https://biolabmix.ru/catalog/rna-transcription-mrna/?erid=LdtCKWnpq
Подписаться
Оглавление
Биомолекула

Прокариотический напарник для CAR-T-клеточной терапии

Прокариотический напарник для CAR-T-клеточной терапии

  • 178
  • 0,1
  • 0
  • 0
Добавить в избранное print
Обзор

Прокариотический напарник помогает направить CAR-T-клетки для уничтожения опухолевых клеток.

Рисунок в полном размере.

рисунок автора статьи

Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: CAR-T-клеточная терапия уже вошла в историю как эффективный и высокоспецифичный подход к лечению онкологических заболеваний. Однако, несмотря на впечатляющие результаты в случаях лечения гематологических опухолей, остается много проблем в CAR-T терапии злокачественных новообразований, которые развились не из клеток кроветворной системы. А что будет, если иммунным клеткам взять прокариотического напарника в качестве штурмана, который будет «отдавать приказ», куда CAR-T-клеткам бежать и кого уничтожать? Таким вопросом задалась исследовательская группа из Колумбийского университета и создала революционный двухэтапный подход в CAR-T-клеточной терапии, получивший название ProCAR (probiotic-guided), который расширяет возможности персонализированного лечения.

Конкурс «Био/Мол/Текст»-2023/2024

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «Био/Мол/Текст»-2023/2024.

BIOCAD

Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.


SkyGen

Партнер номинации — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.


«Альпина нон-фикшн»

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Современное положение дел

Сейчас никого не удивить, если сказать, что злокачественные новообразования различной локализации остаются одной из лидирующих причин смертности во всем мире, из-за чего до сих пор существует острая необходимость в разработке новых эффективных подходов к лечению онкологических заболеваний. Одним из перспективных подходов является адоптивная клеточная иммунотерапия, ведущим направлением которой является CAR-T-терапия. Она заключается во введении антиген-специфических иммунных Т-клеток с искусственно созданной противоопухолевой активностью с целью подавления роста опухоли. Подробный обзор CAR-T-клеточной терапии представлен в сборнике на «Биомолекуле».

«Классическая» CAR-T терапия (рис. 1) заключается в выделении Т-клеток из периферической крови пациента, создании из них модифицированных Т-лимфоцитов с химерным антигенраспознающим рецептором (chimeric antigen receptor, CAR) и обратном введении иммунных клеток в кровь больного.

Общая схема иммунотерапии модифицированными лимфоцитами

Рисунок 1. Общая схема иммунотерапии модифицированными лимфоцитами. На схеме изображены основные этапы CAR-T-клеточной терапии:
1) забор периферической крови пациента и выделение Т-клеток;
2) активация лимфоцитов и их трансдукция ретровирусным или лентивирусным вектором с геном рецептора CAR против эпитопа опухоль-ассоциированного антигена;
3) размножение модифицированных T-клеток;
4) инфузия модифицированных лимфоцитов в организм пациента.

рисунок автора

CAR-T-клетки хорошо себя зарекомендовали в терапии гематологических опухолей. С 2017 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (U.S. Food and Drug Administration, FDA) одобрило шесть CAR-T-клеточных терапий (табл. 1) для лечения рака крови, включая лимфомы, некоторые формы лейкемии и множественную миелому. К примеру, генетически модифицированные Т-клетки, нацеленные на антиген В-лимфоцитов CD19, с исключительным успехом применяются при различных гематологических заболеваниях, не поддающихся терапии [1].

Таблица 1. Список CAR-T-клеточных терапий для лечения рака крови, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.
Название препарата Имя бренда Мишень Заболевания
Тисагенлеклеусел Kymriah CD19
  • В-клеточный острый лимфобластный лейкоз
  • В-клеточная неходжкинская лимфома
Аксикабтаген цилолеусел Yescarta CD19
  • В-клеточная неходжкинская лимфома
  • Фолликулярная лимфома
Брексукабтаген аутолеусел Tecartus CD19
  • Лимфома мантийной зоны
  • В-клеточный острый лимфобластный лейкоз
Лисокабтаген маралеусел Breyanzi CD19 В-клеточная неходжкинская лимфома
Идекабтаген виклеусел Abecma BCMA Множественная миелома
Цильтакабтаген аутолеусел Carvykti BCMA Множественная миелома

Структура химерного антигенраспознающего рецептора

Сам CAR состоит из нескольких структурных частей — внеклеточной, петлевой, трансмембранной и внутриклеточной (рис. 2) [2]. Более подробное описание строения CAR вы можете найти в статье на «Биомолекуле», посвященной более подробному описанию строения CAR рецептора [3].

