Конкурс «Био/Мол/Текст»-2021/2022

Эта работа опубликована в номинации «Биофизика» конкурса «Био/Мол/Текст»-2021/2022.

Партнер номинации — компания «БиоЛайн».

---

Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.

---

Генеральный партнер конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

А вы точно компания грузоперевозок?

Сколько же в клетке имеется разнообразного транспорта молекул. Часто им заняты белки: они переносят грузы через клетку на себе, пропускают молекулы через мембраны [2]. В общем, обычно белки-транспортеры прямо взаимодействуют с грузами. Поэтому мы расскажем о других белках. Они переносят грузы новым для биологов способом. В первой части статьи вы узнаете, что на самом деле действуют эти белки просто и, возможно, самым архаичным способом.

Самый новый и самый непонятный вид транспорта

Нестандартная транспортная система состоит из двух белков, MinE и MinD, и называется MinDE. Когда белки соединяются друг с другом на мембране, то начинают перемещаться по ней (рис. 1а и б). Для движения они расщепляют АТФ: в химических связях этой молекулы запасено много энергии. Поскольку MinDE используют энергию, их движение можно назвать активным транспортом.

В одиночку MinDE движется по мембране в случайном направлении. Но когда белков много, они объединяются в волны, которые движутся синхронно. Однако бесконечное движение волн белков по одному же кругу на длинной выдержке выглядит как диффузия. Ведь оно не меняет постоянный состав мембраны. Этим поведение системы MinDE похоже на диффузию. Поэтому движение белков MinDE можно назвать активной диффузией [3].

Система MinDE перемещает грузы по мембране клетки и управляет делением: задает ось, по которой разделится бактерия и разорвутся хромосомы [4]. Но в статье мы изучим только транспорт грузов по мембране. Он, скажем честно, странный, так что давайте разбираться

Невозможное наблюдение

В 2018 году [1] ученые выяснили, что система MinDE перемещает молекулы по мембране, но каким-то неизвестным способом. Давайте рассмотрим схему эксперимента — так мы поймем, что удивило авторов статьи.

Исследователи использовали белок стрептавидин в качестве груза для MinDE. Для эксперимента подготовили мембрану из липидов, сшитых с биотином — молекулой, которая сильно связывается со стрептавидином. Это заякоривало стрептавидин на мембране так, что перемещать его могла лишь какая-то постоянная сила.

Когда исследователи добавили к стрептавидину MinD, MinE и АТФ, то увидели, что движение MinDE переносит стрептавидин по мембране. Это поняли по свечению флуоресцентных меток, привязанных к белкам. Белки флуоресцировали разными цветами: MinD — зеленым, стрептавидин — синим. Исследователи увидели движение разных цветов, которое начиналось после сборки MinDE. Это доказывало, что MinDE переносит стрептавидин.

Однако MinDE не мог переносить стрептавидин: по ходу движения они разделялись. Зеленые и синие цвета отделялись друг от друга и собирались в одноцветные полосы (рис. 1б, г). Полосы разных цветов двигались вместе, хотя MinDE внутри зеленых полос не мог переносить на себе груз, который был внутри другой, синей, полосы. При этом сам по себе стрептавидин перемещаться тоже не может. Значит, MinDE как-то управляет движением стрептавидина, не касаясь его.

Подтверждение на новых грузах: это работает так же.

После стрептавидина исследователи проверили наблюдения на другом мембранном белке mCh-MTS. Его собрали из MTS (белок из системы MinD Bacillus subtilis) и флуоресцентного белка mCherry. mCh-MTS связан с мембраной непрочно и хаотично двигается без дополнительных сил. Но MinDE разделялся с ним на полосы так же, как со стрептавидином.

Невероятное объяснила физика жидкостей

За три года физики нашли силу, которая отделяет грузы от транспортеров, и доказали свою гипотезу. Для этого они дополнительно изучили процесс.

Исследователи присоединяли к стрептавидину сверху ДНК-оригами — фигурки из нуклеиновых кислот. Их использовали, чтобы объединять много молекул стрептавидина в одну группу — под общей крышей из ДНК-оригами. Такие кучки из стрептавидина отличались от единичных молекул только большим размером. Было важно проверить, зависит ли от него движущая сила.

Оказалось, что большие грузы движутся быстрее маленьких. В эксперименте cargo-42 — ДНК-оригами, связавшая 42 стрептавидина — перемещалась дальше, чем cargo-2 за то же время. Cargo-42 разделялась на волны с MinDE более резко, чем маленькие группы стрептавидина (рис. 3а, 3б). Это означало, что белки MinDE на самом деле движут грузами.

