Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Каждый из нас уже знает о том, что можно создать «минифермы» организмов, которые работают за человека. Например, дрожжи «делают» хлеб, а бактерии — антибиотики. Но потребности человечества становятся все больше, и необходимо синтезировать новые специфические вещества. Именно поэтому в данной статье будет рассказано про бакуловирусную экспрессию, благодаря которой можно синтезировать сложные белковые молекулы, а также показаны ее особенности и применение.
Белки — важные органические вещества. В организме человека они выполняют строительные, регуляторные, защитные, гормональные функции. Но иногда каких-то веществ не хватает, и развиваются болезни. Для того чтобы предотвратить страшные последствия, люди придумали выделять белки из других организмов. Уже известно, что из растений и грибов можно выделять пищевые белки [1], из бактерий — необходимые для нормальной жизнедеятельности человека гормоны и антибиотики. Альтернативным источником может стать бакуловирусная экспрессия.
Бакуловирусная система экспрессии (БЭС) — это биотехнологический метод, основанный на заражении клеток насекомых специальными бакуловирусами со встроенным геном нужного нам белка. Эти вирусы являются патогенами только для членистоногих и безопасны для других живых организмов. После заражения инфицированные клетки начинают синтезировать чужеродный, то есть рекомбинантный, белок. Бакуловирусная экспрессия — это перспективное направление, потому что можно получать большое количество сложных белковых соединений при минимальных затратах.
Кто такие эти ваши бакуловирусы?
Как уже было сказано ранее, бакуловирусы — это патогены членистоногих. Они очень специфичны и заражают только один или несколько видов насекомых. Также бакуловирусы не могут реплицироваться, то есть размножаться, в клетках млекопитающих. Все эти факторы облегчают работу лабораторий и производств, которые содержат много различных насекомых [6].
Бакуловирусы делятся на четыре рода: альфа, бета, гамма и дельта. Их различают по нуклеотидным последовательностям и распространению в поражаемых насекомых [7].
Наиболее известными и используемыми в лабораториях являются альфа-бакуловирусы, поэтому мы рассмотрим именно их строение. Однако стоит заметить, что строение вируса может меняться в зависимости от стадии жизненного цикла (рис. 4).
Отдельные вирионы (budded virions) — это стержневая вирусная частица, содержащая двухцепочечную кольцевую ДНК в специальной оболочке — капсиде. Такие вирионы необходимы для начала цикла воспроизведения вирусной ДНК и распространения инфекции в другие клетки.
Вирионы с мембраной (occlusion derived virions) — это результат взаимодействия определенных вирионов. В процессе образуются окруженные мембраной нуклеокапсиды — тельца со множеством вирионов и белковыми включениями.
Полиэдр (occlusion body) — представляет собой множественные вирионы с нуклеокапсидами, окруженные мембранной оболочкой из белка полиэдрина в форме многогранника. Такая форма успешно сохраняет тело вируса во внешней среде.
Взаимодействие бакуловирусов с насекомыми может быть двух видов (рис. 5). Первое — когда частицы попадают в клетку и провоцируют острый инфекционный процесс. Вскоре насекомое погибает, а бакуловирусы выходят наружу. Второе — когда вирус может существовать в теле хозяина долгое время в неактивной форме. Но под влиянием внешних условий он активизируется и приводит к разрушениям клеток.
Активное взаимодействие вируса с хозяином происходит следующим образом [8]:
Заражение личинок насекомого путем проглатывания полиэдра с вирусами внутри. Это первичная инфекция.
Растворение полиэдра в щелочной среде кишки и высвобождение вирионов с мембраной.
Транспорт гемолимфой вирионов по телу хозяина, проникновение их в клетки различных органов.
Прикрепление вируса к ядру клетки, избавление от капсида и проникновение внутрь.
Синтез вирусной ДНК, формирование нуклеокапсида в ядре.
Образование полиэдров из новых вирусных частиц, которые разрушают ядро. Они выходят в строму клетки и далее — в полость тела хозяина.
Транспорт гемолимфой отдельных вирионов, не попавших в полиэдры после выхода из ядра, что приводит к инфицированию новых клеток. Это вторичная инфекция.
Процесс повторяется, пока большинство клеток не разрушится [9].
Глава 2. А ты точно работаешь?
Суть метода: мы создаем нужную последовательность ДНК, вставляем ее в сам бакуловирус, выращиваем клетки насекомого, заражаем их созданным нами вирусом, очищаем клетки от ненужных белков.
Но это кратко. А давайте немного поговорим о деталях.
Сначала создают специальный транспортный вектор, который состоит из плазмиды со специальными единицами экспрессии (небольшими участками ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов), ограниченными с двух сторон последовательностями вирусного генома (рис. 6). Все это происходит в пробирках. Последовательно добавляют части транспортного вектора, при высокой температуре они присоединяются друг к другу. Далее эта конструкция нарабатывается с помощью ПЦР.
Рисунок 6. Схема единицы экспрессии в транспортном векторе. Нужную нам последовательность нуклеотидов встраивают в сайт клонирования (СК) между промотором (Рв) и терминатором (Тв). Перед промотором и после терминатора расположены фрагменты вирусного генома (PV).
