциферина, выделенного в результате трех лет (!) ночных «раскопок» в сибирских лесах, а подошедший сзади Арсеньев сказал: «Чего это у вас тут?» От неожиданности Макс выронил пробирку.

Да, от неожиданности Макс выронил открытую пробирку. Но ребятам невероятно повезло: легкая ампула не разбилась о кафельный пол, а невидимая глазу крупинка действующего вещества не была унесена случайным сквозняком. Несколько недель спустя настал момент истины: Максим и Илья установили «восьмую формулу света» [44], [45]. Но на этом работа не кончилась: за восьмой формулой последовала и девятая (люциферин грибов) [46], да и на этом погоня за биосветом вряд ли прекратится!

Сотрудничество — от слова «труд»

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии имеет обширную сеть коллабораций как в самом институте, так и за его пределами, в том числе и за пределами страны. В ИБХ это — уже упомянутые совместные проекты с токсинщиками (Отделы молекулярных основ нейросигнализации и молекулярной нейробиологии, Учебно-научный центр), химические истории с биолюминесценцией (Группа синтеза природных соединений) и структурой синтетических липидов (Лаборатория химии липидов) и компьютерное моделирование динамики тех белковых молекул, структуры которых получают в ЯМР-лаборатории. Правда, завлаб Арсеньев не очень-то доволен выстроившимися в Лабораторию очередями на определение структуры многочисленных пептидов и прочих веществ: поддержка ЯМР-спектрометров в рабочем состоянии обходится настолько дорого, что возникает желание разделить эту ношу с коллабораторами, но какой-то разумной практики на этот счет пока не существует.

Последний упомянутый пункт в предыдущем абзаце — многочисленные формы сотрудничества с Лабораторией моделирования биомолекулярных систем (ЛМБС) — имеет долгую историю и много граней. Начать с того, что эти две лаборатории входят в Отдел структурной биологии ИБХ (наряду с Лабораторией оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул), а до 2007 года и вовсе были одной лабораторией: нынешний руководитель «модельщиков» Роман Гербертович Ефремов заведовал группой молекулярного моделирования в составе Лаборатории. ЯМР-щики и моделисты, почти не прекращая, спорят о том, чей метод лучше: первые уверены, что только ЯМР дает правильную структуру и динамику молекул без артефактов, в то время как вторые уверяют, что и без эксперимента могут рассчитать все, как надо. Особенно интенсивно (но и продуктивно) эти споры развернулись на поле структуры димеров ТМ-фрагментов рецепторных тирозинкиназ в мембране, а также роли самой мембраны в межмолекулярном распознавании рецепторами друг друга и активации ими внутриклеточных каскадов. Самые продуктивные споры с участием Эдуарда и сотрудников ЛМБС Павла Волынского и Антона Полянского не раз затягивались сильно заполночь, но и результаты в форме совместных публикаций и свежего взгляда на биофизику мембран и мембранных белков не заставляют себя ждать.

Среди других коллабораторов, за пределами ИБХ и России, можно назвать лабораторию Валентина Горделия (Долгопрудный (МФТИ) / Гренобль, Франция), совместно с которой идет отработка ЯМР-техники изучения бактериородопсинов и G-белоксопряженных рецепторов. Идет совместная работа с лабораторией Майкла Вейта в Берлине — объектом изучения является гемагглютинин вируса гриппа. Активное сотрудничество по исследованию рецепторных тирозинкиназ породило не менее трех коллабораций — с Куртом Бальмером-Хофером в Швейцарии (исследование рецепторов фактора роста сосудистого эндотелия), Марсалом Вилларом в Испании (исследование рецептора нейротрофинов р75), Калиной Христовой в США (исследование рецептора фактора роста фибробластов). Совместная работа с Герхардом Вагнером в США направлена на развитие техники ЯМР-эксперимента. Кстати, многие из этих партнерств ведут свое начало еще со стажировки Арсеньева в Швейцарии у Вютриха, а ведь на этом контакты с этой страной не кончаются: исследовательское подразделение фармгиганта «Новартис» в Базеле не раз прибегало к помощи русских ЯМР-щиков.

Многие бывшие сотрудники Лаборатории работают сейчас в других странах. Владислав Орехов, Максим Майзель, Иннокентий Масленников, Александр Соболь, Константин Первушин, Игорь Барсуков, Алексей Луговской, Евгений Тищенко, Андрей Ломизе, Владимир Майоров, Александр Голованов, Анастасия Журавлева, Сергей Крачковский, Ирина Безсонова, Дмитрий Коржнев — все они двигают структурную биологию, распространяя опыт, полученный в Москве в Лаборатории биомолекулярной спектроскопии. Многие из них стали самостоятельными профессорами и завлабами в известных университетах, кто-то предпочел работу в фирме.

Биомагнитная мясокрутка

Напоследок Арсеньев подводит резюме своему рассказу (рис. 6):

— Вообще ЯМР — мощный метод. Но, как любая по-настоящему стоящая вещь, он может использоваться по-разному. Можно природу изучать — но для этого устремление нужно и владение искусством. А можно, как и микроскопом, гвозди забивать. Помните, как один ученый человек в «Трудно быть богом» изобрел мясокрутку святого Мики? Вот и с ЯМР-ом так же.

