Конкурс «Био/Мол/Текст»-2023/2024

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «Био/Мол/Текст»-2023/2024.

Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.

---

Партнер номинации — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Современное положение дел

Сейчас никого не удивить, если сказать, что злокачественные новообразования различной локализации остаются одной из лидирующих причин смертности во всем мире, из-за чего до сих пор существует острая необходимость в разработке новых эффективных подходов к лечению онкологических заболеваний. Одним из перспективных подходов является адоптивная клеточная иммунотерапия, ведущим направлением которой является CAR-T-терапия. Она заключается во введении антиген-специфических иммунных Т-клеток с искусственно созданной противоопухолевой активностью с целью подавления роста опухоли. Подробный обзор CAR-T-клеточной терапии представлен в сборнике на «Биомолекуле».

«Классическая» CAR-T терапия (рис. 1) заключается в выделении Т-клеток из периферической крови пациента, создании из них модифицированных Т-лимфоцитов с химерным антигенраспознающим рецептором (chimeric antigen receptor, CAR) и обратном введении иммунных клеток в кровь больного.

CAR-T-клетки хорошо себя зарекомендовали в терапии гематологических опухолей. С 2017 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (U.S. Food and Drug Administration, FDA) одобрило шесть CAR-T-клеточных терапий (табл. 1) для лечения рака крови, включая лимфомы, некоторые формы лейкемии и множественную миелому. К примеру, генетически модифицированные Т-клетки, нацеленные на антиген В-лимфоцитов CD19, с исключительным успехом применяются при различных гематологических заболеваниях, не поддающихся терапии [1].

Структура химерного антигенраспознающего рецептора

Сам CAR состоит из нескольких структурных частей — внеклеточной, петлевой, трансмембранной и внутриклеточной (рис. 2) [2]. Более подробное описание строения CAR вы можете найти в статье на «Биомолекуле», посвященной более подробному описанию строения CAR рецептора [3].

• Внеклеточный домен представляет собой рекомбинантный домен, полученный соединением легкой (V_L) и тяжелой (V_H) вариабельной цепей антитела специальным линкером. Именно этой частью химерный рецептор распознает опухоль-ассоциированный антиген.
• Шарнирный, или петлевой домен чаще всего представлен последовательностями CD8α, CD28 или IgG1/IgG4. Он задает размер образующегося синапса с эпитопом, который определяет эффективность запуска каскада фосфорилирования и активации Т-клеток. Таким образом, с помощью модификации петлевого домена можно определять функциональность рецептора CAR [4].
• Вне- и внутриклеточный домены связаны трансмембранным доменом, который в большинстве случаев является трансмембранным рецепторным белком. Выбор трансмембранного домена влияет на передаваемый на внутриклеточный домен активирующий сигнал и на стабильность рецепторного комплекса в целом [5].
• Внутриклеточный домен отличается у разных поколений CAR. В первом поколении домен представлен гликопротеином CD3ζ, во втором — комплексом CD3ζ с костимулирующими доменами, которые способствуют длительному существованию клеток в организме пациента и повышают успех терапии [6]. Примерами CAR новейшего поколения являются Т-клетки, перенаправленные для универсального цитокинового киллинга (T-cells redirected for universal cytokine killing, TRUCKS), которые содержат индукторы цитокинов, усиливающие секрецию интерлейкина 12 (ИЛ 12) Т-клетками. Это увеличивает персистенцию данных клеток (сохранение в функционально активном состоянии) и более высокую противоопухолевую эффективность [7].

Внеклеточный домен окружен большим мультибелковым комплексом, который содержит шесть дополнительных субъединиц: CD3γ, CD3δ, две копии CD3ϵ и две копии ζ-цепи Т-клеточного рецептора. Они участвуют в трансдукции Т-клеточного сигнала, а не в распознавании антигена. Эта передача сигнала обеспечивается фосфорилированием тирозина в цитоплазматических областях, называемых ITAMs (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) в цепях CD3ε, CD3γ, CD3δ и ζ [8].

