Конкурс «Био/Мол/Текст»-2023/2024

Эта работа опубликована в номинации «Своя работа» конкурса «Био/Мол/Текст»-2023/2024 и заслужила приз Honoris causa.

Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.

---

Партнер номинации — компания «Хеликон»: — один из ведущих российских поставщиков продукции и услуг для молекулярно-биологических и клеточных лабораторий.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Кто потребляет больше калорий, чем тратит, тот рискует запастись жиром и сопутствующими заболеваниями. Ограничение же калорий в питании, как уже неоднократно показано, положительно влияет на организм, вплоть до увеличения продолжительности жизни, что продемонстрировано на животных («Добавки не будет: голодание продлевает мышам жизнь. А что насчет людей?» [1]).

Одним из главных последствий диеты считается перевод питания организма с углеводов (глюкоза) на кетоновые тела.

Существует также кетогенная диета, имитирующая метаболические эффекты ограничений калорийности питания (ОКП), богатая жирами и бедная на углеводы. Она также имеет свои плюсы и изначально использовалась как терапевтическая стратегия при лечении эпилепсии [2], [3]. «Биомолекула» уже писала про пользу кетогенной диеты при депрессивных расстройствах в статье «Чем заедать тоску? Механизмы антидепрессивного действия средиземноморской и кетогенной диет» [4].

Такие энергетические перестройки при ОКП, как показали ученые, имеют защитный эффект при патологиях различных органов: при инфаркте миокарда [5], дегенеративных заболеваниях головного мозга [6], гипертонии [7], сахарном диабете [8], онкологических болезнях [9] и при почечных патологиях. Так, показано, что 10–40%-ое ограничение калорий (от исходного потребления) защищает почки при ишемической болезни и при токсическом повреждении [10], [11], [12], [13].

Заболевания почек — не то чтобы редкое явление, и они до сих пор остаются актуальной проблемой во всем мире [14]. От 8 до 22% пациентов в больницах попадают туда с острым почечным повреждением [15]. Потому предупреждение таких болезней как у молодых, так и наиболее подверженных риску таких заболеваний, пожилых людей, и снижение повреждения органа является актуальной задачей медицины.

В данной статье мы хотим поделиться собственной работой, посвященной исследованию влияния ОКП на острое повреждение почек у молодых и старых крыс. Как уже отмечалось выше, определить возрастные отличия очень важно. Многие терапевтические стратегии показаны на молодых животных. Тем не менее, в процессе старения работа клеток организма изменяется, что может нивелировать эффекты терапии.

Как было показано нами в 2018 году в исследовании, диета животных в течение 4-х недель помогала от повреждения почек при ишемии/реперфузии у молодых животных, но не у старых [16]. Такое кратковременное воздействие не защитило старых животных, в сравнении с молодыми, и мы в дальнейшей работе увеличили срок ОКП до 8 недель, чтобы проверить, будет ли увеличение диеты влиять на защитные механизмы почки пожилых животных. Мы показали, что ОКП, на котором сидели крысы уже 8 недель перед операцией по ишемии/реперфузии почки, нивелировала некоторые патологические процессы, как у молодых, так и у старых животных, но с некоторыми отличиями [17].

Операция по ишемии/реперфузии почек представляла из себя пережимание почечных сосудов специальным зажимом на 40 минут, останавливая кровоток в органе, с последующим снятием зажима (реперфузией). Такая операция моделирует острое почечное повреждение. Повреждение почек анализировалось спустя 48 часов после реперфузии.

Рассмотрим протекающие процессы при этом воздействии более подробно.

Молодые крысы за 4 недели с ОКП 35% (вычет 35% калорий от тех, что крыса потребляет без ограничения) худеют на 15%, как и старые животные похудели на 28% за 8 недель такой диеты. Это не только «подготовило тело к лету», а также привело к серьезным биологическим изменениям [17]:

Во-первых, стоит отметить меньшее почечное повреждение у молодых животных на диете, что отражалось в уменьшении содержания креатинина и уровня азота мочевины в крови — двух показателей, которые в крови возрастают при повреждении почек. К сожалению, у старых крыс диета к такому эффекту не приводила.

Во-вторых, мы измерили в почке маркер активного деления клеток PCNA (proliferating cell nuclear antigen). Оказалось, что и у молодых, и у старых крыс диета вызывает увеличение его продукции в прооперированных почках (у молодых в 19 раз, у старых в 4,5 раза). И хотя мы наблюдали положительный эффект диеты, говорящий о том, что регенеративные свойства клеток почки возрастает, у старых крыс такой эффект намного меньше, хотя не будем отрицать его существование!