Чем больше груз, тем чаще он встречается с движущимися белками. Раз большой объект и двигается быстрее маленьких, значит, MinDE создает движущую силу. Это наблюдение подтвердило версию физиков.

Объяснение

Чтобы понять физику транспорта MinDE, представим реку. Когда поток воды в ней захватывает плот, то несет его с собой. Поток MinDE движет грузами схожим образом.

Активное движение волн MinDE толкает молекулы грузов — так между ними возникает жидкостное трение. За счет этого трения поток белков уносит грузы. Оно же одновременно отделяет грузы от волн белков. MinDE выталкивает грузы в пространство между своими волнами (рис. 4). Когда груз находится внутри волны MinDE, то его толкает много белков, и он движется быстрее грузов, которые отделены от волн MinDE. Так груз изнутри волны «догоняет» волну других грузов. Дальше он движется вместе с волной, потому что всех теперь толкают одинаково. Как результат, белки и грузы разделяются. И в экспериментах их волны выглядят как движущиеся полосы разного цвета.

Волнами белков и грузов движет активная диффузия MinDE, поэтому явление назвали диффузиофорезом. Такой диффузиофорез — сумма двух параллельных процессов: отделение грузов от белков-транспортеров и их общее движение. Исследователи рассматривали альтернативные гипотезы, но ни одна не объясняла особенностей транспорта MinDE (подробнее на рис. 5).

Чем полезен диффузиофорез

Белковая система MinDE пригодится в лабораторной практике. Управляемые белки легко распределят по мембране практически любые молекулы так, как нужно исследователю. Например, если кто-то исследует, как вещество связывается с поверхностью клетки, и нужно поместить его на конкретный участок мембраны. Транспортная система MinDE сыграет роль курьера.

По словам одного из авторов исследования, диффузиофорез настолько прост, что, возможно, стоял у истоков клеточных форм жизни [6]. Тогда не было арсенала биомолекул, между которыми распределены все процессы — физика определяла куда больше вещей, чем сейчас. Что, если диффузиофорез поможет узнать больше о наших самых древних предках?

Загадка ядра

Ядро клетки хранит генетический материал и контролирует работу с ним, поэтому от положения ядра в клетке зависят все важные процессы. Например, движение ядра определяет перемещения клетки, если она мигрирует. Когда один из белков, которые перемещают ядро, ломается, предшественники нейронов в формирующемся мозге эмбриона мигрируют с нарушениями. Структура мозгового вещества изменяется, извилины не формируются, и ребенок рождается с умственной отсталостью. Управляют движениями ядра цитоскелет и специальные белки. В клетках животных положение ядра связано с центриолями, и оно удерживается в центре клетки [3].

Мышиные ооциты, предшественники яйцеклеток, оплодотворяются и делятся реже, когда их ядро уходит из центра клетки [7]. Для ооцитов человека центральное положение ядра также важно [8]. Однако в ооцитах нет центриолей, они исчезают в процессе созревания.

Хоть способа удержать ядро в центре нет, в здоровых ооцитах что-то толкает его к центру. Во второй части статьи мы расскажем об этой силе и о том, почему ядро в центре ооцита так важно.

Центрирование ядра: случайное совпадение

Здоровый ооцит мыши — клетка идеально сферической формы. Форму клеток задает сеть из нитей белка актина, которая лежит под поверхностью клетки (рис. 7). Нити актина постоянно перестраиваются — их собирают специальные белки формины. В процессе формины перемещаются по нитям актина, как по автобанам (подробнее на рис. 6). Движение пузырьков с актином хаотично, но именно оно управляет положением ядра в ооците.

Когда ядро попадает на периферию клетки, то сталкивается там с движением пузырьков актина. Поскольку с внешней части клетки актиновых пузырьков больше и со внутренней меньше, ядро толкают в центр. Суммарно движение создает градиент давления, который смещает ядро в центр ооцита и удерживает там (рис. 7) [10].

Направление движения актинового пузырька по одной нити случайно. В целом его можно назвать хаотичным, то есть активной диффузией. Но сеть актина неоднородна (рис. 6). Поскольку сеть актина плотная по краям клетки, больше всего пузырьков движется там [10].

Воздействие градиента давления подтверждают эксперименты с мышами Fmn2^-/-, у которых нарушена работа формина 2. В их ооцитах актин не собирается в нити, пузырьки с актином не создают градиент давления — и ядро остается на периферии. Зато после инъекции формина 2 за 30 мин. собиралась актиновая сеть и за несколько часов ядро перемещалось в центр ооцита (рис. 9) [10].

