биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


Битва века: CRISPR vs ВИЧ

[11 октября, 2016 г.]

Статья на конкурс «био/мол/текст»: На сегодняшний день СПИД все еще остается неизлечимым заболеванием. В 2014 году около полутора миллионов человек умерло из-за заражения и осложнений, связанных с ним; при этом число зараженных людей — около 37 миллионов. Как известно, организм погибает не из-за самого вируса иммунодефицита (ВИЧ), а из-за различных бактериальных, грибковых и вирусных заболеваний, с которыми организм легко справился бы в обычных условиях (оппортунистические заболевания). В настоящее время существуют различные способы облегчить протекание болезни, но полностью излечить ВИЧ-инфицированных пока еще не удавалось. Помощь пришла, откуда ее не ждали. Система редактирования геномов CRISPR/Cas9 была впервые успешно использована для полного удаления вируса из зараженной культуры клеток человека.

Обратите внимание!

Прорывная технология CRISPR/Cas9 и медленный убийца ВИЧ — сверхпопулярные объекты научных и общественных дискуссий, а уж если они пересекаются... В общем, новость об успешном избавлении лимфоцитов человека от второго объекта с помощью первого бьет рекорды популярности и на нашем конкурсе. Вскоре после публикации этой статьи появилась еще одна конкурсная работа на ту же тему: «CRISPR/Cas9 как помощник в борьбе с ВИЧ». Ну а что: повторенье — мать запоминанья, а главное — соревнование приобретает формы чистого эксперимента: тема одна, изложения — разные!

Обратите внимание!

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «био/мол/текст»-2016.


Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!


Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма «Атлас».


Спонсор публикации этой статьи — Виктор Татарский.

Врага нужно знать в лицо

Вирус иммунодефицита человека впервые был описан в 1981 году в США, куда он попал предположительно из Западной Африки. Передаваясь через кровь, в основном, при незащищенных половых актах и при многоразовом использовании шприцов в среде наркоманов, вирус быстро распространился преимущественно в странах третьего мира. Так каков же механизм действия вируса на иммунитет человека? Для понимания этого необходимо сначала разобраться с системой иммунитета человека, клетки которой поражает этот «генетический паразит».

Об иммунитете, апоптозе и вообще...

Иммунная система развивалась сотни миллионов лет. По типу реакции ее обычно делят на врожденный (неспецифичный) и приобретенный (специфичный) иммунитет [1, 2]. Считается, что специфичный (то есть вырабатываемый к конкретному патогену) иммунитет впервые появился у челюстноротых (рыб и всех вышестоящих по эволюционному древу таксонов) после отделения от бесчелюстных (миног и миксин), хотя у вторых имеется аналогичная система защиты [3]. К клеткам специфичного иммунитета относят В-лимфоциты, Т-лимфоциты и NK-клетки (естественные киллеры, natural killer cells). Помимо этого существуют моноциты, которые хоть и не являются истинными инструментами приобретенного иммунитета, однако выполняют некоторые функции по нейтрализации патогена: фагоцитоз, презентация антигена, выделение бактерицидных веществ и цитокинов.

Взаимодействия Т-киллеров и Т-хелперов

Рисунок 1. Взаимодействия Т-киллеров (слева) и Т-хелперов (справа) с зараженными клетками. Для передачи сигнала о заражении необходимо выполнение двух условий: контакт комплекса МНС-патоген с TcR (T-cell Receptor, рецептор Т-клеток) и CD. Двигаясь по организму, Т-лимфоциты проверяют каждую клетку на предмет наличия у нее антигена в комплексе с МНС. Их можно сравнить с подслеповатой глуховатой бабушкой, пришедшей забирать дитятко из детского сада. Для опознания ей надо подойти вплотную и по нескольким (в данном случае по двум) признакам определить, ее ли это чадо или нет. Рисунок с сайта medpuls.net.