В-третьих, мы изучили, как ОКП влияет на процесс аутофагии при исследуемой патологии почек. Данный процесс необходим клеткам, чтобы утилизировать старые или поврежденные внутренние компоненты, переваривая их лизосомальными ферментами. Более подробно об этом процессе уже говорилось на «Биомолекуле»: «Аутофагия, протофагия и остальные» [18].

В целом, эффект был более выражен у молодых животных, у которых ОКП активировало аутофагию, хотя в какой-то степени активация аутофагии наблюдалась и у старых крыс.

В-четвертых, стоит отметить, что митохондрии имеют важное значение как в норме, так и при развитии болезней. Потому мы исследовали, как ОКП влияет на их изменения при ишемии/реперфузии.

Так, при помощи специального красителя TMRE, который накапливается при окраске в нормально функционирующих митохондриях в соответствии с их трансмембранным потенциалом, мы показали, что ОКП способствует увеличению митохондриальной фракции с более высоким потенциалом как у молодых, так и у старых крыс (рис. 1). Это может быть косвенным свидетельством, что с митохондриями при диете все не так плохо, как без диеты.

Мы рассмотрели еще несколько важных показателей митохондрий, как измерения уровней антиапоптотических («антисуицидных») и проапоптотических («суицидных») белков семейства Bcl-2, соотношение которых говорит клетке, самоубиться ей или нет [19]. На «Биомолекуле» есть прекрасный комикс по теме апоптоза [20]. Логически и обычно практически бывает верно, что если мы «убеждаем» клетки не убивать себя, то мы нивелируем патологические процессы. Способно ли на это ОКП?

Как оказалось, ОКП — весьма хороший мотиватор для жизни клеток! Оно приводит к увеличению содержания антиапоптотической формы Bcl на 57% у молодых крыс, а также к повышению его уровня на 40% у старых животных. Хотя уровни проапоптотических Bcl не изменились после ОКП у крыс как молодых, так и в возрасте [17].

Стоит отметить, что митохондрии умеют реагировать на стресс. Мы имеем в виду окислительный стресс, конечно же. Клеточный фермент деацетилаза SIRT-3 считается сенсором стресса митохондрий, он влияет на активность митохондриальных белков, которые участвуют в метаболизме и путях регуляции окислительного стресса [21]. Так как предполагается, что SIRT-3 является одним из медиаторов защитного эффекта ОКП [22], мы измерили его содержание в почках. В результате в нашем исследовании старые животные не показали никаких изменений, а вот у молодых крыс мы наблюдали значительное увеличение уровня SIRT-3, вызванное ОКП. Эти данные свидетельствуют об еще одном механизме защиты почки, который ухудшается с возрастом [17].

К слову, стресс (который ранее прекрасно описан на «Биомолекуле»: «Активный кислород: друг или враг, или О пользе и вреде антиоксидантов») [23] мы тоже оценивали в нашей модели ишемии/реперфузии почки с диетой.

Для определения в органах содержания активных форм кислорода используют краску DCF. Проинкубировав срезы почки с DCF, мы обнаружили, что почки старых крыс после операции приобретают более интенсивную окраску DCF, чем молодые почки. Кроме того, ОКП значительно снижало флуоресцентную окраску DCF как у молодых, так и у старых животных (рис. 2).

Активные формы кислорода, провоцирующие окислительный стресс клеток, влияют и на карбонилирование белков (введения карбонильных групп С=О путем взаимодействия с оксидом углерода). В нашей работе мы проанализировали общее карбонилирование белков. Как и в предыдущих результатах с DCF, ишемия/реперфузия провоцировала увеличение карбонилирования белков в почках животных, а при ОКП этот показатель снижался, но был выше у старых крыс по сравнению с молодыми [17].

Таким образом, мы показали, что, кроме общего воздействия ОКП на функционирование почек (уровень креатинина и азота мочевины в крови), важными путями действия данной диеты является:

1. активация пролиферации (деления) клеток;
2. активация аутофагии (процесс, помогающий клеткам удалять дефектные макромолекулы и органеллы);
3. сохранение действующих «энергетических станций» клеток, митохондрий;
4. а также снижение окислительного стресса.