Самым важным этапом в БЭС является создание рекомбинантного бакуловируса, то есть имеющего в своей ДНК ген необходимого для нас белка. Так как в транспортном векторе есть участки с фрагментами вирусного генома, то за счет них происходит встраивание единицы экспрессии (рис. 7).
Рисунок 7. Рекомбинация между вирусной ДНК и транспортной плазмидой
Основные вирусы, используемые в работе: Autographa californica multipolyhedrovirus (AcMNPV), Cydia pomonella granulovirus (CpGV), Lymantria dispar multicapsid nuclear polyhedrosis virus (LdMNPV) [11].
Существует несколько методик создания рекомбинантного бакуловируса (рис. 8):
Во-первых, можно использовать трансфекцию насекомых — введение ДНК через мембрану клетки. Для этого культуру клеток насекомых инфицируют бакуловирусом, далее добавляют транспортный вектор с закодированным нужным нам белком. Он встраивается в вирусную ДНК. После вся эта смесь очищается от вируса без встроенной последовательности, что делает эту методику создания рекомбинантного вируса самой трудоемкой из всех трёх.
Во-вторых, можно использовать клетки бактерий, таких как Escherichia coli. Этот метод наиболее популярен в лабораториях. Как и в первом случае, происходит процесс поглощения свободной ДНК из среды и ее встраивание. Однако рекомбинантный вирус создается не в клетках насекомых, а в бактериях.
В-третьих, можно использовать рекомбинацию in vitro, то есть в пробирке. В этом случае происходит сайт-специфическая рекомбинация, когда обмен происходит в определенных участках генома и не требует большого сходства с бакуловирусной ДНК.
Рисунок 8. Схема получения рекомбинантного бакуловируса с последующим синтезом рекомбинантного белка с помощью гомологичной рекомбинации между транспортным вектором и вирусным геномом.
После встраивания рекомбинантные бакуловирусы распознают и выделяют с помощью ПЦР-скрининга или маркерных генов.
Рекомбинантными бакуловирусами заражают культуры клеток насекомых. Самые популярные насекомые, которые используются при работе с бакуловирусной экспрессией: мотыльки Spodoptera frugiperda, тутовый шелкопряд Bombyx mori, бабочки Manduca sexta и Ectropis obliqua[12].
Под действием вирусов клетки насекомых разрушаются. Из образовавшегося вещества — лизата — выделяют нужный белок. Тем самым мы «перерабатываем насекомых».
Глава 3. Применение БЭС
Применение метода бакуловирусной экспрессии очень обширно. На данный момент он активно используется преимущественно в медицинских исследованиях.
Создание лекарств
Человечество уже нашло способы лечения многих болезней, однако в этом мире есть еще немало неизученного и (пока что) смертельного. Например, есть исследования по лечению сложных болезней, таких как рак, где используется бакуловирусная экспрессия. Уже выделяют специальные вещества, предотвращающие распространение и рост опухоли [13], вызывающие апоптоз, то есть самоуничтожение, раковых клеток [14], предотвращающие метастазирование [15].
Выделение важных для человека специфических веществ
Очень часто организм человека не производит вещества, а получает их из окружающей среды. Например, различные витамины, жирные кислоты или незаменимые аминокислоты. При каких-либо нарушениях организм не производит достаточное количество ферментов для дальнейшей нормальной жизнедеятельности. Чтобы облегчить людям течение болезни или даже вылечить их, можно производить вещества в других системах, таких как бактерии или даже растения, и вводить их извне.
С помощью бакуловирусной экспрессии можно выделять сложные, но важные для работы человеческого тела β-интерфероны [16], белки коннексины [14] и пептиды эндотелины [17].
Выделение вирусоподобных частиц для создания вакцин
Вакцинация — неотъемлемая часть современного мира. Благодаря ей число ежегодных смертей от инфекционных болезней значительно падает. Вакцина — препарат, содержащий ослабленный вирус или другой патоген целиком или его поверхностные белки, и стимулирующий работу приобретенного иммунитета по отношению к определенному антигену. Это простой способ защищаться от болезней до вступления в контакт с возбудителями. Например, уже можно выделять вирусоподобные частицы таких заболеваний, как грипп [18], гепатит Е [19] и бешенство [20].
***
Итак, понятно, что бакуловирусная экспрессия — это очень перспективный метод, это безопасная и удобная система для выделения сложных белков из клеток насекомых. Хочется верить, что в скором времени бакуловирусная экспрессия в России станет популярной и будет использоваться в исследованиях наравне с другими странами. Может быть, после прочтения этой статьи, вы заинтересуетесь этой темой и активно примете участие в ее развитии.
Bergold G.H. (1947). Comprehensive early studies on purification of baculovirus virions, confirmed that virus-like particles were occluded in polyhedral. Z. f. Naturforsch. 122–143;
Вагина И.Н., Аноприенко О.В., Захарук Е.А., Строковская Л.И. Перенос гена β-интерферона в клетки млекопитающих рекомбинантным бакуловирусным вектором. Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. (Т. 9), 2010. С. 219–224;
Больше Биомолекула рассказывает о биологии и медицине — сейчас у нас на сайте несколько тысяч статей. Если вам нравится наш сайт и вы хотите, чтобы он дальше работал, поддержите нас, пожалуйста, посильной суммой — разово или ежемесячно. Ежемесячные платежи предпочтительнее 😀
