биомолекула.ру. Взгляд изнутри.
 

Логин:
Пароль:


Флуоресцентные белки: разнообразнее, чем вы думали!

[18 мая, 2014 г.]

При упоминании флуоресцентных белков люди чаще всего представляют себе разноцветные клетки, забавные рисунки бактериями на чашках Петри, в крайнем случае, целые флуоресцирующие организмы — от медуз до кошек, — эдакая цветная палитра. Однако область применения этого замечательного инструмента расширяется с каждым годом, — как и разнообразие самих белков. В этой статье мы поговорим о новых поколениях флуоресцентных белков и рассмотрим некоторые интересные методы на их основе.

— Ой, я и не знала, что коты такие умные бывают. Я думала, они только на деревьях кричать умеют.
— Подумаешь, я еще и вышивать могу... и на машинке тоже...

(«Трое из Простоквашино»)

Светящиеся белки из забавного явления довольно быстро превратились в ценный объект для науки, когда были созданы флуоресцентные микроскопы. (Флуоресцентная микроскопия — это метод получения увеличенного изображения с использованием люминесценции возбуждённых атомов и молекул образца. Подробнее о разных видах микроскопий можно прочитать в статьях «“Нарисуем” живую клетку» и «Лучше один раз увидеть, или микроскопия сверхвысокого разрешения».)

Оказалось, что родоначальник большинства используемых белков — зеленый флуоресцентный белок (GFP) из медузы Aequorea victoria (подробнее о его замечательной судьбе — в статье «Флуоресцирующая Нобелевская премия по химии»), — равно как и его гомологи из различных морских животных, являются прекрасными маркерами для визуализации живых клеток и организмов.

Флуоресцентное «творчество»

Рисунок 1. Флуоресцентное «творчество». А. «Рисунок» бактериями, экспрессирующими гены различных флуоресцентных белков, на чашке петри. Б. Мыши, несущие ген зеленого флуоресцентного белка, и обычные мыши.

Главной особенностью флуоресцентных белков является способность формировать флуорофорную группу автокаталитически, без привлечения внешних кофакторов и ферментов — другими словами, они могут светиться внутри клетки сами по себе. Независимое созревание, в сочетании с низкой токсичностью и высокой стабильностью, позволяет использовать флуоресцентные белки в самых разных организмах, в которых исходно они не синтезировались (рис. 1).

Сейчас ученые используют GFP и его варианты и гомологи во многих методах для изучения организации и функционирования живых систем. Флуоресцентные белки, слитые в одной рамке считывания с интересующими белками, позволяют наблюдать за их локализацией, передвижением, оборотом и даже «старением» (т.е. временем, прошедшим после белкового синтеза). Нуклеиновые кислоты тоже могут быть помечены — с помощью РНК- или ДНК-связывающих белковых доменов.

Многие лаборатории сосредотачивают свои усилия на идентификации и создании флуоресцентных белков с новыми характеристиками и улучшенными свойствами: разнообразие существующих в настоящее время белков покрывает практически весь видимый спектр. В этой статье мы поговорим о новых поколениях флуоресцентных белков и рассмотрим некоторые интересные способы их применения, выходящие за рамки методики слияния GFP-подобного белка с интересующим объектом, — и последующего наблюдения за локализацией этого объекта с помощью микроскопа (рис. 2).

«Светящий теплом»

Визуализация различных компонент живых клеток

Рисунок 2. Визуализация различных компонент живых клеток с помощью флуоресцентных белков.

В настоящее время существует целая «палитра» белков, родственных знаменитому GFP, — от синих до дальнекрасных. Однако, флуоресцентные белки, принадлежащие другим крупным семействам, тоже довольно широко распространены.

iRFP — белок, флуоресцирующий не в видимой области спектра, а в инфракрасной (фактически, «отвечающий на свет теплом»), — был получен в 2011 году [1]. Его максимум поглощения находится в дальнекрасной области спектра (690 нм), а пик флуоресценции — в инфракрасной (713 нм). iRFP был получен на основе фитохрома из бактерии Rhodopseudomonas palustris (фитохромы — это фоточувствительные рецепторы с довольно консервативным белковым ядром, к которому нековалентно присоединяется тетрапиррольный хромофор). Из двух доменов фитохрома, скорректированных вдобавок точечными мутациями, и был создан iRFP.