  • Внеклеточный домен представляет собой рекомбинантный домен, полученный соединением легкой (VL) и тяжелой (VH) вариабельной цепей антитела специальным линкером. Именно этой частью химерный рецептор распознает опухоль-ассоциированный антиген.
  • Шарнирный, или петлевой домен чаще всего представлен последовательностями CD8α, CD28 или IgG1/IgG4. Он задает размер образующегося синапса с эпитопом, который определяет эффективность запуска каскада фосфорилирования и активации Т-клеток. Таким образом, с помощью модификации петлевого домена можно определять функциональность рецептора CAR [4].
  • Вне- и внутриклеточный домены связаны трансмембранным доменом, который в большинстве случаев является трансмембранным рецепторным белком. Выбор трансмембранного домена влияет на передаваемый на внутриклеточный домен активирующий сигнал и на стабильность рецепторного комплекса в целом [5].
  • Внутриклеточный домен отличается у разных поколений CAR. В первом поколении домен представлен гликопротеином CD3ζ, во втором — комплексом CD3ζ с костимулирующими доменами, которые способствуют длительному существованию клеток в организме пациента и повышают успех терапии [6]. Примерами CAR новейшего поколения являются Т-клетки, перенаправленные для универсального цитокинового киллинга (T-cells redirected for universal cytokine killing, TRUCKS), которые содержат индукторы цитокинов, усиливающие секрецию интерлейкина 12 (ИЛ 12) Т-клетками. Это увеличивает персистенцию данных клеток (сохранение в функционально активном состоянии) и более высокую противоопухолевую эффективность [7].

Внеклеточный домен окружен большим мультибелковым комплексом, который содержит шесть дополнительных субъединиц: CD3γ, CD3δ, две копии CD3ϵ и две копии ζ-цепи Т-клеточного рецептора. Они участвуют в трансдукции Т-клеточного сигнала, а не в распознавании антигена. Эта передача сигнала обеспечивается фосфорилированием тирозина в цитоплазматических областях, называемых ITAMs (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) в цепях CD3ε, CD3γ, CD3δ и ζ [8].

 Схема строения химерного антигенраспознающего рецептора (CAR) и функции каждого домена

Рисунок 2. Схема строения химерного антигенраспознающего рецептора (CAR) и функции каждого домена.

[2]

Проблемы CAR-T-клеточной терапии в лечении солидных опухолей

Внеклеточный сегмент CAR (одноцепочечный вариабельный фрагмент, scFv) не взаимодействует с MHC I класса — главным комплексом гистосовместимости, функция которого заключается в процессинге внутриклеточных или поверхностных белков и презентации антигенных пептидов иммунным клеткам [8]. Ввиду этого CAR-T-клетки распознают антигены, представленные исключительно на поверхности клеток вне комплекса MHC-I.

С одной стороны, это может повысить эффективность терапии, так как многие опухоли снижают уровень экспрессии MHC-I, в результате чего количество главных комплексов гистосовместимости на поверхности раковых клеток сокращается [9]. С другой стороны, в случае солидных опухолей, чьи опухоль-специфические антигены чаще всего внутриклеточные, количество доступных поверхностных антигенов в качестве мишеней CAR-T-клеток ограничено.

Еще одним фактором, который снижает эффективность CAR-T-клеточной терапии, является иммуносупрессивное микроокружение опухоли. Выделяя иммуносупрессивные цитокины, окружающие опухоль клетки препятствуют функционированию иммунных эффекторных клеток, а также подавляют воспалительный Т-клеточный ответ и клеточно-опосредованный иммунитет [10]. В это же время синтезированный микроокружением коллаген создает физический барьер для взаимодействия опухоли с клетками иммунной системы и их инфильтрации.

Не менее важной проблемой является гетерогенность сóлидных опухолей (то есть развивающихся не из клеток кроветворной системы): они неоднородны по генетическому и эпигенетическому статусу, и, что более важно, могут совсем прекратить экспрессию опухолевых антигенов.

Из-за этих проблем сложно подобрать идеальные мишени для каждого пациента так, чтобы терапия работала с одинаковой продуктивностью и уничтожала опухоль полностью. Логическим решением может стать создание CAR-Т-клеток с универсальным антигенраспознающим доменом, специфичность которых относительно легко изменить, используя различные комплементарные к нему метки.

