https://biolabmix.ru/catalog/rna-transcription-mrna/?erid=LdtCKWnpq
Подписаться
Оглавление
Биомолекула

Бакуловирусная экспрессия, или Как мы перерабатываем насекомых

Бакуловирусная экспрессия, или Как мы перерабатываем насекомых

  • 1319
  • 0,6
  • 1
  • 2
Добавить в избранное print
Обзор

Тутовый шелкопряд — не только производитель шелка, но и часто используемый объект в бакуловирусной экспрессии.

Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Каждый из нас уже знает о том, что можно создать «минифермы» организмов, которые работают за человека. Например, дрожжи «делают» хлеб, а бактерии — антибиотики. Но потребности человечества становятся все больше, и необходимо синтезировать новые специфические вещества. Именно поэтому в данной статье будет рассказано про бакуловирусную экспрессию, благодаря которой можно синтезировать сложные белковые молекулы, а также показаны ее особенности и применение.

Конкурс «Био/Мол/Текст»-2022/2023

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «Био/Мол/Текст»-2022/2023.

SkyGen

Партнер номинации — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.


«Альпина нон-фикшн»

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Глава 1. Знакомство с бакуловирусной экспрессией

Белки — важные органические вещества. В организме человека они выполняют строительные, регуляторные, защитные, гормональные функции. Но иногда каких-то веществ не хватает, и развиваются болезни. Для того чтобы предотвратить страшные последствия, люди придумали выделять белки из других организмов. Уже известно, что из растений и грибов можно выделять пищевые белки [1], из бактерий — необходимые для нормальной жизнедеятельности человека гормоны и антибиотики. Альтернативным источником может стать бакуловирусная экспрессия.

Бакуловирусная система экспрессии (БЭС) — это биотехнологический метод, основанный на заражении клеток насекомых специальными бакуловирусами со встроенным геном нужного нам белка. Эти вирусы являются патогенами только для членистоногих и безопасны для других живых организмов. После заражения инфицированные клетки начинают синтезировать чужеродный, то есть рекомбинантный, белок. Бакуловирусная экспрессия — это перспективное направление, потому что можно получать большое количество сложных белковых соединений при минимальных затратах.

Кто такие эти ваши бакуловирусы?

Как уже было сказано ранее, бакуловирусы — это патогены членистоногих. Они очень специфичны и заражают только один или несколько видов насекомых. Также бакуловирусы не могут реплицироваться, то есть размножаться, в клетках млекопитающих. Все эти факторы облегчают работу лабораторий и производств, которые содержат много различных насекомых [6].

Бакуловирусы делятся на четыре рода: альфа, бета, гамма и дельта. Их различают по нуклеотидным последовательностям и распространению в поражаемых насекомых [7].

Наиболее известными и используемыми в лабораториях являются альфа-бакуловирусы, поэтому мы рассмотрим именно их строение. Однако стоит заметить, что строение вируса может меняться в зависимости от стадии жизненного цикла (рис. 4).

Строение вируса ядерного полиэдроза

Рисунок 4. Строение вируса ядерного полиэдроза

  • Отдельные вирионы (budded virions) — это стержневая вирусная частица, содержащая двухцепочечную кольцевую ДНК в специальной оболочке — капсиде. Такие вирионы необходимы для начала цикла воспроизведения вирусной ДНК и распространения инфекции в другие клетки.
  • Вирионы с мембраной (occlusion derived virions) — это результат взаимодействия определенных вирионов. В процессе образуются окруженные мембраной нуклеокапсиды — тельца со множеством вирионов и белковыми включениями.
  • Полиэдр (occlusion body) — представляет собой множественные вирионы с нуклеокапсидами, окруженные мембранной оболочкой из белка полиэдрина в форме многогранника. Такая форма успешно сохраняет тело вируса во внешней среде.

Взаимодействие бакуловирусов с насекомыми может быть двух видов (рис. 5). Первое — когда частицы попадают в клетку и провоцируют острый инфекционный процесс. Вскоре насекомое погибает, а бакуловирусы выходят наружу. Второе — когда вирус может существовать в теле хозяина долгое время в неактивной форме. Но под влиянием внешних условий он активизируется и приводит к разрушениям клеток.

Жизненный цикл бакуловируса

Рисунок 5. Жизненный цикл бакуловируса

Активное взаимодействие вируса с хозяином происходит следующим образом [8]:

  1. Заражение личинок насекомого путем проглатывания полиэдра с вирусами внутри. Это первичная инфекция.
  2. Растворение полиэдра в щелочной среде кишки и высвобождение вирионов с мембраной.
  3. Транспорт гемолимфой вирионов по телу хозяина, проникновение их в клетки различных органов.
  4. Прикрепление вируса к ядру клетки, избавление от капсида и проникновение внутрь.
  5. Синтез вирусной ДНК, формирование нуклеокапсида в ядре.
  6. Образование полиэдров из новых вирусных частиц, которые разрушают ядро. Они выходят в строму клетки и далее — в полость тела хозяина.
  7. Транспорт гемолимфой отдельных вирионов, не попавших в полиэдры после выхода из ядра, что приводит к инфицированию новых клеток. Это вторичная инфекция.