Хоть у старых животных наблюдались отличия в эффективности действия ОКП, 8-ми недельная диета имела положительные тенденции и запускала некоторые защитные механизмы клеток почек. Тем не менее, несмотря на все наблюдаемые защитные признаки, ОКП не смог облегчить повреждение почек, вызванное ишемией/реперфузией, у старых крыс. Возможно, молекулярные, структурные и функциональные изменения, возникающие в процессе старения, не позволяют диете обеспечить эффективную защиту почек.

В 2021 году мы опубликовали обзорную статью, посвященную механизмам влияния ОКП при старении (рис. 3).

Стоит отметить, что на этом мы не остановились, а проверили наши результаты на еще одной интересной модели животных как крысы линии OXYS (крысы с ускоренным старением). Результаты опубликованы в 2022 году [25]. Показано, что у крыс OXYS спонтанно развивается синдром ускоренного старения, сходного с человеческими гериатрическими заболеваниями, включая катаракту, инволюцию тимуса, гипертрофическую кардиомиопатию, саркопению, остеопороз, ретинопатию и признаки болезни Альцгеймера [25], в связи с чем крысы OXYS могут выступать животной моделью для изучения молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний.

В данном исследования крысы линии OXYS сидели 4 недели на ОКП, после чего мы также проводили операцию по ишемии/реперфузии (40 мин — ишемия и 48 часов — реперфузия). Мы обнаружили, как и в описанных выше результатах, меньшее почечное повреждение у животных на диете, что отражалось в уменьшении содержания креатинина и уровня азота мочевины в крови, а также по содержанию молекул, говорящих о почечном повреждении (Kim-1). То есть ОКП защищало даже преждевременно стареющих животных!

В ходе описываемой большой проделанной работы остается вопрос, раз диета помогает, если сидеть на ней перед началом воздействия патологического фактора, будет ли она помогать, если сначала возникнет критическое состояние, а потом уже ограничить себя в калориях? Это мы и решили проверить в недавнем исследовании [26]. В ходе эксперимента мы оценивали степень развития фиброза почки после такой же операции по ишемии/реперфузии, после чего мыши были посажены на диеты: ОКП и кетогенную диету.

Ни при помощи морфологических (рис. 4), ни биохимических методов исследования, ни изучения экспрессии маркеров фиброза мы не обнаружили улучшения состояния почек животных ни при одной из диет [26]. Значит, к напастям надо готовиться все-таки заранее…

Таким образом, в результате нашей работы, мы можем сказать о защитных эффектах ограничения калорийности питания при развитии острого почечного повреждения, и эффекты эти максимальны в молодости. К сожалению, возрастные изменения не позволяют диете достичь тех же эффектов у старых животных, что и у молодых. И спасаться уже после «пожара» может быть поздно. И все-таки держите хвост пистолетом, не переедайте и следите за своим образом жизни, это позволит продлить ваше здоровье и, в частности, защитить, в случае чего, ваши почки.

Работа поддерживалась грантами РНФ 18-15-00058 и 21-75-30009 и выполнялась под руководством д.б.н., профессора РАН, Егора Юрьевича Плотникова.