Примечательно, что градиент давления актиновых пузырьков — это не специфический механизм для центрирования ядра. Исследователи вводили в ооциты капли масла, сопоставимые по размеру с ядром. В итоге, капли масла перемещались к центру точно так же, как ядро [11]. Так что давление пузырьков актина толкает любой объект. Но для работы ядра оно важно по-особенному.

Зачем ядру быть в центре внимания

Положение ядра в центре связано с формой его оболочки. Когда ядро в центре, с оболочкой все в порядке, потому что пузырьки с актином толкают его со всех сторон одинаково. Взаимодействия оболочки ядра с ДНК регулируют ее работу, и неполадки в оболочке могут нарушить работу с наследственным материалом (рис. 10а, 10б). Это может помешать перепрограммированию ооцита в момент, когда он будет готовиться к делениям после оплодотворения.

В отсутствие сети актина и движения пузырьков по ней форма ядра меняется. На оболочку ядра актин больше не давит, и она деформируется: в ней появляются провалы, инвагинации (рис. 10б). Исследователи этой проблемы показали, что без давления сети актина на оболочку ядра подавляется работа более 200 генов. Среди них ген самого формина 2, белки разных сигнальных путей, активаторы нормального развития зиготы и ее деления [12].

Для чего важно центрирование ядра

По крайней мере, на сотнях ооцитах мышей и человека проверено, что ооциты с ядром центре чаще готовы к оплодотворению и делятся успешнее ооцитов с нарушенным положением ядра [7], [8]. Возможно, репродуктологам стоит обращать внимание на положение ядра в ооците при отборе ооцитов для искусственного оплодотворения.

Заключение

В конце статьи мы неожиданно приходим к тому, что активная диффузия незаметно управляет двумя разными процессами. Она настолько же универсальна, насколько проста. При этом может влиять на важные события в жизни клетки и готова помогать биологам и медикам. Физика управляет даже биомолекулами и всегда готова напомнить о себе.

Литература

1. Beatrice Ramm, Philipp Glock, Jonas Mücksch, Philipp Blumhardt, Daniela A. García-Soriano, et. al.. (2018). The MinDE system is a generic spatial cue for membrane protein distribution in vitro. Nat Commun. 9;
2. Белковые моторы: на службе у человека и нанотехнологий;
3. Clifford P. Brangwynne, Gijsje H. Koenderink, Frederick C. MacKintosh, David A. Weitz. (2009). Intracellular transport by active diffusion. Trends in Cell Biology. 19, 423-427;
4. Gregg G. Gundersen, Howard J. Worman. (2013). Nuclear Positioning. Cell. 152, 1376-1389;
5. Beatrice Ramm, Andriy Goychuk, Alena Khmelinskaia, Philipp Blumhardt, Hiromune Eto, et. al.. (2021). A diffusiophoretic mechanism for ATP-driven transport without motor proteins. Nat. Phys.. 17, 850-858;
6. A novel form of cellular logistics. (2021). Max Planck Institute of Biochemistry.;
7. Stéphane Brunet, Bernard Maro. (2007). Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte. Reproduction. 133, 1069-1072;
8. M. Levi, Y. Ghetler, A. Shulman, R. Shalgi. (2013). Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes. Human Reproduction. 28, 2482-2489;
9. Melissa A. Chesarone, Amy Grace DuPage, Bruce L. Goode. (2010). Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 62-74;
10. Maria Almonacid, Wylie W. Ahmed, Matthias Bussonnier, Philippe Mailly, Timo Betz, et. al.. (2015). Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 17, 470-479;
11. Alexandra Colin, Gaëlle Letort, Nitzan Razin, Maria Almonacid, Wylie Ahmed, et. al.. (2020). Active diffusion in oocytes nonspecifically centers large objects during prophase I and meiosis I. Journal of Cell Biology. 219;
12. Maria Almonacid, Adel Al Jord, Stephany El-Hayek, Alice Othmani, Fanny Coulpier, et. al.. (2019). Active Fluctuations of the Nuclear Envelope Shape the Transcriptional Dynamics in Oocytes. Developmental Cell. 51, 145-157.e10;
13. Steven B. Zimmerman, Stefan O. Trach. (1991). Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 222, 599-620;
14. Yu-Ling Shih, Ling-Ting Huang, Yu-Ming Tu, Bo-Fan Lee, Yu-Chiuan Bau, et. al.. (2019). Active Transport of Membrane Components by Self-Organization of the Min Proteins. Biophysical Journal. 116, 1469-1482.