Основная функция В-лимфоцитов — синтез антител (иммуноглобулинов), причем каждый отдельный лимфоцит синтезирует только один тип антител*. Что интересно, в этом процессе используются альтернативный сплайсинг, процессинг белка и некоторые другие способы увеличить разнообразие антител [4]. При проникновении нового антигена, например, бактерии или простейшего с характерными рецепторами, в организме подбираются антитела, имеющие наибольшую аффинность, то есть сродство к нему. В-лимфоцит, синтезирующий данный тип антител, пролиферирует, образуя клон В-клеток. Частично эти клетки становятся плазматическими и начинают в огромном количестве вырабатывать антитела; часть превращается в клетки памяти, как бы создавая закладку «Антиген № 36784959». В следующий раз при попадании в организм этого же антигена будут задействованы уже клетки памяти, процесс обезвреживания враждебного захватчика будет протекать быстрее и легче.

* — Как получают антитела только одной нужной специфичности (моноклональные) описано в статье «Моноклональные антитела» [5]. Японские учёные даже создали искусственные антитела из «умного пластика»: «Пластиковые антитела» [6]. А синтезированная в лаборатории молекула eCD4-Ig, которая в норме отсутствует в организме, способна защитить от вируса иммунодефицита лучше, чем собственная иммунная система человека: «Своими руками: человек против ВИЧ» [7]. — Ред.

Т-лимфоциты, в свою очередь, необходимы для уничтожения клеток, зараженных внутриклеточными паразитами, и опухолевых клеток. Они делятся на два основных типа в зависимости от класса рецепторов, находящихся на внешней стороне их мембраны.

Т-киллеры несут CD8 рецепторы и отвечают за:

  • активацию механизма апоптоза (программируемой клеточной гибели) у зараженной клетки;
  • синтез интерферона-γ, который служит сигналом близлежащим клеткам: «Осторожно, сосед был заражен!».

Т-хелперы имеют CD4 рецепторы и ответственны за секрецию цитокинов, которые:

  • активируют макрофаги для борьбы с внутриклеточными паразитами;
  • способствуют продукции антител В-лимфоцитами.

Но не менее важна роль Т-хелперов в подготовке зрелых Т-киллеров из клеток-предшественниц, активации NK-клеток и моноцитов.

Как же происходит опознавание антигена на молекулярном уровне? Здесь надо упомянуть еще об одном очень важном классе рецепторов — МНС (Major Histocompability Complex или главном комплексе гистосовместимости). Они бывают двух классов: I и II. МНС I присутствует на поверхности всех ядерных клеток организма человека. Он необходим для опознавания клетки натуральным киллером и Т-киллером (рис. 1, 2). Если по какой-то причине МНС I изменен, несет на себе антиген или отсутствует, клетка будет подвергнута апоптозу. МНС II находится на поверхности В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток. Он необходим для презентации антигена Т-хелперам (рис. 1, 2). Жизнь пула Т-хелперов можно представить как прогулку с ребенком в зоопарке, только вместо животных — антигены, вместо ребенка — Т-хелпер, а вместо взрослых, объясняющих, кто есть кто, — три перечисленных типа клеток.

Процесс передачи сигнала

Рисунок 2. Процесс передачи сигнала Т-киллеру и Т-хелперу. Первый этап — сборка комплекса МНС-антиген, второй этап — презентация комплекса на поверхности клетки. Рисунок с сайта www.premedhq.com.

В какой-то мере Т-хелперы участвуют в активации всех «активных» клеток приобретенного иммунитета: они стимулируют выработку антител В-лимфоцитами, активируют макрофаги и NK-клетки, участвуют в созревании Т-киллеров. И именно в Т-хелперах происходит размножение ВИЧ.

