Перед тем как поделиться, клетке нужно дублировать свой генетический материал. Процесс удвоения молекул ДНК называется репликацией. Репликация осуществляется и регулируется многими белками. Она должна быть максимально точной, чтобы избежать появления мутаций в ДНК. Механизм удвоения генетического материала у прокариот и эукариот полуконсервативный. То есть после репликации одной двуцепочечной молекулы ДНК получаются две, в каждой из которых одна цепь будет старой (материнской), а другая новой (дочерней) [1]. Образовавшиеся молекулы ДНК почти идентичные. Но их минорные отличия могут играть важную роль в судьбе организма [2, 3].

Немного о ДНК-полимеразах

Ключевыми белками репликации являются ДНК-полимеразы — ферменты, читающие цепочку нуклеотидов и использующие ее как матрицу для синтеза дочерней молекулы ДНК. Важно отметить, что ДНК-полимеразы могут присоединять новый нуклеотид только к предыдущему, потому им всегда нужна «затравка» (праймер). Такие затравки во время репликации синтезирует другой фермент — праймаза. Издержки такого разделения труда заключаются в том, что первым компонентом дочерней цепи становятся рибонуклеотиды, то есть короткие цепочки РНК. К ним полимераза уже может присоединить дезоксирибонуклеотиды. Это делает ДНК-полимераза α. Она удлиняет РНК-затравку, синтезируя небольшую цепочку ДНК (примерно 20 нуклеотидов). Так как репликация должна быть очень точной, то неудивительно, что некоторые ДНК-полимеразы умеют исправлять ошибки своей работы. В первую очередь это касается ферментов, синтезирующих длинные участки цепей. Полимераза α такой редактирующей способностью не обладает, поэтому включает новые нуклеотиды, не «оглядываясь» назад и оставляя много ошибок.

Каждая цепь ДНК имеет направление: у нее есть 3’- и 5’-концы. Важно отметить, что новая молекула ДНК может удлиняться только в одну сторону, так как ДНК-полимеразы умеют добавлять нуклеотиды только к 3’-концу. В начале репликации две цепи материнской ДНК расплетаются в определенном месте, и на их матрицах строятся дочерние цепи в двух направлениях. В одну сторону синтез идет непрерывно, а в другую — с помощью коротких фрагментов, как показано на рисунке 1. Такой механизм обеспечивает удлинение дочерних цепей только от 5’-конца к 3’-концу [4, 5]. Цепь, синтез которой идет короткими фрагментами — фрагментами Оказаки, называется отстающей.

У эукариот синтез всего фрагмента Оказаки от уже продленной полимеразой α затравки осуществляет полимераза δ. Она очень точная и умеет исправлять свои ошибки. Получается, что в начале каждого фрагмента Оказаки есть небольшой фрагмент РНК и участок, синтезированный «малограмотной» полимеразой α. Всё это нужно удалить и застроить заново полимеразой δ, так как ни РНК, ни ошибок в дочерней цепи быть не должно (рис. 2). Поле такого редактирования фрагменты Оказаки сшиваются ДНК-лигазой, образуя непрерывную цепь [6, 7]. Но, несмотря на исправление ошибок, некоторые из них все-таки остаются, и возникают мутации.

Возможный механизм сохранения мутаций после репликации

Показано, что мутации в геноме происходят неравномерно [8]. Их распределение зависит от многих факторов, в том числе и от деятельности ДНК-связывающих белков. Авторы недавнего исследования сопоставили распределение мутаций в геноме и участков «стыка» фрагментов Оказаки (рис. 3а). Получилось, что на центр нуклеосомной ДНК приходится как пик мутаций, так и максимальное количество концов фрагментов Оказаки [9].

Такая корреляция была обнаружена и в зонах связывания транскрипционных факторов (рис. 3b). Правда, непосредственно специфические сайты посадки белков мутируют редко. Это, видимо, связано с давлением отбора: если сайт связывания транскрипционного фактора будет поврежден, то может сбиться регуляция важных процессов, что в свою очередь с высокой вероятностью приведет к гибели клетки.

Синтез фрагментов Оказаки имеет направление. Если мутации связаны с этим процессом, то их распределение тоже должно иметь направление. Выявили, что количество мутаций резко возрастает сразу после окончания фрагмента Оказаки. Особенно в местах связывания белков, служащих барьером для полимеразы δ [10].

Авторы показали, что совпадение мест стыка фрагментов Оказаки и повышенного уровня мутаций является следствием именно того, что в этих участках с ДНК связываются белки. Последовательности ДНК в таких регионах всегда разные, поэтому не имеют прямого отношения к наблюдаемой закономерности.

Как было сказано выше, фрагменты Оказаки синтезируются полимеразами α и δ. Ранее полагали, что в ходе этого процесса большинство нуклеотидов (если не все), синтезированных полимеразой α, удаляются [11, 12]. Это было бы полезно, потому что у полимеразы α нет возможности исправления ошибок. Но авторы исследования предполагают, что «следы» полимеразы α будут оставаться, если с ДНК быстро свяжется белок (рис. 4).

В подтверждение этой гипотезы ученые показали, что ДНК, синтезированная полимеразой α, остается в геноме и после завершения репликации, а не исключается целиком. Мало того, она составляет 1,5% генома.

Интересно, что найденные закономерности характерны не только для дрожжей, но и для человека. Часто вокруг типичных сайтов связывания белков в ДНК накапливаются мутации. Авторы исследования связывают это именно с активностью полимеразы α.

Литература

1. Meselson M., Stahl F.W. (1958). The replication of DNA in Esherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 44 (7), 671–682;
2. Генная терапия против рака;
3. Союз голубоглазых;
4. Johnston L.H., Nasmyth K.A. (1978). Saccharomyces cerevisiae cell cycle mutant cdc9 is defective in DNA ligase. Nature. 274, 891–893;
5. Okazaki R., Okazaki T., Sakabe K., Sugimoto K., Sugino A. (1968). Mechanism of DNA chain growth. I. Possible discontinuity and unusual secondary structure of newly synthesized chains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 59, 598–605;
6. Balakrishnan L. and Bambara R.A. (2013). Okazaki fragment metabolism. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5 (2), doi: 10.1101/cshperspect.a010173;
7. Zheng L. and Shen B. (2011). Okazaki fragment maturation: nucleases take centre stage. J. Mol. Cell Biol. 3, 23–30;
8. Wolfe K.H., Sharp P.M., Li W.H. (1989). Mutation rates differ among regions of the mammalian genome. Nature. 337, 283–285;
9. Reijns M.A.M., Kemp H., Ding J., de Proce S.M., Jackson A.P., Taylor M.S. (2015). Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome. Nature. 518, 502–506;
10. Smith D.J. and Whitehouse I. (2012). Intrinsic coupling of lagging-strand synthesis to chromatinassembly. Nature. 483, 434–438;
11. Perera R.L., Torella R., Klinge S., Kilkenny M.L., Maman J.D., Pellegrini L. (2013). Mechanism for priming DNA synthesis by yeast DNA Polymerase alpha. eLife 2013;2:e00482;
12. Walsh E. and Eckert K.A. Eukaryotic replicative DNA Polymerases. In: Murakami K. and Trakselis M.A. (Eds.), Nucleic Acid Polymerases. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2014. 30, 17–41. ISBN 978-3-642-39795-0..