Биологическая активность лассо-пептидов весьма разнообразна, хотя очень часто их природные функции неясны. Среди них есть пептиды с антибактериальными свойствами (например, микроцин J25 и капиструин), которые ингибируют РНК-полимеразу у грамотрицательных бактерий. Некоторые бактериальные лассо-пептиды могут подавлять репликацию ВИЧ-1 и размножение клеток рака легких человека. В фармакологии лассо-пептиды начинают использовать для получения искусственных пептидов с противораковыми свойствами. Кроме того, лассо-пептиды могут выступать в роли строительных блоков для создания более сложных наноструктур, что делает их привлекательным объектом для нанотехнологии.

Аминокислотные последовательности лассо-пептидов широко варьируют, хотя системы для их биосинтеза очень консервативны. В типичном случае пептид-предшественник превращается в зрелый лассо-пептид под действием трех белков: B1, B2 и C. Еще один белок, D, отвечает за секрецию лассо-пептида во внешнюю среду. Лидерная N-концевая последовательность будущего лассо-пептида распознается белком B1 и отрезается белком B2, обладающим протеазной активностью. Иногда B1 и B2 синтезируются в виде единого полипептида — B. После отрезания лидерной последовательности на N-конце предшественника лассо-пептида остается свободная аминогруппа, которая образует связь со свободной карбоксильной группой кислой аминокислоты (аспартата или глутамата), входящей в состав той же пептидной цепочки (эта реакция катализируется белком C). Белки B и C работают в тесной связи друг с другом и формируют единый комплекс — синтетазу лассо-пептидов. Этот сценарий описывает лишь основные шаги в синтезе лассо-пептидов. Как именно происходят химические превращения, дающие такой необычный продукт, на данный момент неизвестно.

Синтез лассо-пептидов обнаружен у бактерий разных неродственных групп. В частности, у актинобактерии Thermobifida fusca линейный предшественник лассо-пептида кодируется геном tfuA и синтезируется на рибосомах (рис. 1). В тот же оперон, где находится tfuA, входят гены, кодирующие ферменты созревания лассо-пептида — tfuB1, tfuB2 и tfuC, а также ген tfuD, белковый продукт которого отвечает за секрецию лассо-пептида из клетки. Необычная форма лассо-пептида связана с тем, что его N-концевая аминогруппа связана изопептидной связью с боковой карбоксильной группой кислой аминокислоты (аспартата или глутамата), располагающейся в позиции 7–9. Так формируется характерное для лассо-пептидов макролактамное кольцо. Оставшаяся линейная C-концевая часть молекулы проходит через макролактамное кольцо, как нитка через игольное ушко. Благодаря своей необычной структуре лассо-пептиды обладают термостабильностью и устойчивы к протеолизу.

Группа исследователей из Центра наук о жизни (Сколтех) совместно с японскими коллегами детально изучила синтез лассо-пептида фузиллазина (фусканодина) на примере термофильной актинобактерии Thermobifida fusca, получив кристаллическую структуру ее белка B1 (TfuB1) в комплексе с лидерной последовательностью будущего лассо-пептида (TfuA) (рис. 2).

Система синтеза лассо-пептида у T. fusca — одна из самых хорошо охарактеризованных систем такого рода. Ученым удалось экспериментально наблюдать образование лассо-пептида с ее помощью в гетерологичных условиях как in vitro, так и in vivo. Авторы обсуждаемой работы сумели получить в кристаллическом виде комплекс TfuB1 и лидерной последовательностьи TfuA с разрешением в 1,7 ангстрем. Вероятнее всего, TfuB1 функционирует как мономер, хотя после кристаллизации обнаружили некоторое число димеров его комплексов с лидерным пептидом. Возможно, димеры TfuB1 — просто кристаллографический артефакт, однако поверхность взаимодействия двух мономеров в одном димере включает гидрофобные остатки и TfuB1, и TfuA, поэтому, возможно, эти димеры необходимы для взаимодействия с другими компонентами системы биосинтеза лассо-пептидов.

Так как же устроен комплекс TfuB1 и TfuA и на чем основано распознавание лидерной последовательности? Оказалось, что TfuB1 — это однодоменный белок, у которого имеется три N-концевых β-листа (β1–β3) и три концевые α-спирали (α1–α3). TfuA формирует протяженный β-лист, который взаимодействует с третьим (β3) листом TfuB1, образуя единый межмолекулярный антипараллельный β-слой (рис. 2). В собственно распознавании лидерной последовательности участвуют три ее консервативных аминокислотных остатка — тирозин-17 (Tyr-17), пролин-14 (Pro-14) и лейцин-12 (Leu-12).