Статья написана при активном участии Константина Минеева, Максима Дубинного, Павла Кузьмичева, Дмитрия Нольде и Александра Сергеевича Арсеньева.

Зеленым цветом отмечены работы, сделанные в Лаборатории.

Литература

1. Hiller S., Garces R.G., Malia T.J., Orekhov V.Y., Colombini M., Wagner G. (2008). Solution structure of the integral human membrane protein VDAC-1 in detergent micelles. Science. 321, 1206–1210;
2. Korzhnev D.M., Religa T.L., Banachewicz W., Fersht A.R., Kay L.E. (2010). A transient and low-populated protein-folding intermediate at atomic resolution. Science. 329, 1312–1316;
3. Ruschak A.M., Religa T.L., Breuer S., Witt S., Kay L.E. (2010). The proteasome antechamber maintains substrates in an unfolded state. Nature. 467, 868–871;
4. Latham M.P., Sekhar A., Kay L.E. (2014). Understanding the mechanism of proteasome 20S core particle gating. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111, 5532–5537;
5. Velyvis A., Kay L.E. (2013). Measurement of active site ionization equilibria in the 670 kDa proteasome core particle using methyl-TROSY NMR. J. Am. Chem. Soc. 135, 9259–9262;
6. Arseniev A.S., Kondakov V.I., Maiorov V.N., Bystrov V.F. (1984). NMR solution spatial structure of ‘short’ scorpion insectotoxin I₅A. FEBS Lett. 1, 57–62;
7. Arseniev A.S., Barsukov I.L., Bystrov V.F., Lomize A.L., Ovchinnikov Yu.A. (1985). ¹H-NMR study of gramicidin A transmembrane ion channel. Head-to-head right-handed, single-stranded helices. FEBS Lett. 2, 168–174;
8. Зрительный родопсин — рецептор, реагирующий на свет;
9. Рецепторы в активной форме;
10. Структуры рецепторов GPCR «в копилку»;
11. Нобелевская премия по химии (2012): за рецепторы наших первого, третьего и четвертого чувств;
12. Bocharov E.V., Mineev K.S., Volynsky P.E., Ermolyuk Y.S., Tkach E.N., Sobol A.G. et al. (2008). Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably orresponding to the receptor active state. J. Biol. Chem. 283, 6950–6956;
13. Bocharov E.V., Lesovoy D.M., Goncharuk S.A., Goncharuk M.V., Hristova K., Arseniev A.S. (2013). Structure of FGFR3 transmembrane domain dimer: implications for signaling and human pathologies. Structure. 21, 2087–2093;
14. Manni S., Mineev K.S., Usmanova D., Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Kirpichnikov M.P. et al. (2014). Structural and functional characterization of alternative transmembrane domain conformations in VEGF receptor 2 activation. Structure. 22, 1077–1089;
15. Mineev K.S., Goncharuk S.A., Kuzmichev P.K., Vilar M., Arseniev A.S. (2015). NMR dynamics of transmembrane and intracellular domains of p75NTR in lipid-protein nanodiscs. Biophys. J. 109, 772–782;
16. Рецептор «нетрадиционной ориентации»;
17. Зюлина В. (2015). Путь к изучению рецепторных тирозинкиназ. Сайт ИБХ;
18. Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N., Paramonov A.S., Shingarova L.N., Chupin V.V., Kirpichnikov M.P. et al. (2010). Lipid-protein nanodiscs as reference medium in detergent screening for high-resolution NMR studies of integral membrane proteins. J. Am. Chem. Soc. 132, 5628–5629;
19. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Gizatullina A.K., Zhuravleva A.V., Tagaev A.A. et al. (2013). Peptaibol antiamoebin I: spatial structure, backbone dynamics, interaction with bicelles and lipid-protein nanodiscs, and pore formation in context of barrel-stave model. Chem. Biodivers. 10, 838–863;
20. Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N., Paramonov A.S., Panteleev P.V., Balandin S.V., Shulepko M.A. et al. (2014). Lipid-protein nanodiscs offer new perspectives for structural and functional studies of water-soluble membrane-active peptides. Acta Naturae. 6, 84–94;
21. Mineev K.S., Bocharov E.V., Volynsky P.E., Goncharuk M.V., Tkach E.N., Ermolyuk Y.S. et al. (2011). Dimeric structure of the transmembrane domain of glycophorin a in lipidic and detergent environments. Acta Naturae. 3, 90–98;
22. Bocharov E.V., Mineev K.S., Goncharuk M.V., Arseniev A.S. (2012). Structural and thermodynamic insight into the process of «weak» dimerization of the ErbB4 transmembrane domain by solution NMR. Biochim. Biophys. Acta. 1818, 2158–2170;
23. Mineev K.S., Lesovoy D.M., Usmanova D.R., Goncharuk S.A., Shulepko M.A., Lyukmanova E.N. et al. (2014). NMR-based approach to measure the free energy of transmembrane helix-helix interactions. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 164–172;
24. Липидный фундамент жизни;