Преимущество бактериофитохромов заключается в том, что их кофактор (например, биливердин) участвует в нормальном метаболизме гема млекопитающих. Визуализация различных процессов в этих организмах in vivo важна для таких задач как количественная и неинвазивная оценка роста и метастазирования опухоли, изучение экспрессии генов, отслеживание бактериальной инфекции и т.д. Вкратце, — можно наблюдать за этими процессами, поместив флуоресцентный белок под определенный промотор, который активируется только в конкретных условиях, или в опухолевые клетки; тогда регистрация сигнала от белка будет означать, что промотор активен, или что клетки трансформировались, или что определенный молекулярный путь запустился.

Визуализация глубоких тканей с помощью GFP-подобных белков, к сожалению, сильно затруднена из-за сильного поглощения света гемоглобином и меланином кожи. Оптимальный флуоресцентный белок для имиджинга in vivo должен обладать максимумами поглощения и флуоресценции в дальнекрасной-инфракрасной области, в которой поглощение света тканью минимально; таким образом, iRFP удовлетворяет данным условиям.

Помимо спектра, полностью подходящего для данных задач, iRFP отличается высокой внутриклеточной стабильностью и низкой цитотоксичностью. В совокупности с отсутствием необходимости добавления извне биливердинового хромофора, iRFP является отличным кандидатом для работы с млекопитающими in vivo, что уже было показано учеными нескольких стран. Группа Верхуши локализовала его в мышиной печени; Лю и др. изучали с помощью iRFP рак простаты (тоже на мышах) [2], а Хок и др. количественно оценивали рост опухоли in vivo [3]. Скорее всего, в ближайшее время будут разработаны и другие методики изучения различных клеточных процессов, использующие iRFP в своей основе.

Когда цвет один, но это не проблема

Несмотря на богатство палитры флуоресцентных белков, бывает так, что ее не хватает, — например, когда ученым необходимо отслеживать множество одновременно происходящих процессов (как в методике Brainbow), или когда те или иные каналы по каким-либо причинам использовать нельзя.

Для этого случая существует особая методика, которая позволяет различать объекты, помеченные разными белками одного цвета. Дело в том, что даже если максимумы флуоресценции двух белков близки и попадают в одну и ту же полосу пропускания фильтра на микроскопе, можно выбрать другое свойство, по которому они существенно различаются. Одно из таких часто используемых свойств — время жизни флуоресценции. Время жизни — это средний период времени, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии. Грубо говоря, после поглощения фотона один белок переизлучит другой фотон в среднем через меньшее время, а другой — через большее.

С помощью FLIM (Fluorescence lifetime imaging microscopy — микроскопии времени жизни флуоресценции) можно проследить за каждым фотоном, который будет выпущен образцом, и построить кривую зависимости количества испускаемых фотонов от времени. Поскольку время жизни флуоресценции флуорофора (τ) зависит от его непосредственного молекулярного окружения, технологию FLIM используют в клеточной биологии для измерения физиологических параметров в клетке, например, клеточного pH, концентраций ионов и мембранного потенциала [45].

В настоящий момент главное применение FLIM заключается в измерении белок-белковых взаимодействий с помощью Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET; см. «Рулетка для спектроскописта») между двумя флуоресцентно-меченными белками (поскольку присутствие акцептора влияет на время жизни флуоресценции донора) [6].

Кроме исследования изменений времени жизни одной конкретной метки, FLIM также начали использовать для количественного отображения пространственного и фракционного распределения двух невзаимодействующих флуоресцентных меток с разными временами жизни. В идеальном случае затухание флуоресценции моноэкспоненциально; в такой ситуации возможно различить два или три белка с известными временами жизни флуоресценции, математически проанализировав полученную кривую и разделив ее на пики, соответствующие каждому из образцов. После этого с помощью компьютерных программ каждый из белков можно покрасить в свой псевдоцвет, для облегчения визуального восприятия (рис. 3).

Белки SCFP1 и SCFP3A в клетках HeLa

Рисунок 3. Белки SCFP1 и SCFP3A, отличающиеся временем жизни флуоресценции, в клетках HeLa. A. Флуоресцентная микрофотография клеток, экспрессирующих SCFP1-NLS и SCFP3A-NES — или только SCFP1-NLS. Стрелки указывают на клетки, которые нельзя различить по распределению флуоресценции. B. Карта времени жизни флуоресценции. С. Карта фракционного вклада SCFP1 во флуоресценцию в стационарном состоянии. D и E. Микроснимки фракционного молярного распределения SCFP1-NLS и SCFP3A-NES, соответственно. F. Наложение D и E, где SCFP1-NLS окрашен фиолетовым, а SCFP3A-NES — зеленым [6].