Процесс повторяется, пока большинство клеток не разрушится [9].

Глава 2. А ты точно работаешь?

Суть метода: мы создаем нужную последовательность ДНК, вставляем ее в сам бакуловирус, выращиваем клетки насекомого, заражаем их созданным нами вирусом, очищаем клетки от ненужных белков.

Но это кратко. А давайте немного поговорим о деталях.

  1. Сначала создают специальный транспортный вектор, который состоит из плазмиды со специальными единицами экспрессии (небольшими участками ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов), ограниченными с двух сторон последовательностями вирусного генома (рис. 6). Все это происходит в пробирках. Последовательно добавляют части транспортного вектора, при высокой температуре они присоединяются друг к другу. Далее эта конструкция нарабатывается с помощью ПЦР.
  2. Схема единицы экспрессии в транспортном векторе

    Рисунок 6. Схема единицы экспрессии в транспортном векторе. Нужную нам последовательность нуклеотидов встраивают в сайт клонирования (СК) между промотором (Рв) и терминатором (Тв). Перед промотором и после терминатора расположены фрагменты вирусного генома (PV).

  3. Самым важным этапом в БЭС является создание рекомбинантного бакуловируса, то есть имеющего в своей ДНК ген необходимого для нас белка. Так как в транспортном векторе есть участки с фрагментами вирусного генома, то за счет них происходит встраивание единицы экспрессии (рис. 7).
    Рекомбинация между вирусной ДНК и транспортной плазмидой

    Рисунок 7. Рекомбинация между вирусной ДНК и транспортной плазмидой

    Основные вирусы, используемые в работе: Autographa californica multipolyhedrovirus (AcMNPV), Cydia pomonella granulovirus (CpGV), Lymantria dispar multicapsid nuclear polyhedrosis virus (LdMNPV) [11].
    Существует несколько методик создания рекомбинантного бакуловируса (рис. 8):
    • Во-первых, можно использовать трансфекцию насекомых — введение ДНК через мембрану клетки. Для этого культуру клеток насекомых инфицируют бакуловирусом, далее добавляют транспортный вектор с закодированным нужным нам белком. Он встраивается в вирусную ДНК. После вся эта смесь очищается от вируса без встроенной последовательности, что делает эту методику создания рекомбинантного вируса самой трудоемкой из всех трёх.
    • Во-вторых, можно использовать клетки бактерий, таких как Escherichia coli. Этот метод наиболее популярен в лабораториях. Как и в первом случае, происходит процесс поглощения свободной ДНК из среды и ее встраивание. Однако рекомбинантный вирус создается не в клетках насекомых, а в бактериях.
    • В-третьих, можно использовать рекомбинацию in vitro, то есть в пробирке. В этом случае происходит сайт-специфическая рекомбинация, когда обмен происходит в определенных участках генома и не требует большого сходства с бакуловирусной ДНК.
    Схема получения рекомбинантного бакуловируса

    Рисунок 8. Схема получения рекомбинантного бакуловируса с последующим синтезом рекомбинантного белка с помощью гомологичной рекомбинации между транспортным вектором и вирусным геномом.

  4. После встраивания рекомбинантные бакуловирусы распознают и выделяют с помощью ПЦР-скрининга или маркерных генов.
  5. Рекомбинантными бакуловирусами заражают культуры клеток насекомых. Самые популярные насекомые, которые используются при работе с бакуловирусной экспрессией: мотыльки Spodoptera frugiperda, тутовый шелкопряд Bombyx mori, бабочки Manduca sexta и Ectropis obliqua [12].
  6. Под действием вирусов клетки насекомых разрушаются. Из образовавшегося вещества — лизата — выделяют нужный белок. Тем самым мы «перерабатываем насекомых».

Глава 3. Применение БЭС

Применение метода бакуловирусной экспрессии очень обширно. На данный момент он активно используется преимущественно в медицинских исследованиях.

Создание лекарств

Человечество уже нашло способы лечения многих болезней, однако в этом мире есть еще немало неизученного и (пока что) смертельного. Например, есть исследования по лечению сложных болезней, таких как рак, где используется бакуловирусная экспрессия. Уже выделяют специальные вещества, предотвращающие распространение и рост опухоли [13], вызывающие апоптоз, то есть самоуничтожение, раковых клеток [14], предотвращающие метастазирование [15].

Выделение важных для человека специфических веществ

Очень часто организм человека не производит вещества, а получает их из окружающей среды. Например, различные витамины, жирные кислоты или незаменимые аминокислоты. При каких-либо нарушениях организм не производит достаточное количество ферментов для дальнейшей нормальной жизнедеятельности. Чтобы облегчить людям течение болезни или даже вылечить их, можно производить вещества в других системах, таких как бактерии или даже растения, и вводить их извне.

С помощью бакуловирусной экспрессии можно выделять сложные, но важные для работы человеческого тела β-интерфероны [16], белки коннексины [14] и пептиды эндотелины [17].