Литература

1. Добавки не будет: голодание продлевает мышам жизнь. А что насчет людей?;
2. Ciara I. Makievskaya, Vasily A. Popkov, Nadezda V. Andrianova, Xinyu Liao, Dmitry B. Zorov, Egor Y. Plotnikov. (2023). Ketogenic Diet and Ketone Bodies against Ischemic Injury: Targets, Mechanisms, and Therapeutic Potential. IJMS. 24, 2576;
3. Elmira I. Yakupova, Alexey D. Bocharnikov, Egor Y. Plotnikov. (2022). Effects of Ketogenic Diet on Muscle Metabolism in Health and Disease. Nutrients. 14, 3842;
4. Чем заедать тоску? Механизмы антидепрессивного действия средиземноморской и кетогенной диет;
5. Susanne Rohrbach, Muhammad Aslam, Bernd Niemann, Rainer Schulz. (2014). Impact of caloric restriction on myocardial ischaemia/reperfusion injury and new therapeutic options to mimic its effects. British J Pharmacology. 171, 2964-2992;
6. Salvatore Fusco, Giovambattista Pani. (2013). Brain response to calorie restriction. Cell. Mol. Life Sci.. 70, 3157-3170;
7. Xuefeng Han, Jun Ren. (2010). Caloric restriction and heart function: is there a sensible link?. Acta Pharmacol Sin. 31, 1111-1117;
8. Matheni Sathananthan, Meera Shah, Kim L Edens, Karen B Grothe, Francesca Piccinini, et. al.. (2015). Six and 12 Weeks of Caloric Restriction Increases β Cell Function and Lowers Fasting and Postprandial Glucose Concentrations in People with Type 2 Diabetes1–3. The Journal of Nutrition. 145, 2046-2051;
9. Mona Alidadi, Maciej Banach, Paul C. Guest, Simona Bo, Tannaz Jamialahmadi, Amirhossein Sahebkar. (2021). The effect of caloric restriction and fasting on cancer. Seminars in Cancer Biology. 73, 30-44;
10. Franziska Grundmann, Roman‐Ulrich Müller, Annika Reppenhorst, Lennart Hülswitt, Martin R. Späth, et. al.. (2018). Preoperative Short‐Term Calorie Restriction for Prevention of Acute Kidney Injury After Cardiac Surgery: A Randomized, Controlled, Open‐Label, Pilot Trial. JAHA. 7;
11. Martin R. Späth, Malte P. Bartram, Nicolàs Palacio-Escat, K. Johanna R. Hoyer, Cedric Debes, et. al.. (2019). The proteome microenvironment determines the protective effect of preconditioning in cisplatin-induced acute kidney injury. Kidney International. 95, 333-349;
12. Felix C. Koehler, Martin R. Späth, K. Johanna R. Hoyer-Allo, Roman-Ulrich Müller. (2022). Mechanisms of Caloric Restriction-Mediated Stress-Resistance in Acute Kidney Injury. Nephron. 146, 234-238;
13. Xiao-meng Xu, Guang-yan Cai, Ru Bu, Wen-juan Wang, Xue-yuan Bai, et. al.. (2015). Beneficial Effects of Caloric Restriction on Chronic Kidney Disease in Rodent Models: A Meta-Analysis and Systematic Review. PLoS ONE. 10, e0144442;
14. Boris Bikbov, Caroline A Purcell, Andrew S Levey, Mari Smith, Amir Abdoli, et. al.. (2020). Global, regional, and national burden of chronic kidney disease, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. 395, 709-733;
15. Dmytro Khadzhynov, Danilo Schmidt, Juliane Hardt, Geraldine Rauch, Peter Gocke, et. al.. (2019). The Incidence of Acute Kidney Injury and Associated Hospital Mortality. Deutsches Ärzteblatt international;
16. Nadezda V. Andrianova, Stanislovas S. Jankauskas, Ljubava D. Zorova, Irina B. Pevzner, Vasily A. Popkov, et. al.. (2018). Mechanisms of Age-Dependent Loss of Dietary Restriction Protective Effects in Acute Kidney Injury. Cells. 7, 178;
17. Nadezda V. Andrianova, Ljubava D. Zorova, Irina B. Pevzner, Vasily A. Popkov, Valery P. Chernikov, et. al.. (2020). Resemblance and differences in dietary restriction nephroprotective mechanisms in young and old rats. Aging. 12, 18693-18715;
18. Аутофагия, протофагия и остальные;
19. Megan Stevens, Sebastian Oltean. (2019). Modulation of the Apoptosis Gene Bcl-x Function Through Alternative Splicing. Front. Genet.. 10;
20. Апоптоз, или Путь самурая;
21. Bong-Hyun Ahn, Hyun-Seok Kim, Shiwei Song, In Hye Lee, Jie Liu, et. al.. (2008). A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 105, 14447-14452;
22. Leonard Guarente, Frédéric Picard. (2005). Calorie Restriction— the SIR2 Connection. Cell. 120, 473-482;
23. Активный кислород: друг или враг, или О пользе и вреде антиоксидантов;
24. Nadezda V. Andrianova, Marina I. Buyan, Anastasia K. Bolikhova, Dmitry B. Zorov, Egor Y. Plotnikov. (2021). Dietary Restriction for Kidney Protection: Decline in Nephroprotective Mechanisms During Aging. Front. Physiol.. 12;
25. Nadezda V. Andrianova, Ljubava D. Zorova, Irina B. Pevzner, Nataliya G. Kolosova, Egor Y. Plotnikov, Dmitry B. Zorov. (2022). Calorie Restriction Provides Kidney Ischemic Tolerance in Senescence-Accelerated OXYS Rats. IJMS. 23, 15224;
26. E.I. Yakupova, D.S. Semenovich, P.A. Abramicheva, L.D. Zorova, I.B. Pevzner, et. al.. (2023). Effects of caloric restriction and ketogenic diet on renal fibrosis after ischemia/reperfusion injury. Heliyon. 9, e21003.