Флуоресцентные таймеры

Белки начинают флуоресцировать после укладки белковой цепи и созревания хромофора, которое включает несколько последовательных ковалентных модификаций, занимающих довольно много времени, особенно у оранжевых и красных белков (рис. 4) [7]. Обычно именно стадия созревания хромофора является лимитирующей для того, чтобы белок начал флуоресцировать. В зависимости от вида флуоресцентного белка, концентрации кислорода и температуры фолдинг может длиться от нескольких минут до целых дней, как в случае флуоресцентных таймеров.

Пути созревания хромофоров GFP-подобных белков

Рисунок 4. Химические структуры и пути созревания хромофоров GFP-подобных белков, встречающихся в природе Рисунок из [7].

Эмиссия флуоресцентного таймера DsRed-E5NA

Рисунок 5. Визуализация цветов эмиссии флуоресцентного таймера DsRed-E5NA после индукции в системе Tet-On в человеческих клетках HEK293. В качестве контрольного белка использовали DAPI, а наблюдали за изменением соотноше-ния зеленого к красному сигналов (каналы FITC и Cy3 соответственно) [9].

Для практического использования скорость созревания до яркого и стабильного флуоресцентного сигнала должна быть достаточно большой. У большей части флуоресцентных белков время полусозревания длится от ~40 минут до 1–2 часов, что достаточно для мечения клеток, органелл и интересующих белков — и для различных количественных экспериментов. Впрочем, для некоторых особых применений (например, для ранней регистрации активации промоторов, мечения интересующих белков с коротким временем жизни или наблюдения за единичными актами трансляции) необходимы флуоресцентные белки с очень высокой скоростью фолдинга. Например, быстро созревающие желтые флуоресцентные белки позволяют напрямую наблюдать за продукцией единичной молекулы белка в реальном времени [8].

Целый ряд возможностей, которые и по сей день изучены в недостаточной степени, обеспечивается так называемыми флуоресцентными таймерами — белками, которые меняют цвет флуоресценции в течение жизни, таким образом позволяя определить время их экспрессии в ретроспективе. Что важно, различные флуоресцентные таймеры характеризуются разнообразными скоростями фолдинга — от минут до часов и даже дней — и таким образом, подходят для изучения процессов по различным временным шкалам.

Первый флуоресцентный таймер DsRed-E5 был опубликован в 2000 году [9]. В течение нескольких часов после синтеза DsRed-E5 обладает флуоресценцией в зеленой области спектра, но потом превращается в красную форму (рис. 5). Эти изменения происходят благодаря тому, что некоторые хромофоры в тетрамере созревают в зеленую GFP-подобную форму вместо красной, и их зеленая флуоресценция доминирует, пока более медленно созревающие красные хромофоры не появятся и не «украдут» возбуждающую энергию от зеленых с помощью крайне эффективного внутритетрамерного Фёрстеровского переноса энергии (FRET) [10].

Таким образом, ткани, клетки или органеллы, которые окрашены зеленым, означают недавнюю продукцию DsRed-E5, в то время как красная флуоресценция отмечает области, в которых белок был синтезирован по крайней мере несколько часов назад. Отношение интенсивности красной флуоресценции к зеленой пропорционально возрасту синтезированного белка и таким образом может отмечать время, прошедшее с момента активации соответствующего промотора. На практике, это обеспечивает способ наблюдения за динамикой экспрессии генов в различных тканях [11]; позволяет отделить клетки, в которых промотор недавно активировался, от клеток с постоянной активностью данного промотора [12]; кроме того, с помощью такого таймера можно анализировать распределение органелл в зависимости от возраста [13] и отслеживать перемещение белков [14].

Светом можно не только возбуждать, но и переключать!

Фотоактивируемые флуоресцентные белки (ФАФБ) представляют собой отдельный класс белков, чьи флуоресцентные свойства могут быть «включены» с помощью импульса света определенной длины волны. Возбуждаясь из несветящегося состояния или меняя цвет, ФАФБ могут служить селективными фотометками белков, органелл, клеток и тканей. В ходе эксперимента можно активировать конкретную фракцию ФАФБ, также как и выбрать когда — и определить интересующий регион. Активированные ФАФБ можно визуализировать в отдельном спектральном канале, при этом неактивированные молекулы остаются «невидимыми». Это свойство обеспечивает уникальную возможность для точного мечения и отслеживания интересующих объектов в живых системах, увеличивая соотношение сигнал/шум и для флуоресцентной микроскопии высокого разрешения.