Революционный подход предложили исследователи из Колумбийского университета. Они решили создать универсальные СAR-T-клетки, специфичные к антигену, которого нет в организме, а также прокариотического напарника — специальный штамм бактерий, который будет размножаться только в опухоли и экспрессировать опухоль-ассоциированный антиген, комплементарный к CAR-рецептору, тем самым повышая специфичность CAR-Т-клеток к мишени.

Этап первый. Создание бактерий — хороших напарников для T-клеток

Использование бактерий в терапии опухолей открывает возможности, казавшиеся до этого немыслимыми и недостижимыми при использовании стандартных методов лечения. В отличие от токсичных для нормальных тканей химиотерапии и облучения, определенные штаммы бактерий могут целенаправленно воздействовать на опухоль, активно проникать в ткани; они легко обнаруживаются и являются цитотоксичными для опухоли [11]. Геном прокариот можно легко модифицировать, что позволяет создать из бактерий настоящую маленькую молекулярную фабрику (рис. 3). Она будет выполнять несколько функций:

  1. Реагировать на внешние сигналы и свободно перемещаться в пространстве;
  2. Нарабатывать терапевтические молекулы, такие как токсины, цитокины, опухолевые антигены и факторы, индуцирующие апоптоз, которые будут селективно токсичны для опухоли;
  3. Вырабатывать молекулы, способные маркировать раковые клетки для иммунных клеток.
Бактерии как фабрики для лечения рака

Рисунок 3. Бактерии как фабрики для лечения рака. Слева на рисунке представлена модель молекулярной фабрики для терапии онкологических заболеваний, справа — ее реализация в виде бактериальной клетки.

Углубимся в модель эксперимента ученых из Колумбийского университета [12]. Первым этапом было создание специального штамма бактерий E. coli, способного мигрировать к солидным опухолям, создавать там колонии и продуцировать специальный синтетический антиген — метку (tag) для CAR-T-клеток.

Строение метки Tag

Рисунок 4. Строение метки Tag, состоящей из гомодимера суперскрученного зеленого флуоресцирующего белка sfGFP и гепаринсвязывающего домена HBD фактора роста плаценты-2 (PlGF-2123-144), соединенных линкером. PIGF-часть прочно связывается с элементами внеклеточного матрикса — с коллагеном и гепарансульфатными протеогликанами, тем самым заякоривывается в межклеточном матриксе опухоли, а sfGFP-часть связывается с CAR (GFP28z).

В геном бактерий была встроена система синхронизированного лизиса (synchronized lysis circuit, SLIC) [13], позволяющая этим бактериям расти в нише солидной опухоли до критического уровня. Затем запускаются события лизиса бактериальных клеток, в ходе которого циклически высвобождаются in situ генетически закодированные антигены и хемокины, необходимые для направленного хемотаксиса CAR-T-клеток.

Также еще одной вставкой в ДНК бактерий стал мутантный ген человеческого хемокина CXCL16K42A (CXCL16) для повышенная инфильтрации и рекрутирования CXCR16+ CAR-T клеток непосредственно к месту опухоли.

Авторы статьи разработали внеклеточный белок, который может «помечать» компоненты иммуносупрессивного микроокружения опухоли для CAR-опосредованного лизиса. Этот белок был получен путем слияния (рис. 4) гомодимера суперскрученного зеленого флуоресцирующего белка (superfolder green fluorescent protein, disfGFP) с гепаринсвязывающим доменом (heparin-binding domain, HBD) фактора роста плаценты-2 (PlGF-2123-144), прочно связывающимся с элементами внеклеточного матрикса (коллагеном, фибронектином и гепарансульфатными протеогликанами) [14], которые в большом количестве присутствуют в солидных опухолях и в плотном внеклеточном матриксе ее стромы.

Таким образом, размножаясь только в клетках опухоли и ее микроокружения, в ходе лизиса бактерии высвобождают антигены-метки, которые маркируют только область опухоли (рис. 5). Так как PIGF-часть химерного белка сразу связывается с элементами внеклеточного матрикса опухоли, то она ограничивает дальнейшую диффузию «меток» за пределы плотной стромы опухоли и повышает безопасность для здоровых тканей пациента. Также PIGF-часть белка способствует поляризации CAR на поверхности Т-клеток, что приводит к большей противоопухолевой активности CAR-T-клеток.

Схема ProCAR

Рисунок 5. Схема ProCAR. Синтетические метки для CAR-T-клеток производятся и высвобождаются in situ колонизирующими опухоль бактериями (E. coli), маркируют компоненты солидных опухолей и вызывают CAR-опосредованный лизис. Метки представлены в виде димеров sfGFP, соединенных с HBD (PlGF123-144), которые широко связываются с клеточной поверхностью опухолевых клеток и внеклеточным матриксом микроокружения опухоли.