Первый этап проникновения вируса в клетку — взаимодействие вирусного белка gp120 (рис. 3) с рецептором CD4. Отсюда понятно, почему ВИЧ размножается именно в Т-хелперах. Взаимодействию способствуют корецепторы CCR5 и CXCR4 [8]. В норме они являются рецепторами цитокинов, а при взаимодействии ВИЧ с клеткой их связь является необходимым условием проникновения вируса внутрь. Мутации в генах этих рецепторов обеспечивают частичную устойчивость носителей таких мутаций (таких людей около 2%, причем некоторые штаммы вируса все равно могут их поражать) [9]. Затем в мембрану клетки погружается белок gp41, после чего мембрана вируса сливается с клеточной, и происходит распаковка генетического материала. По принципу обратной транскрипции с РНК-матрицы вируса с помощью фермента ревертазы (обратной транскриптазы) синтезируются молекулы кДНК (комплементарной ДНК). Синтезированная кДНК вставляется вирусной интегразой в геном клетки хозяина. После попадания в геном хозяина вирус может никак себя не проявлять до нескольких лет — протекает так называемый инкубационный период. Только когда клетки активно пролиферируют, а значит, синтезируют белки на матрице ДНК, начинается сборка вирусных частиц*, выход их из клеток и гибель последних (так как каждая частица забирает с собой часть клеточной мембраны клетки, вирусы попросту разрывают клетку).

* — Оказывается, более 250 (!) человеческих белков так или иначе участвует в жизненном цикле ВИЧ: «Подножка для вируса СПИДа» [10]. — Ред.

Строение ВИЧ

Рисунок 3. Строение ВИЧ. Белки gp120 и gp41 участвуют в рецепции вируса клеткой и проникновении вирусной частицы внутрь. Липидная оболочка захватывается от клетки хозяина вместе с частью мембранных белков. Белки матрикса синтезируются в клетке после встраивания кДНК в геном в момент наработки клеточных белков для деления. Протеаза, возможно, необходима для разрезания противоапоптотического фактора Bcl-2 [9]. Ферменты обратная транскриптаза и интеграза создают кДНК на матрице РНК и встраивают кДНК в геном Т-хелпера соответственно. Tat — белок, вовлеченный в индукцию апоптоза. Нуклеокапсид — комплекс из РНК и белков вируса, представляющий собой компактную упакованную форму генома. Капсид — белковая оболочка, защищающая содержимое от воздействия внешних условий. Рисунок из «Википедии».

Как иммунитет бактерий правит геномы

Система редактирования геномов CRISPR/Cas известна уже довольно давно (впервые локус описал в 1987 году Есизуми Исино из университета Осаки), но только недавно (в 2005 году) ученые поняли ее истинное предназначение [11, 12].

В природе система CRISPR/Cas является системой адаптивного иммунитета бактерий и предотвращает вирусную или плазмидную инвазию. Для лучшего понимания того, как можно «одомашнить» даже не бактерию, а ее иммунную систему, надо рассмотреть механизм работы этого комплекса.

Как вы уже поняли, система состоит из двух компонентов: CRISPR-локуса (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats или сгруппированные и регулярно разделенные короткие палиндромные повторы) и белков Cas, которые, являются нуклеотид-специфичными эндонуклеазами (а название получили за работу в команде с CRISPR — Crispr associated).

Интересно то, что в названии делается акцент именно на палиндромные повторы, хотя гораздо важнее то, что находится между этими повторами. А между ними находятся так называемые спейсеры (spacers) — уникальные последовательности, бывшие некогда частью генома вируса или плазмиды, этакая «коллекция уродцев».

Помимо CRISPR-локуса и блока генов Cas в ДНК бактерии (не обязательно в нуклеоиде [12]) находится ген tracrРНК (transactivated crispr RNA), частично комплементарной палиндромам.

Для формирования специфичной устойчивости к вирусу бактерия, как и человек, должна встретиться с ним дважды.

Первый раз после внедрения вирусной ДНК в клетку происходит разрезание ДНК белками Cas1 и Cas2 на протоспейсеры и встраивание их в начало CRISPR-локуса. Cas1 и Cas2 формируют при этом комплекс, причем Cas2 играет только структурную роль, удерживая ДНК, тогда как Cas1 встраивает ее. Каждый протоспейсер вставляется в CRISPR-локус так, чтобы от другого (уже имеющегося) спейсера его отделял палиндром.