Плотное окружение хромофора у GFP-подобных белков может стабилизировать его в различных конформациях и значительно влиять на его спектральные характеристики, определяя его состояние протонирования, коэффициент экстинкции и квантовый выход флуоресценции, также как и точное положение пиков возбуждения/эмиссии. Таким образом, цис-транс переходы хромофора, в сочетании с конформационными перестройками близлежащих аминокислот, могут привести к обратимым светоиндуцируемым фотоконверсиям, которые значительно меняют спектральные свойства данного белка.

Необратимые изменения спектральных характеристик становятся возможными, если энергия поглощенного протона приводит к химической реакции внутри конкретного флуоресцентного белка, — например, к расщеплению пептидной связи в хромофоре [15] или декарбоксилированию 222 глутаминовой кислоты, которая играет ключевую роль в сети водородных связей вокруг хромофора [16]. Кроме того, недавно были описаны необратимые фотоконверсии, которые случаются при определенных условиях у тех белков, которые ранее считались не фотоактивируемыми. В частности, описано окислительное покраснение практически для всех зеленых флуоресцентных белков [17]. При интенсивном или двухфотонном возбуждении происходит красная → зеленая или оранжевая → дальнекрасная фотоконверсия у белков DsRed, mKate, mKO и mOrange, механизм которой пока не изучен. Некоторым из этих конверсий в будущем может найтись практическое применение.

«Опасные» флуоресцентные белки.

В настоящее время активно развивается область флуоресцентных белков, которые под действием света испускают активные формы кислорода (АФК; о некоторых их интересных аспектах можно почитать в статье «Активный кислород: друг или враг, или о пользе и вреде антиоксидантов»). АФК могут быть использованы для локальной инактивации целевых белков, избирательного снижения жизнеспособности клеток и для изучения внутриклеточной сигнализации активными формами кислорода. В данной статье я расскажу о двух таких белках: miniSOG и KillerRed.

MiniSOG

MiniSOG (mini Singlet Oxygen Generator) — фототоксичный зеленый флуоресцентный флавопротеин, примерно вдвое меньший по размеру, чем GFP (всего лишь 106 аминокислот), — был получен в результате точечных замен в LOV2-домене белка фототропина-2 из Arabidopsis [18]. Модифицированный LOV-домен, как и исходный (рецептор синего света), связывает флавинмононуклеотид, который, будучи возбужден синим светом, передает энергию триплетному кислороду, который превращается в более «опасный» синглетный кислород.

Максимальное поглощение происходит при длине волны 448 нм с плечом у 473 нм, т.е. в синем свете. Возбуждение miniSOG приводит к эмиссии зеленого света: два пика длиной волны 500 и 528 нм (рис. 6). MiniSOG в растворе ведет себя как мономерный белок, и в составе химерных белков не нарушает их локализации (рис. 7).

Спектры miniSOG

Рисунок 6. Спектры miniSOG. Спектр поглощения (синий) и эмиссии (красный) белка miniSOG [18].

Фотографии miniSOG

Рисунок 7. Полученные с помощью конфокальной микроскопии фотографии miniSOG в различных субклеточных локализациях: а) в эндоплазматическом ретикулуме; b) слитым с Rab5A; c) слитым с зиксином; d) слитым с тубулином; e) слитым с β-актином; f) слитым с α-актином; g) в митохондрии; h) слитым с гистоном H2B [18].

Токсический эффект miniSOG

Рисунок 8. Токсический эффект miniSOG в зависимости от его локализации: ACO-1 — цитоплазматическая аконитаза; hCOX8a — субъединица 8а человеческой цитохром С оксидазы; ACO-2 — митохондриальная аконитаза; TOMM-20 — главный рецептор импорта полипептидов в митохондрию [19].

В темноте miniSOG не оказывает негативного влияния на клетки, однако на свету может вызывать токсический эффект вплоть до ее гибели, в зависимости от локализации (рис. 8) [19].

