Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.

---

Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.

---

Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

---

Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Что собой представляет костный мозг?

Сочетание слов «костный» и «мозг» может сбивать с толку и навевать стереотипные образы. Под мозгом мы привыкли представлять «рыхлую массу» в форме грецкого ореха, располагающуюся в голове. Костный мозг интуитивно можем путать со спинным, ошибочно предполагая, что он располагается в позвоночном столбе.

На самом же деле, костный мозг (КМ) — это гемо- и лимфопоэтический орган, располагающийся в полостях губчатой части и костномозговых каналах костей (рис. 1).

Выделяют две разновидности КМ — красный, цвет которого обусловлен обилием крови и гемопоэтичеких клеток, и желтый, окраска которого связана с наличием большого количества жировых клеток (адипоцитов), замещающих большинство кроветворных клеток [1].

Первоначально у человека имеется только красная разновидность, которая по мере взросления частично переходит в желтую.

Красный костный мозг (рис. 2) состоит из ретикулярной стромы соединительной ткани, кровяных тяжей или островков клеток и синусоидальных капилляров. Строма представлена фибробластическими (стромальными = ретикулярными = адвентициальными) клетками, макрофагами и тонкими ретикулярными волокнами, состоящими из коллагена I типа, протеогликанов, фибронектинов и ламинина. Желтый костный мозг представляет собой подобную структуру, отличающуюся большим числом адипоцитов и меньшим количеством сосудов, гемопоэтических клеток [2].

Какие функции выполняет кровеносная система?

Стабильное кровообращение необходимо каждому организму. Кровь выполняет множество разнообразных функций:

1. Транспортная (связанная с переносом разнообразных веществ). Включает ряд частных функций, к которым относятся:
   • дыхательная — перенос газов (кислорода и углекислого газа) как в растворенном, так и в химически связанном состоянии;
   • трофическая — перенос питательных веществ из участков их всасывания и накопления к тканям;
   • экскреторная — удаление из тканей продуктов метаболизма и их выделение из организма (с мочой, образующейся в почках в качестве фильтрата крови);
   • регуляторная — перенос гормонов, факторов роста и других биологически активных веществ, осуществляющих регуляцию разнообразных функций, к клеткам разных тканей; распределение тепла между органами и его выделение во внешнюю среду (терморегуляторная функция).
2. Гомеостатическая (связанная с поддержанием постоянства внутренней среды организма, в том числе кислотно-щелочного и осмотического равновесия, водного баланса, температуры тела, биохимического состава тканевых жидкостей и др.).
3. Защитная (связанная с нейтрализацией чужеродных антигенов, обезвреживание микроорганизмов различными иммунными механизмами) [3].

Столь большое разнообразие функций кровь может выполнять благодаря необычности своего гистологического строения: (1) форменные элементы (эритроциты, лейкоциты и тромбоциты) и (2) плазма (рис. 3). Источником форменных элементов является костный мозг. Бóльшая часть пула клеток формируется красным костным мозгом, остальная — желтым. [4].

Почему люди нуждаются в костном мозге?

Костный мозг является одним из центральных органов как кровеносной, так и иммунной систем [5]. Как отмечалось ранее, в нем находятся гемопоэтических стволовые клетки, способные дифференцироваться в различные клетки крови, например, в эритроциты, макрофаги или Т-лимфоциты.

Возникновение патологий этого органа приводит к снижению эффективности его деятельности, что ведет к ухудшению работоспособности иммунной и кровеносной систем. Организм человека становится более уязвимым. Возникает потребность в трансплантации донорского материала.

Нарушение целостности костного мозга может, произойти, например, при лечении онкозаболеваний. Вследствие применения химио- и лучевой терапии уничтожаются раковые, но вместе с ними и другие активно делящиеся клетки организма, в том числе, компоненты костного мозга. Организм теряет возможность производить форменные элементы крови.

Без трансплантации костного мозга подобное лечение нередко может принести больше вреда, нежели пользы, поскольку в итоге приводит к серьезным нарушениям в работе всего организма. В трансплантации нуждаются люди, больные лейкозом, апластической анемией, злокачественными лимфомами, аутоиммунными заболеваниями и пр.

Информированность о трансплантации костного мозга

Мы провели опрос группы потенциальных доноров (141 человека) из разных городов России (Санкт-Петербург, Москва, Орел, Казань и др.). Опросник состоял из 17 вопросов, 7 из которых были построены по методу семантического потенциала Ч. Осгуда.

В результате проведения опроса была установлена средняя осведомленность граждан по вопросу устройства костного мозга и его функций: более половины опрошенных (71%, то есть 100 человек) дали верное определение костному мозгу, из них наиболее полно и верно перечислили его функции 43% респондентов (рис. 4).

Большинство опрошенных (95,3%) знают о наличии донорства костного мозга в разной степени (от информированности о самом факте подобной операции, до сведений о многих деталях процесса). Люди осведомлены о проблеме благодаря СМИ (43,4% опрошенных), социальным сетям (50,4%) и близкому кругу (друзьям, родственникам) — 24%. Меньше половины респондентов задумывалось о том, что, став донором, смогли бы спасти жизнь (48,3%). Больше половины опрошенных (62,4%) (рис. 5) не стали бы совершать донацию костного мозга и не знают о наличии регистра доноров (65,4%). Респонденты в большинстве случаев не согласились бы сдавать костный мозг в связи со страхом получить болевые ощущения (47%) и необратимые травматичные изменения собственного здоровья (56,7%).