Проблемы CAR-T-клеточной терапии в лечении солидных опухолей

Внеклеточный сегмент CAR (одноцепочечный вариабельный фрагмент, scFv) не взаимодействует с MHC I класса — главным комплексом гистосовместимости, функция которого заключается в процессинге внутриклеточных или поверхностных белков и презентации антигенных пептидов иммунным клеткам [8]. Ввиду этого CAR-T-клетки распознают антигены, представленные исключительно на поверхности клеток вне комплекса MHC-I.

С одной стороны, это может повысить эффективность терапии, так как многие опухоли снижают уровень экспрессии MHC-I, в результате чего количество главных комплексов гистосовместимости на поверхности раковых клеток сокращается [9]. С другой стороны, в случае солидных опухолей, чьи опухоль-специфические антигены чаще всего внутриклеточные, количество доступных поверхностных антигенов в качестве мишеней CAR-T-клеток ограничено.

Еще одним фактором, который снижает эффективность CAR-T-клеточной терапии, является иммуносупрессивное микроокружение опухоли. Выделяя иммуносупрессивные цитокины, окружающие опухоль клетки препятствуют функционированию иммунных эффекторных клеток, а также подавляют воспалительный Т-клеточный ответ и клеточно-опосредованный иммунитет [10]. В это же время синтезированный микроокружением коллаген создает физический барьер для взаимодействия опухоли с клетками иммунной системы и их инфильтрации.

Не менее важной проблемой является гетерогенность сóлидных опухолей (то есть развивающихся не из клеток кроветворной системы): они неоднородны по генетическому и эпигенетическому статусу, и, что более важно, могут совсем прекратить экспрессию опухолевых антигенов.

Из-за этих проблем сложно подобрать идеальные мишени для каждого пациента так, чтобы терапия работала с одинаковой продуктивностью и уничтожала опухоль полностью. Логическим решением может стать создание CAR-Т-клеток с универсальным антигенраспознающим доменом, специфичность которых относительно легко изменить, используя различные комплементарные к нему метки.

Революционный подход предложили исследователи из Колумбийского университета. Они решили создать универсальные СAR-T-клетки, специфичные к антигену, которого нет в организме, а также прокариотического напарника — специальный штамм бактерий, который будет размножаться только в опухоли и экспрессировать опухоль-ассоциированный антиген, комплементарный к CAR-рецептору, тем самым повышая специфичность CAR-Т-клеток к мишени.

Этап первый. Создание бактерий — хороших напарников для T-клеток

Использование бактерий в терапии опухолей открывает возможности, казавшиеся до этого немыслимыми и недостижимыми при использовании стандартных методов лечения. В отличие от токсичных для нормальных тканей химиотерапии и облучения, определенные штаммы бактерий могут целенаправленно воздействовать на опухоль, активно проникать в ткани; они легко обнаруживаются и являются цитотоксичными для опухоли [11]. Геном прокариот можно легко модифицировать, что позволяет создать из бактерий настоящую маленькую молекулярную фабрику (рис. 3). Она будет выполнять несколько функций:

1. Реагировать на внешние сигналы и свободно перемещаться в пространстве;
2. Нарабатывать терапевтические молекулы, такие как токсины, цитокины, опухолевые антигены и факторы, индуцирующие апоптоз, которые будут селективно токсичны для опухоли;
3. Вырабатывать молекулы, способные маркировать раковые клетки для иммунных клеток.

Углубимся в модель эксперимента ученых из Колумбийского университета [12]. Первым этапом было создание специального штамма бактерий E. coli, способного мигрировать к солидным опухолям, создавать там колонии и продуцировать специальный синтетический антиген — метку (tag) для CAR-T-клеток.

В геном бактерий была встроена система синхронизированного лизиса (synchronized lysis circuit, SLIC) [13], позволяющая этим бактериям расти в нише солидной опухоли до критического уровня. Затем запускаются события лизиса бактериальных клеток, в ходе которого циклически высвобождаются in situ генетически закодированные антигены и хемокины, необходимые для направленного хемотаксиса CAR-T-клеток.

Также еще одной вставкой в ДНК бактерий стал мутантный ген человеческого хемокина CXCL16_K42A (CXCL16) для повышенная инфильтрации и рекрутирования CXCR16+ CAR-T клеток непосредственно к месту опухоли.