Однако, как показано выше, miniSOG при освещении отнюдь не всегда приводит к клеточной гибели; это указывает на возможность использования miniSOG не в качестве «орудия убийства», а как обычный источник синглетного кислорода. Подробнее о токсических свойствах miniSOG можно почитать в статье «Флуоресцентный белок miniSOG убивает клетки светом».

KillerRed

KillerRed — фототоксичный димерный красный флуоресцентный мутант хромобелка anm2CP из гидроидной медузы (максимумы возбуждения и эмиссии — 585 и 610 нм, соответственно). Роль хромофора в определении фототоксических свойств была установлена с помощью теста на бактериях: он показал, что зеленый свет убивает клетки гораздо эффективнее синего. Эти результаты соответствуют спектру поглощения/возбуждения [20] (рис. 9).

GFP и его гомологи является универсальными метками, которые могут быть слиты с целевыми белками, в том числе и ядерными, без влияния на жизнеспособность клетки. Благодаря чему наблюдается повышение фототоксических свойств KillerRed по сравнению с другими GFP-подобными белками? На данный момент нет точных объяснений этому феномену, но есть предположения, связанные со структурой белка KillerRed. Недавно полученное изображение высокого разрешения выявляет уникальный канал, соединяющий DsRed-подобный хромофор с внешней средой, в который помещается восемь молекул воды (рис. 10) [21].

Исходя из данных анализа структуры, можно выдвинуть гипотезу о реакции кислорода с возбужденным хромофором, которая привела бы к образованию супероксид-анион-радикала (O2•−) [22]. Образование O2•− может быть объяснено реакцией переноса электрона от хромофора к кислороду, оставляющей хромофор в состоянии радикала. Эта гипотеза подтверждается недавним открытием того факта, что флуоресцентные белки являются светоиндуцируемыми донорами электронов [17]. АФК, генерируемые KillerRed, могут затем реагировать со слитым с ним белком [23].

Эффективный фотосенсибилизатор должен защищать себя от АФК-опосредованного повреждения. Удивительная особенность KillerRed заключается в большом количестве серусодержащих остатков (6 цистеинов и 10 метионинов). Возможно, именно они играют роль в защите от фотоиндуцированного окисления.

Как уже было сказано ранее, KillerRed — димеризующийся белок; поэтому, будучи слитым с другими белками, он может приводить к потере их функциональности. Так, например, экспрессия химерного гена H2A—KillerRed даже без облучения приводит к утрате способности клеток делиться [24]. Для того чтобы избежать этой ситуации, используется тандемная версия KillerRed, содержащая две копии белка, соединенных гибким линкером. Для других димерных белков было показано, что в таком случае они формируют внутримолекулярные димеры и тем самым ведут себя как псевдомономерные метки [25], что подтвердилось и в данном случае [22].

Как и для других фотосенсибилизаторов, уровень фототоксичности и эффект белка KillerRed зависит от внутриклеточной локализации. KillerRed, слитый с сигналом направления в митохондрию, запускает апоптоз; будучи слитым с сигналом меристилирования, на плазматической мембране приводит, в основном, к некрозу [20]. Будучи слит с гистоном H2B, KillerRed при облучении вызывает активацию системы репарации клетки [22].

Спектры KillerRed

Рисунок 9. Спектры возбуждения (черная линия) и флуоресценции (красная линия) KillerRed. Синий и зеленый прямоугольники показывают относительный фототоксический эффект при облучении синим (460–490 нм) и зеленым (540–580 нм) светом мощностью 35 мВт/см2, соответственно. Данные над прямоугольниками показывают количество раз, в которое уменьшилось число живых клеток E. coli после 30-минутного облучения [20].

Пространственная структура мономера KillerRed

Рисунок 10. Пространственная структура мономера KillerRed. Пептидный остов отмечен серым цветом, хромофор (Gln65—Tyr66—Gly67) — красным. Углубление, формирующее канал, показано в виде оранжевой сетки, охватывающей молекулы воды (синие сферы) [21].

Совсем недавно, в 2013 году, с помощью нескольких точечных мутаций был получен мономерный вариант KillerRed (под названием SuperNova) [26]. Его цитоплазматическая экспрессия, как и экспрессия KillerRed, не мешает делению клеток, а уровень фототоксичности при этом довольно высок, что позволяет, в частности, функциональный анализ целевых белков с помощью технологии CALI (chromophore-assisted light-inactivation) без недостатка в виде димеризации, присущей исходному варианту KillerRed.