Соответственно, после транскрипции ДНК всего комплекса образуются три продукта (рис. 4):

  • tracrРНК;
  • РНК белка Cas (наиболее изученным является Cas9, поэтому далее повествование пойдет о нем), далее транслирующаяся;
  • pre-crРНК (poly-spacer precursor crRNA или многоспейсерный предшественник crРНК), которая представляет собой транскрипт спейсеров, разделенных образовавшимися из палиндромов шпильками или петлями.
Строение CRISPR-локуса

Рисунок 4. Строение CRISPR-локуса и результат транскрипции. leader — лидерная последовательность, отвечающая за начало транскрипции, со стороны которой вставляется новый спейсер. repeat — палиндромный повтор, который после транскрипции превращается в шпильку или петлю. Рисунок с сайта www.biosyn.com.

На этом первая часть заканчивается — бактерия «запомнила» вирус и внесла его в уже имеющуюся библиотеку спейсеров. Пока ее можно сравнить с коллекционером, собирающим части ДНК вирусов и плазмид.

Второй этап — образование комплекса pre-crРНК/Cas9/РНКаза III. Очевидно, что вся длинная pre-crРНК не может участвовать в опознавании инвазивной ДНК, так как, во-первых, очень длинна, что конформационно неудобно, а во-вторых, при сравнении спейсеров РНК с протоспейсерами инвазивной ДНК длинный транскрипт начнет путаться и в итоге образует клубок, непригодный для дальнейшей работы. Самое логичное — разделить длинную последовательность на короткие участки, которые могли бы проверятся на соответствие инвазивной ДНК белком Cas9. И тащить за собой не надо, и не запутается.

С помощью фермента РНКазы III и при участии tracrРНК pre-crРНК разделяется по границам повторов так, что в белково-нуклеиновый комплекс входят один спейсер и один повтор, комплементарно связанный с tracrРНК (рис. 5) [13]. Повтор полностью теряет свою вторичную структуру, tracrРНК же оставляет несколько шпилек (обычно три).

Белково-нуклеиновый комплекс

Рисунок 5. Белково-нуклеиновый комплекс после созревания транскрипта. crРНК состоит из спейсера (слева) и повтора, соединенного с частью tracrРНК (справа). Три петли на tracrРНК нужны для удержания ее эндонуклеазой Cas9. Рисунок с сайта dharmacon.gelifesciences.com.

Завершающий этап — внесение двунитевого разрыва в чужеродную ДНК, вторично внедрившуюся в клетку. Здесь, как и в иммунной системе позвоночных, для «уничтожения врага» требуется выполнение двух условий:

  • комплементарность спейсера комплекса Cas9/crРНК/tracrРНК протоспейсеру инвазивной (например, вирусной) ДНК;
  • наличие в геноме вируса около протоспейсера последовательности из трех нуклеотидов — РАМ (Protospacer Adjacent Motif, прилежащий к протоспейсеру мотив).

Таким образом клетка страхуется от уничтожения своей ДНК. Но даже просто разрезанная в одном месте вирусная ДНК может представлять опасность, поэтому завершает инактивацию негомологическое сращивание концов (non-homologous end joining, NHEJ). При этом происходит инсерция/делеция одного или нескольких нуклеотидов, что приводит к потере инфекционности.

Механизм работы CRISPR/Cas9

Рисунок 6. Полная схема механизма работы CRISPR/Cas9 системы. а — Транскрипция CRISPR локуса с образованием pre-crРНК. б, в — Разрезание РНК РНКазой III и образование комплексов Cas9/tracrРНК/crРНК. г — Вторичное проникновение в клетку чужеродной ДНК. д — Соединение комплекса с инвазивной ДНК. е — Образование двухнитевого разрыва в протоспейсере. Рисунок с сайта www.addgene.org.

А где же тут редактирование геномов? А вот где:

  • во-первых, таким образом можно просто нокаутировать целевой ген и добиться прекращения экспрессии того или иного белка;
  • во-вторых, после создания двухцепочечного разрыва в образовавшуюся брешь можно вставить нужный нам ген и заставить организм синтезировать нужный нам белок.