Авторы статьи разработали внеклеточный белок, который может «помечать» компоненты иммуносупрессивного микроокружения опухоли для CAR-опосредованного лизиса. Этот белок был получен путем слияния (рис. 4) гомодимера суперскрученного зеленого флуоресцирующего белка (superfolder green fluorescent protein, disfGFP) с гепаринсвязывающим доменом (heparin-binding domain, HBD) фактора роста плаценты-2 (PlGF-2123-144), прочно связывающимся с элементами внеклеточного матрикса (коллагеном, фибронектином и гепарансульфатными протеогликанами) [14], которые в большом количестве присутствуют в солидных опухолях и в плотном внеклеточном матриксе ее стромы.

Таким образом, размножаясь только в клетках опухоли и ее микроокружения, в ходе лизиса бактерии высвобождают антигены-метки, которые маркируют только область опухоли (рис. 5). Так как PIGF-часть химерного белка сразу связывается с элементами внеклеточного матрикса опухоли, то она ограничивает дальнейшую диффузию «меток» за пределы плотной стромы опухоли и повышает безопасность для здоровых тканей пациента. Также PIGF-часть белка способствует поляризации CAR на поверхности Т-клеток, что приводит к большей противоопухолевой активности CAR-T-клеток.

Этап второй. Создание направляющих бактериями ProCAR-T-клеток

Далее исследователи создали GFP-специфичный CAR (рис. 6) [15]. Данный химерный рецептор состоит из sfGFP-связывающей последовательности антитела, соединенной с внутриклеточными сигнальными доменами CD28 и CD3ζ короткой петлей иммуноглобулина G4 (IgG4) для коэкспрессии с репортером mScarlet. Он позволяет контролировать эффективность трансдукции человеческих Т-клеток и подтвердить экспрессию CAR на поверхности T-клеток путем связывания рецептора CAR с метками.

После разработки бактерий и CAR-T-клеток исследователям предстояло оценить эффективность всей системы ProCAR (от probiotic-guided) с помощью функциональных тестов. Во-первых, с помощью измерения экспрессии маркеров активации — CD25 (рис. 7) и CD69, выяснили, что GFP-CAR-T-клетки активировались и пролиферировали при взаимодействии с меткой и с гомодимером sfGFP (diGFP), однако модифицированные Т-клетки оставались неизменными при воздействии мономерного sfGFP.

Также при инкубации семи генетически различных линий раковых клеток человека с GFP-CAR-T-клетками ученые обнаружили дозозависимую цитотоксичность модифицированных Т-клеток по отношению к клеткам с коллагенсвязывающими метками и их толерантность к клеткам, покрытым растворимыми димерами sfGFP. В ответ на взаимодействие с меткой CAR-T-клетки вырабатывали в основном перфорины и гранзимы А и В, которые вызывают последующий лизис помеченных клеток.

В результате только поверхностно-связанные метки действительно могут способствовать образованию иммунологических синапсов между CAR-T-клетками и клеткой-мишенью и вызывать цитотоксический Т-клеточный ответ (рис. 8). Помимо этого, было показано, что конструкция меток универсальна, т.е. она пригодна для терапии разных видов рака.

Эти многообещающие результаты позволили ученым перейти к следующему шагу — к экспериментам на модели ксенографтов опухолей человека. Они использовали линию иммунодефицитных мышей с диабетом без ожирения, вводя им подкожно опухолевые клетки различных типов рака человека. После достижения оптимального объема опухоли мышам вводили в опухолевую ткань штамм бактерий E. coli с системой синхронизированного лизиса, продуцирующий или diGFP (EcN-SLIC-Pro-diGFP), или Tag (EcN-SLIC-Pro-Tag), или контрольный штамм, не производящий никаких антигенов (EcN-SLIC-Pro -). Через фиксированное время после обработки бактериями вводили ProCAR-T-клетки, далее оценивали изменение размеров опухоли, строили кривую выживания и проверяли локализацию продуцируемых бактериальных антигенов в крови и опухоли (рис. 9).