* * *

Безусловно, в своей статье я рассмотрела лишь небольшую часть возможностей применения флуоресцентных белков. В настоящее время это одна из наиболее динамично развивающихся областей молекулярной биологии как фундаментальной науки, с одной стороны, а с другой — как прикладной методологии. Флуоресцентные белки продолжают активно исследовать, благодаря чему они становятся все более технологичными инструментами как для самих исследований, так и для практического применения в биотехнологиях и медицине. Поиск и создание новых интересных форм и разнообразных методов, основанных на использовании флуоресцентных белков, наверняка приведут к неожиданным интригующим открытиям.

Литература


  1. Filonov G.S., Piatkevich K.D., Ting L.M., Zhang J., Kim K., Verkhusha V.V. (2011). Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757–761;
  2. Lu Y., Darne C.D., Tan I.C., Wu G., Wilganowski N., Robinson H., Azhdarinia A., Zhu B., Rasmussen J.C., Sevick-Muraca E.M. (2013). In vivo imaging of orthotopic prostate cancer with far-red gene reporter fluorescence tomography and in vivo and ex vivo validation. J. Biomed. Opt. 18, 101305;
  3. Hock A.K., Lee P., Maddocks O.D., Mason S.M., Blyth K., Vousden K.H. (2014) iRFP is a sensitive marker for cell number and tumor growth in high-throughput systems. Cell Cycle 13, 220–226;
  4. Lin H.J., Herman P., Lakowicz J.R. (2003). Fluorescence lifetime-resolved pH imaging of living cells. Cytometry A. 52, 77–89;
  5. Gadella T.W. Jr., Jovin T.M., Clegg R.M. (1993). Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM): spatial resolution of microstructures on the nanosecond time scale. Biophys. Chem. 48, 221–239;
  6. Kremers G.J., van Munster E.B., Goedhart J., Gadella T.W. Jr. (1993). Quantitative lifetime unmixing of multiexponentially decaying fluorophores using single-frequency fluorescence lifetime imaging microscopy. Biophys. J. 95, 378–389;
  7. Chudakov D.M., Matz M.V., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2010). Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol. Rev. 90, 1103–1163;
  8. Yu J., Xiao J., Ren X., Lao K., Xie X.S. (2006). Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time. Science 311, 1600–1603;
  9. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A.V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., Siebert P. (2000). «Fluorescent timer»: protein that changes color with time. Science 290, 1585–1588;
  10. Verkhusha V.V., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2004). Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. Chem. Biol. 11, 845–854;
  11. Mirabella R., Franken C., van der Krogt G.N., Bisseling T., Geurts R. (2004). Use of the fluorescent timer DsRED-E5 as reporter to monitor dynamics of gene activity in plants. Plant Physiol. 135, 1879–1887;
  12. Miyatsuka T., Li Z., German M.S. (2009). The chronology of islet differentiation revealed by temporal cell labeling. Diabetes 58, 1863–1868;
  13. Solimena M., Gerdes H.H. (2003). Secretory granules: and the last shall be first. Trends Cell. Biol. 13, 399–402;
  14. Lidsky P.V., Hato S., Bardina M.V., Aminev A.G., Palmenberg A.C., Sheval E.V., Polyakov V.Y., van Kuppeveld F.J., Agol V.I. (2006). Nucleocytoplasmic traffic disorder induced by cardioviruses. J. Virol. 80, 2705–2717;
  15. Ando R., Hama H., Yamamoto-Hino M., Mizuno H., Miyawaki A. (2002). An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651–12656;
  16. Henderson J.N., Gepshtein R., Heenan J.R., Kallio K., Huppert D., Remington S.J. (2009). Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. J. Am. Chem. Soc. 131, 4176–4177;
  17. Bogdanov A.M., Mishin A.S., Yampolsky I.V., Belousov V.V., Chudakov D.M., Subach F.V., Verkhusha V.V., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2009). Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nat. Chem. Biol. 5, 459–461;
  18. Shu X., Lev-Ram V., Deerinck T.J., Qi Y., Ramko E.B., Davidson M.W., Jin Y., Ellisman M.H., Tsien R.Y. (2011). A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9, e1001041;
  19. Qi Y.B., Garren E.J., Shu X., Tsien R.Y., Jin Y. (2012). Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7499–6504;
  20. Bulina M.E., Chudakov D.M., Britanova O.V., Yanushevich Y.G., Staroverov D.B., Chepurnykh T.V., Merzlyak E.M., Shkrob M.A., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2006). A genetically encoded photosensitizer. Nat. Biotechnol. 24, 95–99;
  21. Carpentier P., Sebastien V., Laurent B., Bourgeois D. (2009). Structural basis for the phototoxicity of the fluorescent protein KillerRed. FEBS Letters 583, 2839–2842;
  22. Serebrovskaya E.O., Gorodnicheva T.V., Ermakova G.V., Solovieva E.A., Sharonov G.V., Zagaynova E.V., Chudakov D.M., Lukyanov S., Zaraisky A.G., Lukyanov K.A. (2011). Light-induced blockage of cell division with a chromatin-targeted phototoxic fluorescent protein. Biochem. J. 435, 65–71;
  23. Bulina M.E., Lukyanov K.A., Britanova O.V., Onichtchouk D., Lukyanov S., Chudakov D.M. (2006). Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat. Protoc. 1, 947–953;
  24. Waldeck W., Mueller G., Wiessler M., Brom M., Tóth K., Braun K. (2009). Autofluorescent proteins as photosensitizer in eukaryotes. Int. J. Med. Sci. 6, 365–373;
  25. Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N., Palmer A.E., Tsien R.Y. (2004). Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567–1572;
  26. Takemoto K., Matsuda T., Sakai N., Fu D., Noda M., Uchiyama S., Kotera I., Arai Y., Horiuchi M., Fukui K., Ayabe T., Inagaki F., Suzuki H., Nagai T. (2013). SuperNova, a monomeric photosensitizing fluorescent protein for chromophore-assisted light inactivation. Sci. Rep. 3, 2629.