Единственное отличие «одомашненной» CRISPR-системы состоит в том, что вместо двух молекул РНК (crРНК и tracrРНК) используется одна объединенная — sgРНК (single guide, единая направляющая, иногда называемая guideRNA)*. Гораздо проще задать одну последовательность нуклеотидов, содержащую спейсер, чем две, которые должны быть транскрибированы и комплементарно сшиты.

* — Об удивительном процессе мутагенной цепной реакции, осуществляемом комплексом Cas9 с РНК-гидом, подробно рассказано в статье «Мутагенная цепная реакция: редактирование геномов на грани фантастики» [14]. — Ред.

Систем CRISPR/Cas9

Рисунок 7. Сравнение искусственной (а) и естественной (б) систем CRISPR/Cas9. Отличие состоит лишь в том, что искусственная РНК едина, а природная — состоит из двух частей, гены которых разделены. Рисунок с сайта dharmacon.gelifesciences.com.

Битва века

Однако вернемся к теме этой статьи.

Так как система редактирования геномов может помочь в избавлении от ВИЧ? Очень просто: вирус можно вырезать! Нацелив Cas9, путем создания sgРНК с последовательностью, комплементарной вирусной кДНК.

Некоторое время назад группа ученых из немецкого Института экспериментальной вирусологии и иммунологии уже пыталась использовать инструмент редактирования геномов для удаления ВИЧ из культуры HeLa [15]. Они модифицировали Cre-рекомбиназу методом направленной эволюции и один из полученных вариантов использовали для удаления вируса путем контролируемой рекомбинации [16]. Однако надо учитывать, что между Т-хелперами и опухолевой HeLa есть немало различий, к тому же, авторы не предлагают вариантов доставки или экспрессии гена Tre-рекомбиназы (усовершенствованный вариант фермента Cre).

С другой стороны, группа американских исследователей опубликовала в марте этого года статью [17], где подробно описывались метод доставки и механизм удаления вируса. Ученые ставили перед собой задачу не только полностью избавить клеточную культуру Т-хелперов от вируса, но и проверить отсутствие цитотоксического действия самой CRISPR/Cas9 системы. Единственный недостаток этого геномного инструмента в том, что из-за сравнительно небольшой длины спейсера, даже при наличии страхующего элемента PAM, в больших геномах могут быть найдены нецелевые сайты, подверженные разрезанию (off-target sites). Именно поэтому исследователи уделяли данной проблеме немало внимания.

Работа проводилась с использованием штамма ВИЧ-1 и клеточной линии Т-хелперов 2D10, зараженной вирусом в покоящейся стадии. Доставка и экспрессия sgРНК/Cas9 осуществлялась с помощью лентивирусного вектора.

Известно, что для встраивания кДНК ВИЧ в хромосомы необходимы длинные концевые повторы (Long Terminal Repeat, LTR) — краевые последовательности нуклеотидов, повторенные сотни или тысячи раз. Такие повторы присутствуют у обеих молекул РНК ВИЧ, и если «нацелить» Cas9 на них, то удастся создать разрыв и вырезать вирус. Но группа под руководством Рафаля Камински создала не просто sgРНК к LTR. Ученые учли быструю скорость мутационного процесса вирусов и поместили в sgРНК наиболее консервативную область LTR, присутствующую у всех изолятов вируса.

Для оценки того, вырезался ли вирус из двух мест встраивания (1-я и 16-я хромосомы), было проведено полногеномное секвенирование. Оно показало, что в клетках, где экспрессировались и гены Cas9, и sgРНК, провирусная ДНК отсутствует.

Был проведен анализ того, могут ли гены, куда встроился провирус (RSBN1 и MSRB1), и близлежащие гены нормально транскрибироваться после его вырезания. Ученые показали, что как RSBN1, так и MSRB1 нормально экспрессируются. Соседние гены также не претерпели изменений.

С помощью биоинформатических методов и анализа баз данных было показано, что sgРНК/Cas9 не проявляет активности по отношению к нецелевым сайтам.