ProCAR-T-клетки в сочетании с Pro-diGFP не продемонстрировали заметной терапевтической эффективности и не замедлили рост опухоли по сравнению с опухолями, обработанными контрольными Pro-штаммами (рис. 10 б, в). Штаммы Pro-Tag, напротив, вызывали мощный противоопухолевый ответ, что привело к значительному замедлению роста опухоли и, соответственно, улучшению выживаемости. Кроме того, ученые не обнаружили рост бактерий вне гомогенатов опухоли на 3-й и 14-й день после обработки бактериями. Отсутствие содержания меток в крови, по сравнению с diGFP, может говорить об отсутствии распространения антигена в здоровые ткани и в кровяное русло благодаря конструкции меток.

Заключение

Модели ксенографта различных опухолей показали многообещающие результаты двухэтапного лечения с помощью ProCAR, что подтверждает эффективность комплексной терапии солидных опухолей бактериями с CAR-T-клетками. Исследование в корне меняет подход к таргетной иммунотерапии: теперь вместо подбора мишени для каждого пациента по фенотипу их опухоли можно создать ProCAR-систему, в которой бактерии будут продуцировать в опухоли антиген, отсутствующий в здоровой ткани. Это открывает широкое поле для исследований и создания ускоренных программ лечения для самых разных типов рака.

Литература

1. Marcela V. Maus, Stephan A. Grupp, David L. Porter, Carl H. June. (2014). Antibody-modified T cells: CARs take the front seat for hematologic malignancies. Blood. 123, 2625-2635;
2. Hilde Almåsbak, Tanja Aarvak, Mohan C. Vemuri. (2016). CAR T Cell Therapy: A Game Changer in Cancer Treatment. Journal of Immunology Research. 2016, 1-10;
3. Способны ли CAR-Т-клетки уничтожить опухоль?;
4. Кулемзин С.В., Кузнецова В.В., Мамонкин М., Таранин А.В., Горчаков А.А. (2017). Основы дизайна химерных антигенных рецепторов. Acta Naturae (русскоязычная версия). 32, 6–15;
5. Sonia Guedan, Avery D. Posey, Carolyn Shaw, Anna Wing, Tong Da, et. al.. (2018). Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation. JCI Insight. 3;
6. Jaromir Tomasik, Marcin Jasiński, Grzegorz W. Basak. (2022). Next generations of CAR-T cells - new therapeutic opportunities in hematology?. Front. Immunol.. 13;
7. Mythili Koneru, Terence J. Purdon, David Spriggs, Susmith Koneru, Renier J. Brentjens. (2015). IL-12 secreting tumor-targeted chimeric antigen receptor T cells eradicate ovarian tumorsin vivo. OncoImmunology. 4, e994446;
8. Murphy K., Weaver C., Berg L. Janeway’s immunology (Tenth Edition). W. W. Norton & Company, Inc., 2022. P. 672–728;
9. Gianpietro Dotti, Stephen Gottschalk, Barbara Savoldo, Malcolm K. Brenner. (2014). Design and development of therapies using chimeric antigen receptor‐expressing T cells. Immunological Reviews. 257, 107-126;
10. Jiali Cheng, Lei Zhao, Yuanyuan Zhang, Yun Qin, Yuqi Guan, et. al.. (2019). Understanding the Mechanisms of Resistance to CAR T-Cell Therapy in Malignancies. Front. Oncol.. 9;
11. Neil S. Forbes. (2010). Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat Rev Cancer. 10, 785-794;
12. Rosa L. Vincent, Candice R. Gurbatri, Fangda Li, Ana Vardoshvili, Courtney Coker, et. al.. (2023). Probiotic-guided CAR-T cells for solid tumor targeting. Science. 382, 211-218;
13. M. Omar Din, Tal Danino, Arthur Prindle, Matt Skalak, Jangir Selimkhanov, et. al.. (2016). Synchronized cycles of bacterial lysis for in vivo delivery. Nature. 536, 81-85;
14. Mikaël M. Martino, Priscilla S. Briquez, Esra Güç, Federico Tortelli, Witold W. Kilarski, et. al.. (2014). Growth Factors Engineered for Super-Affinity to the Extracellular Matrix Enhance Tissue Healing. Science. 343, 885-888;
15. Eric M. Bressler, Wilson W. Wong. (2023). Engineered bacteria guide T cells to tumors. Science. 382, 154-155.