Tyr-17 окружен гидрофобными остатками спиралей α2 и α3 и соединяющих их петель. Он формирует водородную связь с довольно консервативным остатком аспартата-74 TfuB1, причем, как показали ранние эксперименты на похожих системах других бактерий, замена аспартата на аланин снижает сродство лидерного пептида к TfuB1 в восемь раз. Pro-14 находится на N-конце протяженного β-листа в составе лидерного пептида и вызывает небольшой изгиб его молекулы. Он входит в специальный гидрофобный карман TfuB1, а изгиб в лидерном пептиде, вызванный остатком пролина, дополнительно стабилизируется водородными связями между TfuB1 и лидерным пептидом.

Описанные остатки тирозина и пролина входят в состав консервативного мотива YxxP, который обеспечивает взаимодействие лидерного пептида с белком B1 в других системах синтеза лассо-пептидов. Авторы обсуждаемой работы получили мутантные версии TfuA, в которых Tyr-17 или Pro-14 были заменены на остаток аланина. Такие мутации уменьшали сродство лидерного пептида к TfuB1 более чем в десять раз, что указывает на их критическую роль в распознавании TfuA.

Еще один консервативный остаток, важный для распознавания лидерного пептида, Leu-12, входит в гидрофобную полость между бета-листом β3 и альфа-спиралью α3 TfuB1 и закрепляется там за счет гидрофобных взаимодействий. Замена этого остатка на аланин также более чем в десять раз понизила сродство лидерного пептида к TfuB1. Кроме того, гидрофобные остатки TfuB1, непосредственно взаимодействующие с Leu-12, также отличаются консервативностью, что подчеркивает их важность для распознавания лидерного пептида.

Но взаимодействия между лидерным пептидом и TfuB1 не исчерпываются описанными выше примерами. Как оказалось, между этими молекулами формируется дополнительная сеть водородных связей, сконцентрированная вокруг остатка лизина-20 (Lys-20) TfuA. Таким образом, распознавание лидерного пептида обеспечивается не только гидрофобными, но и электростатическими взаимодействиями.

Как упоминалось выше, лидерный пептид TfuA имеет конформацию, похожую на протяженный β-лист. Он взаимодействует с бета-листом β3, формируя межмолекулярный антипараллельный β-слой (рис. 2). Оказалось, что этот межмолекулярный β-слой представляет собой гидрофобную поверхность, которая и принимает участие в образовании димеров комплексов TfuB1 с лидерным пептидом, появлявшихся при кристаллизации. Однако в водном растворе комплекс TfuB1 с лидерным пептидом существует исключительно в виде мономера. Кроме того, замена на аланин консервативного среди актинобактерий остатка фенилаланина-6 (Phe-6) в составе TfuA, который является одним из ключевых остатков гидрофобной поверхности, практически не сказалась на сродстве лидерного пептида к TfuB1. Да и замена остатков TfuB1, взаимодействующих с Phe-6, почти не сказалась на сродстве двух молекул друг к другу. Так что гидрофобная поверхность, формируемая межмолекулярным β-слоем, не играет роли в распознавании лидерного пептида. Но для чего же она может быть нужна?

Как показали авторы статьи, гидрофобная поверхность комплекса TfuB1 с лидерным пептидом играет роль «посадочной площадки» для еще одного белка созревания лассо-пептида — B2, который отрезает лидерный пептид от молекулы будущего лассо-пептида. Как показало сравнение с другими системами синтеза лассо-пептидов, с TfuB2 взаимодействуют остатки глицина-31 и тирозина-33, которые входят в состав TfuB1 и гидрофобной поверхности его комплекса с лидерным пептидом. Таким образом, формирование межмолекулярного β-слоя может быть необходимо для вступления в игру следующего фермента процессинга пептида — фермента B2.

А что происходит в других системах синтеза лассо-пептидов? Является ли описанный механизм распознавания лидерного пептида если не универсальным, то по крайней мере широко распространенным? Авторы статьи провели моделирование взаимодействия белков-гомологов предшественника лассо-пептида и B1 у совершенно неродственной T. fusca бактерии — Bacillus pseudomycoides из типа фирмикут. Оказалось, что у B. pseudomycoides не только схожий механизм распознавания предшественника лассо-пептида, но и так же сформированная гидрофобная поверхность для посадки белка B2. Более того, для обоих процессов необходимы те же консервативные аминокислотные остатки, что и у T. fusca. Кроме этого, пространственное выравнивание комплекса лидерного пептида с белком B1 T. fusca и аналогичного комплекса бактерии Thermobaculum terrenum из типа Chloroflexi показало близкое сходство их структур. Поэтому можно полагать, что механизм созревания лассо-пептидов и принципиально, и структурно консервативен среди бактерий самых разных, филогенетически далеких друг от друга типов.

Литература

1. Tomomi Sumida, Svetlana Dubiley, Brendan Wilcox, Konstantin Severinov, Shunsuke Tagami. (2019). Structural Basis of Leader Peptide Recognition in Lasso Peptide Biosynthesis Pathway. ACS Chem. Biol.. 14, 1619-1627.