Этап второй. Создание направляющих бактериями ProCAR-T-клеток

Далее исследователи создали GFP-специфичный CAR (рис. 6) [15]. Данный химерный рецептор состоит из sfGFP-связывающей последовательности антитела, соединенной с внутриклеточными сигнальными доменами CD28 и CD3ζ короткой петлей иммуноглобулина G4 (IgG4) для коэкспрессии с репортером mScarlet. Он позволяет контролировать эффективность трансдукции человеческих Т-клеток и подтвердить экспрессию CAR на поверхности T-клеток путем связывания рецептора CAR с метками.

Схема генетической конструкции, которой трансдуцировали Т-клетки пациента с помощью вирусного вектора

Рисунок 6. Схема генетической конструкции, которой трансдуцировали Т-клетки пациента с помощью вирусного вектора. GFPnb — sfGFP-связывающая последовательность антитела, CD28 и CD3ζ — сигнальные домены, IgG4 — петля иммуноглобулина G4, связывающая внеклеточный и внутриклеточный домен CAR, mScarlet — репортерный ген для контроля эффективности трансдукции.

После разработки бактерий и CAR-T-клеток исследователям предстояло оценить эффективность всей системы ProCAR (от probiotic-guided) с помощью функциональных тестов. Во-первых, с помощью измерения экспрессии маркеров активации — CD25 (рис. 7) и CD69, выяснили, что GFP-CAR-T-клетки активировались и пролиферировали при взаимодействии с меткой и с гомодимером sfGFP (diGFP), однако модифицированные Т-клетки оставались неизменными при воздействии мономерного sfGFP.

Количественная оценка экспрессии CD25 на поверхности.

Рисунок 7. Количественная оценка экспрессии CD25 на поверхности. GFP — мономерный sfGFP, diGFP — растворимый гомодимер sfGFP, Tag — связанный с коллагеном GFP. Повышение экспрессии CD25 показана относительно клеток MDA-MB-468, экспрессирующих mbGFP — форму sfGFP, связанного с мембранной в соотношении 1:1. MFI — средняя интенсивность флуоресценции.

[8]

Также при инкубации семи генетически различных линий раковых клеток человека с GFP-CAR-T-клетками ученые обнаружили дозозависимую цитотоксичность модифицированных Т-клеток по отношению к клеткам с коллагенсвязывающими метками и их толерантность к клеткам, покрытым растворимыми димерами sfGFP. В ответ на взаимодействие с меткой CAR-T-клетки вырабатывали в основном перфорины и гранзимы А и В, которые вызывают последующий лизис помеченных клеток.

В результате только поверхностно-связанные метки действительно могут способствовать образованию иммунологических синапсов между CAR-T-клетками и клеткой-мишенью и вызывать цитотоксический Т-клеточный ответ (рис. 8). Помимо этого, было показано, что конструкция меток универсальна, т.е. она пригодна для терапии разных видов рака.

Только поверхностно-связанные метки действительно могут способствовать образованию синапсов

Рисунок 8. Только поверхностно-связанные метки действительно могут способствовать образованию синапсов между CAR и клеткой-мишенью, в отличие от diGFP белков, которые вовсе не связываются с поверхностью покоящихся или активированных Т-клеток.

рисунок автора

Эти многообещающие результаты позволили ученым перейти к следующему шагу — к экспериментам на модели ксенографтов опухолей человека. Они использовали линию иммунодефицитных мышей с диабетом без ожирения, вводя им подкожно опухолевые клетки различных типов рака человека. После достижения оптимального объема опухоли мышам вводили в опухолевую ткань штамм бактерий E. coli с системой синхронизированного лизиса, продуцирующий или diGFP (EcN-SLIC-Pro-diGFP), или Tag (EcN-SLIC-Pro-Tag), или контрольный штамм, не производящий никаких антигенов (EcN-SLIC-Pro -). Через фиксированное время после обработки бактериями вводили ProCAR-T-клетки, далее оценивали изменение размеров опухоли, строили кривую выживания и проверяли локализацию продуцируемых бактериальных антигенов в крови и опухоли (рис. 9).

ProCAR-T-клетки в сочетании с Pro-diGFP не продемонстрировали заметной терапевтической эффективности и не замедлили рост опухоли по сравнению с опухолями, обработанными контрольными Pro-штаммами (рис. 10 б, в). Штаммы Pro-Tag, напротив, вызывали мощный противоопухолевый ответ, что привело к значительному замедлению роста опухоли и, соответственно, улучшению выживаемости. Кроме того, ученые не обнаружили рост бактерий вне гомогенатов опухоли на 3-й и 14-й день после обработки бактериями. Отсутствие содержания меток в крови, по сравнению с diGFP, может говорить об отсутствии распространения антигена в здоровые ткани и в кровяное русло благодаря конструкции меток.