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что группа Камински впервые успешно удалила ВИЧ из культуры зараженных Т-хелперов. Данное достижение приблизило человечество к победе на ВИЧ. Да, это только культура клеток. Да, до внедрения данной техники в медицину пройдут годы, а может и десятки лет, но данная работа является уникальной в своем роде, ибо ученые не только бросили вызов одному из страшнейших заболеваний на планете, но и смогли победить его — пусть даже масштаб сражения пока невелик.

Перспективы применения данной технологии очевидны: введя пациенту вектор, содержащий гены Cas9 и sgРНК, мы добьемся их экспрессии и полного удаления вируса из клеток. Современная терапия, направленная против ретровирусов, являющаяся основным средством борьбы с ВИЧ, не удаляет вирус из клеток, так как провирус остается встроенным в ДНК хозяина. В свою очередь, данный подход не оставляет вирусу шансов укрыться.

Литература

  1. биомолекула: «Иммунологическая Нобелевская премия (2011)»;
  2. биомолекула: «Толл-подобные рецепторы: от революционной идеи Чарльза Джейнуэя до Нобелевской премии 2011 года»;
  3. Элементы: «Сложная иммунная система развилась независимо в двух эволюционных линиях позвоночных животных»;
  4. Элементы: «Мутагенез в лимфоцитах — результат целенаправленного изменения ДНК и последующей «неточной починки»;
  5. биомолекула: «Моноклональные антитела»;
  6. биомолекула: «Пластиковые антитела»;
  7. биомолекула: «Своими руками: человек против ВИЧ»;
  8. биомолекула: «Структуры рецепторов GPCR „в копилку“»;
  9. биомолекула: «СПИД: как ВИЧ разрушает нашу иммунную систему»;
  10. биомолекула: «Подножка для вируса СПИДа»;
  11. Barrangou R. and Horvath P. (2009). The CRISPR system protects microbes against phages, plasmids. Microbe4, 224–230;
  12. биомолекула: «CRISPR-системы: иммунизация прокариот»;
  13. Немудрый А.А., Валетдинова К.Р., Медведев С.П., Закиян С.М. (2014). Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas — инструменты открытий. Acta Naturae6, 20–42;
  14. биомолекула: «Мутагенная цепная реакция: редактирование геномов на грани фантастики»;
  15. биомолекула: «Как „вырезать“ вирус?»;
  16. Sarkar I., Hauber I., Hauber J., Buchholz F. (2007). HIV-1 proviral DNA excision using an evolved recombinase. Science316, 1912–1915;
  17. Kaminski R., Chen Y., Fischer T., Tedaldi E., Napoli A., Zhang Y. et al. (2016). Elimination of HIV-1 genomes from human T-lymphoid cells by CRISPR/Cas9 gene editing. Sci. Rep. 6, 22555.

Автор: Борзов Никита.

Число просмотров: 1312.

Вернуться в раздел «Новости»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Re: Битва века: CRISPR VS ВИЧ

Кацубо Елена — 14 октября, 2016 г. 16:25. (ссылка) (свернуть ветвь)

Добрый день!
Стоит отметить, что в контексте излечения ВИЧ-инфекции эта терапевтическая методика уже дает сбои. Так, в апреле этого года, в журнале Nature была опубликована новость о том, что ВИЧ научился избегать атак системы CRISPRCas9. Мутируя, вирус не только остаётся в клетках человека, но и приобретает устойчивость. А устойчивые к CRISPRCas9 вирусные частицы затем разносятся по всему организму. Ссылку на новость прикрепляю ниже.
http://www.nature.com/news/hiv-overcomes-crispr-gene-editing-attack-1.19712

(ответить)

Re: Re: Битва века: CRISPR VS ВИЧ

Никита Борзов — 23 октября, 2016 г. 17:56. (ссылка)

Здравствуйте!
Да, в самом деле так, ВИЧ очень быстро мутирует. Однако, если использовать сразу несколько приёмов, например CRISPR и ART, вероятность выживания вируса существенно снизится. К тому же, на подходе новая система редактирования геномов, описанная у мимивирусов:
http://www.nature.com/news/crispr-like-immune-system-discovered-in-giant-virus-1.19462

(ответить)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.