Автор: Злобовская Ольга.

Число просмотров: 2817.

Creative Commons License — условия использования и распространения материалов сайта.
Вернуться в раздел «Технология»

Комментарии

(Оставить комментарий) (показывать сначала старые комментарии)

Re: Флуоресцентные белки: разнообразнее, чем вы думали!

Юлия — 21 мая, 2014 г. 23:06. (ссылка) (свернуть ветвь)

Спасибо автору, отличная статья :)

(ответить)

Re: Re: Флуоресцентные белки: разнообразнее, чем вы думали!

Джек — 1 сентября, 2015 г. 15:16. (ссылка) (свернуть ветвь)

А ничего, что мы их едим? GFP -гены внедряются во многие ГМО-культуры. Белки генерируют синглетный кислород, который вызывает апоптоз клеток. Вообще в ГМО напихали одних токсинов и говорят : ешьте на здоровье, а мы будем наблюдать, как вы загинаетесь и "лечить" за бешенные деньги.

(ответить)

Re: Re: Re: Флуоресцентные белки: разнообразнее, чем вы думали!

Злобовская Ольга — 1 сентября, 2015 г. 15:56. (ссылка)

:D Интересно, это вы на полном серьезе - или троллите?
Если же первое, то:
Во-первых, гены гомологов GFP не внедряют в пищевые продукты. Зачем? Это в основном научный инструмент (редко - развлекательный, как в случае с аквариумными рыбками).
Во-вторых, синглетный кислород на настоящий момент при облучении генерирует только белок, не гомологичный GFP - miniSOG. Ну и что, что он это делает? Для генерирования этим белком синглетного кислорода в количестве, достаточном для убийства клетки, необходимо жесткое облучение - в идеале, диодом с узким спектром излучения в синем диапазоне. А до этого белок еще надо засунуть к вам в клетки, что возможно только если вы сделаете себе вирус с ним. Не думаю, что вы это захотите (и сможете, судя по вашему комментарию).
В-четвертых, даже если вы съедите сам белок (что не получится, ибо никто вам не даст такой дорогущий в получении продукт испортить), никаких проблем у вас не будет. Переварится, как обычные белки.
В-пятых, нет ни одного исследования, которое бы достоверно показывало, что ГМО вредны для здоровья. Рекомендую для просвещения почитать журнал одного хорошего ученого и борца с мифами: http://scinquisitor.livejournal.com/

(ответить)

Яндекс.Метрика

© 2007–2015 «биомолекула.ру»
Электропочта: info@biomolecula.ru
О проекте · RSS · Сослаться на нас

Дизайн и программирование —
Batch2k15.

Сопровождение сайта — НТК «Биотекст».

Условия использования сайта
Об ошибках сообщайте вебмастеру.