Выделение вирусоподобных частиц для создания вакцин

Вакцинация — неотъемлемая часть современного мира. Благодаря ей число ежегодных смертей от инфекционных болезней значительно падает. Вакцина — препарат, содержащий ослабленный вирус или другой патоген целиком или его поверхностные белки, и стимулирующий работу приобретенного иммунитета по отношению к определенному антигену. Это простой способ защищаться от болезней до вступления в контакт с возбудителями. Например, уже можно выделять вирусоподобные частицы таких заболеваний, как грипп [18], гепатит Е [19] и бешенство [20].

***

Итак, понятно, что бакуловирусная экспрессия — это очень перспективный метод, это безопасная и удобная система для выделения сложных белков из клеток насекомых. Хочется верить, что в скором времени бакуловирусная экспрессия в России станет популярной и будет использоваться в исследованиях наравне с другими странами. Может быть, после прочтения этой статьи, вы заинтересуетесь этой темой и активно примете участие в ее развитии.

Литература

  1. Новиков Д.А. Выделение и очистка продуктов биотехнологии. Минск: БГУ, 2014. — 256 с.;
  2. Cornalia E. Monographia del bombice del gelso. Milano: Giuseppe Bernardoni di Gio, 1856. P. 348–351.;
  3. Bergold G.H. (1947). Comprehensive early studies on purification of baculovirus virions, confirmed that virus-like particles were occluded in polyhedral. Z. f. Naturforsch. 122–143;
  4. Boguslaw Szewczyk, Liliana Hoyos-Carvajal, Maria Paluszek, Iwona Skrzecz, Marlinda Lobo de Souza. (2006). Baculoviruses — re-emerging biopesticides. Biotechnology Advances. 24, 143-160;
  5. G E Smith, M D Summers, M J Fraser. (1983). Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol Cell Biol. 3, 2156-2165;
  6. Хасанов Ш.Ш., Сасмаков С.А., Абдурахманов Ж.М., Аширов О.Н.Ў., Азимова Ш.С. (2019). Бакуловирусная система экспрессии, как безопасная и эффективная система для получения рекомбинантных белков. «Universum: химия и биология», 6(60), 13–16;
  7. А. В. Ильиных. (2019). Вертикальная передача бакуловирусов. Изв. РАН. Сер. биол.. 321-330;
  8. S. N. Beljelarskaya. (2011). Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Mol Biol. 45, 123-138;
  9. Moo-Young M. Comprehensive biotechnology. Elsevier B.V., 2011. — 5320 p.;
  10. Глик Б. и Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: «Мир», 2002. — 589 с.;
  11. Murhamme D.W. Baculovirus and insect cell expression protocols. Humana, 2007. — 484 p.;
  12. Dwight E. Lynn, Robert L. Harrison. (2016). Available Lepidopteran Insect Cell Lines. Methods in Molecular Biology. 119-142;
  13. Yurie Kinoshita, Jian Xu, Akitsu Masuda, Kosuke Minamihata, Noriho Kamiya, et. al.. (2019). Expression and purification of biologically active human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (hGM-CSF) using silkworm-baculovirus expression vector system. Protein Expression and Purification. 159, 69-74;
  14. Эдельвейс Э.Ф., Баландин Т.Г., Мишин А.В., Горделий В.И. (2010). Бакуловирусная экспрессия коннексина 26 в клетках насекомых Sf9. «Труды 53-й научной конференции МФТИ». 39–40;
  15. Meng-ke Fan, Guo-chuan Zhang, Wei Chen, Li-li Qi, Ming-fang Xie, et. al.. (2021). Siglec-15 Promotes Tumor Progression in Osteosarcoma via DUSP1/MAPK Pathway. Front. Oncol.. 11;
  16. Вагина И.Н., Аноприенко О.В., Захарук Е.А., Строковская Л.И. Перенос гена β-интерферона в клетки млекопитающих рекомбинантным бакуловирусным вектором. Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. (Т. 9), 2010. С. 219–224;
  17. A. V. Mishin, A. P. Luginina, A. P. Potapenko, V. I. Borshchevskiy, V. Katritch, et. al.. (2016). Expression and purification of an engineered human endothelin receptor B in a monomeric form. Dokl Biochem Biophys. 467, 157-161;
  18. Петухова Н.В., Иванов П.А., Мигунов А.И. (2013). Вирусоподобные частицы новая стратегия для создания противогриппозных вакцин. «Вопросы вирусологии». 58 (2), 10–14;
  19. Гордейчук И.В. (2014). Вакцины против гепатита E. Разработка, производство, клинические испытания. «Мир вирусных гепатитов». 4, 6–19;
  20. Thaissa Consoni Bernardino, Renato Mancini Astray, Carlos Augusto Pereira, Vera Lucia Boldorini, Marta Maria Antoniazzi, et. al.. (2021). Production of Rabies VLPs in Insect Cells by Two Monocistronic Baculoviruses Approach. Mol Biotechnol. 63, 1068-1080.

Комментарии