25. Яды — высокоточное оружие: компьютерное исследование природных нейротоксинов;
26. Болезнь Альцгеймера: ген, от которого я без ума;
27. Nadezhdin K.D., Bocharova O.V., Bocharov E.V., Arseniev A.S. (2012). Dimeric structure of transmembrane domain of amyloid precursor protein in micellar environment. FEBS Lett. 586, 1687–1692;
28. Nadezhdin K.D., Bocharova O.V., Bocharov E.V., Arseniev A.S. (2011). Structural and dynamic study of the transmembrane domain of the amyloid precursor protein. Acta Naturae. 3, 69–76;
29. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Shingarova L.N., Yakimov S.A., Dubinnyi M.A. et al. (2010). NMR structural and dynamical investigation of the isolated voltage-sensing domain of the potassium channel KvAP: implications for voltage gating. J. Am. Chem. Soc. 132, 5630–5637;
30. Berkut A.A., Peigneur S., Myshkin M.Y., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Arseniev A.S. et al. (2015). Structure of membrane-active toxin from crab spider Heriaeus melloteei suggests parallel evolution of sodium channel gating modifiers in Araneomorphae and Mygalomorphae. J. Biol. Chem. 290, 492–504;
31. Shenkarev Z.O., Finkina E.I., Nurmukhamedova E.K., Balandin S.V., Mineev K.S., Nadezhdin K.D. et al. (2010). Isolation, structure elucidation, and synergistic antibacterial activity of a novel two-component lantibiotic lichenicidin from Bacillus licheniformis VK21. Biochemistry. 49, 6462–6472;
32. Oparin P.B., Mineev K.S., Dunaevsky Y.E., Arseniev A.S., Belozersky M.A., Grishin E.V. et al. (2012). Buckwheat trypsin inhibitor with helical hairpin structure belongs to a new family of plant defence peptides. Biochem. J. 446, 69–77;
33. Osmakov D.I., Kozlov S.A., Andreev Y.A., Koshelev S.G., Sanamyan N.P., Sanamyan K.E. et al. (2013). Sea anemone peptide with uncommon β-hairpin structure inhibits acid-sensing ion channel 3 (ASIC3) and reveals analgesic activity. J. Biol. Chem. 288, 23116–23127;
34. Grishin E.V., Savchenko G.A., Vassilevski A.A., Korolkova Y.V., Boychuk Y.A., Viatchenko-Karpinski V.Y. et al. (2010). Novel peptide from spider venom inhibits P2X3 receptors and inflammatory pain. Ann. Neurol. 67, 680–683;
35. Ovchinnikova T.V., Shenkarev Z.O., Balandin S.V., Nadezhdin K.D., Paramonov A.S., Kokryakov V.N., Arseniev A.S. (2008). Molecular insight into mechanism of antimicrobial action of the beta-hairpin peptide arenicin: specific oligomerization in detergent micelles. Biopolymers. 89, 455–464;
36. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Shulepko M.A., Mineev K.S., D’Hoedt D., Kasheverov I.E. et al. (2011). NMR structure and action on nicotinic acetylcholine receptors of water-soluble domain of human LYNX1. J. Biol. Chem. 286, 10618–10627;
37. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Shulepko M.A., Paramonov A.S., Chugunov A.O., Janickova H. et al. (2015). Structural insight into specificity of interactions between nonconventional three-finger weak toxin from naja kaouthia (WTX) and muscarinic acetylcholine receptors. J. Biol. Chem. 290, 23616–23630;
38. Purtov K.V., Petushkov V.N., Baranov M.S., Mineev K.S., Rodionova N.S., Kaskova Z.M. et al. (2015). The chemical basis of fungal bioluminescence. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54, 8124–8128;
39. Dubinnyi M.A., Tsarkova A.S., Petushkov V.N., Kaskova Z.M., Rodionova N.S., Kovalchuk S.I. et al. (2015). Novel peptide chemistry in terrestrial animals: natural luciferin analogues from the bioluminescent earthworm Fridericia heliota. Chemistry. 21, 3942–3947;
40. Petushkov V.N., Dubinnyi M.A., Tsarkova A.S., Rodionova N.S., Baranov M.S., Kublitski V.S. et al. (2014). A novel type of luciferin from the Siberian luminous earthworm Fridericia heliota: structure elucidation by spectral studies and total synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53, 5566–5568;
41. Dubinnyi M.A., Kaskova Z.M., Rodionova N.S., Baranov M.S., Gorokhovatsky A.Y., Kotlobay A. et al. (2015). Novel mechanism of bioluminescence: oxidative decarboxylation of a moiety adjacent to the light emitter of Fridericia luciferin. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54, 7065–7067;
42. Malakhov M.V., Dubinnyi M.A., Vlasova N.V., Zgoda V.G., Efremov R.G., Boldyrev I.A. (2014). End-group differentiating ozonolysis of furocoumarins. RSC Adv. 4, 61277–61280. doi: 10.1039/C4RA08106D;
43. Ямпольский И. (2014). Восьмая формула света. Сайт ИБХ;
44. Биолюминесценция: возрождение;
45. Чугунов А. (2015). Девятая формула света. Сайт ИБХ..