ProCAR-T-клетки

Рисунок 9. ProCAR-T-клетки обеспечивают антигенно-диагностическую терапевтическую эффективность в ответ на коллаген-связанные метки (Tags) и бактериальные адъюванты, предоставляемые пробиотиками in situ.

(а) — схема эксперимента;
(б) — график средних траекторий опухолей;
(в) кривые выживания;
(г) — данные иммуноферментного анализа на оценку содержания sfGFP (антигена, продуцируемого бактериями) в опухоли и сыворотке крови.

Заключение

Модели ксенографта различных опухолей показали многообещающие результаты двухэтапного лечения с помощью ProCAR, что подтверждает эффективность комплексной терапии солидных опухолей бактериями с CAR-T-клетками. Исследование в корне меняет подход к таргетной иммунотерапии: теперь вместо подбора мишени для каждого пациента по фенотипу их опухоли можно создать ProCAR-систему, в которой бактерии будут продуцировать в опухоли антиген, отсутствующий в здоровой ткани. Это открывает широкое поле для исследований и создания ускоренных программ лечения для самых разных типов рака.

Литература

  1. Marcela V. Maus, Stephan A. Grupp, David L. Porter, Carl H. June. (2014). Antibody-modified T cells: CARs take the front seat for hematologic malignancies. Blood. 123, 2625-2635;
  2. Hilde Almåsbak, Tanja Aarvak, Mohan C. Vemuri. (2016). CAR T Cell Therapy: A Game Changer in Cancer Treatment. Journal of Immunology Research. 2016, 1-10;
  3. Способны ли CAR-Т-клетки уничтожить опухоль?;
  4. Кулемзин С.В., Кузнецова В.В., Мамонкин М., Таранин А.В., Горчаков А.А. (2017). Основы дизайна химерных антигенных рецепторов. Acta Naturae (русскоязычная версия). 32, 6–15;
  5. Sonia Guedan, Avery D. Posey, Carolyn Shaw, Anna Wing, Tong Da, et. al.. (2018). Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation. JCI Insight. 3;
  6. Jaromir Tomasik, Marcin Jasiński, Grzegorz W. Basak. (2022). Next generations of CAR-T cells - new therapeutic opportunities in hematology?. Front. Immunol.. 13;
  7. Mythili Koneru, Terence J. Purdon, David Spriggs, Susmith Koneru, Renier J. Brentjens. (2015). IL-12 secreting tumor-targeted chimeric antigen receptor T cells eradicate ovarian tumorsin vivo. OncoImmunology. 4, e994446;
  8. Murphy K., Weaver C., Berg L. Janeway’s immunology (Tenth Edition). W. W. Norton & Company, Inc., 2022. P. 672–728;
  9. Gianpietro Dotti, Stephen Gottschalk, Barbara Savoldo, Malcolm K. Brenner. (2014). Design and development of therapies using chimeric antigen receptor‐expressing T cells. Immunological Reviews. 257, 107-126;
  10. Jiali Cheng, Lei Zhao, Yuanyuan Zhang, Yun Qin, Yuqi Guan, et. al.. (2019). Understanding the Mechanisms of Resistance to CAR T-Cell Therapy in Malignancies. Front. Oncol.. 9;
  11. Neil S. Forbes. (2010). Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat Rev Cancer. 10, 785-794;
  12. Rosa L. Vincent, Candice R. Gurbatri, Fangda Li, Ana Vardoshvili, Courtney Coker, et. al.. (2023). Probiotic-guided CAR-T cells for solid tumor targeting. Science. 382, 211-218;
  13. M. Omar Din, Tal Danino, Arthur Prindle, Matt Skalak, Jangir Selimkhanov, et. al.. (2016). Synchronized cycles of bacterial lysis for in vivo delivery. Nature. 536, 81-85;
  14. Mikaël M. Martino, Priscilla S. Briquez, Esra Güç, Federico Tortelli, Witold W. Kilarski, et. al.. (2014). Growth Factors Engineered for Super-Affinity to the Extracellular Matrix Enhance Tissue Healing. Science. 343, 885-888;
  15. Eric M. Bressler, Wilson W. Wong. (2023). Engineered bacteria guide T cells to tumors. Science. 382, 154-155.

Комментарии