Трансплантация

Трансплантация КМ состоит из четырех этапов:

• предтрансплантационного (определения показаний к ТКМ; выбора донора; получения трансплантата; выбора и выполнения режима кондиционирования);
• собственно трансплантации (переливания гемопоэтических стволовых клеток);
• посттрансплантационного, включающего в себя сопроводительную терапию (асептический режим, медикаментозная профилактика, заместительная терапия, водно-электролитный баланс, венозный доступ); последний этап ТКМ — наблюдение за больным и контроль отдаленных результатов (летальный исход возможен в течение 100 дней) [6].

Трансплантация гемопоэтических клеток костного мозга бывает двух видов: аутологичная и аллогенная.

При аутологичной пересадке (рис. 6а) используются собственные стволовые клетки пациента. До жесткой химиотерапии отбираются и замораживаются клетки костного мозга. Далее, после проведения процедуры, они вводятся обратно в организм.

Аллогенная трансплантация (рис. 6б) представляет собой пересадку гемопоэтической ткани от здорового подходящего донора. Выделяют три вида подобной трансплантации (в зависимости от источника материала): совместимого родственного, совместимого неродственного и не полностью совместимого родственного происхождения.

Выделение нескольких типов обусловлено различием главного комплекса гистосовместимости (МНС) у разных людей и разной вероятностью возникновения осложнений при трансплантации.

Прежде чем обсудить непосредственно аллогенную трансплантацию, разберемся в том, что же такое МНС, откуда он берется и зачем нужен.

Главный комплекс гистосовместимости (МНС) — это несколько групп генов, кодирующих специфический мембранный белок — лейкоцитарный антиген человека (HLA), который осуществляет презентацию антигенов. Благодаря этому процессу происходит распознавание чужеродных антигенов и формирование адаптивного иммунного ответа. Основа последнего заключается в активации В-лимфоцитов, ответственных за формирование антител, и Т-лимфоцитов с макрофагами, обеспечивающих клеточный иммунитет (физическое удаление инородного агента). Поскольку комплекс гистосовместимости является тонкой структурой и направлен на защиту собственного организма, то у разных людей данный фактор может быть различен, следовательно, при смешивании биологических тканей, будь то кровь или костный мозг, есть шанс возникновения реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ). Проявление такой реакции может привести к полному неприживлению материала (иммунный ответ реципиента на клетки донора). Во избежание возникновения РТПХ до пересадки у донора и рецепиента определяют степень гистосовместимости путем HLA-типирования. По тому, насколько высока совместимость, и выделяют типы аллогенной трансплантации:

• Пересадка от совместимого родственного донора. При подобной донации материал является полностью совместимым по HLA-показателю и родственным пациенту. Донорами, как правило, являются братья и сестры больного.
• Пересадка от совместимого неродственного донора. Для данного типа трансплантации используется материал совместимый по лейкоцитарному антигену, но не родственный больному. Поиск доноров для этой трансплантации осуществляется через регистр. Данный путь является более длительным и дорогостоящим, нежели предыдущий (в связи с поиском, трансфером и обследованием донора), но может быть более эффективным, чем следующий тип.
• Пересадка от частично совместимого родственного донора. При проведении данной процедуры не требуется HLA-типирование, т.к. в роли донора выступает родитель, поскольку в таком случае донор является гаплоидентичным (совпадающим наполовину). Этот вид трансплантации применяется во врачебной практике недавно, поскольку ранее считалось невозможным избежать тяжелой РТПХ при неполной совместимости. Однако по данным многочисленных исследований [7], [8] установлено, что при неполной совместимости шансы избежать реакции «отторжения» такие же, как и при полной неродственной совместимости. Для проведения такой трансплантации используют дополнительные манипуляции с трансплантатом во избежание возникновение РТПХ, например, моделирование клеточного состава путем изменения направления поляризации лимфоцитов от Th1 к Th2 с помощью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ).

Как происходит процедура типирования и донации стволовых клеток?

Для типирования и определения HLA-генотипа у потенциального донора берут образец крови до 10 мл [9]. Проводят лабораторные исследования и вносят полученную информацию в общероссийскую базу — Национальный регистр доноров.

Если потенциальный донор подходит больному, начинается процесс изъятия стволовых клеток. Его возможно осуществить двумя путями: шприцом из тазовой кости, или с помощью препаратов, которые способствуют выходу недифференцированных стволовых клеток в кровь. В первом случае, донора госпитализируют в больницу и под общим наркозом производят забор. В тазовой кости делают несколько маленьких разрезов, через которые специальными иглами извлекают около литра жидкого костного мозга (такой объем составляет не более 5% от общего количества и компенсируется организмом в течение двух недель).

Побочные эффекты для донора при данном способе забора могут быть следующими: болевые ощущения в тазовых костях, снижение уровня гемоглобина, тошнота, сонливость, слабость (последствия наркоза).

Во втором случае донор проходит подготовительный период (около пяти дней). В течение этого времени человеку подкожно вводится препарат (рекомбинантные факторы роста = гранулоцит-колониестимулирующий фактор = гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор) для стимуляции пролиферации и мобилизации стволовых клеток. На пятый день донору проводят процедуру афереза (получение отдельных компонентов костного мозга путем центрифугирования) длительностью 3–5 часов. Кровь забирается из вены, проходит клеточный сепаратор (установку с несколькими камерами и системой подвода/вывода жидкости и клеточной культуры, предназначенную для разделения пула на группы по размеру, удельному весу и другим характеристикам) и возвращается донору. После прохождения через аппарат, из крови выделяют небольшое количество стволовых клеток. Процедура повторяется несколько раз для отбора необходимого количества материала. Суммарно через аппарат может проходить до 15 литров крови, из которых в сепараторе остается до 200 мл (остальное отправляется обратно донору).

Побочные эффекты для донора могут быть различны: ломота в костях, связанная с активным делением клеток костного мозга; обострение аутоиммунных заболеваний (например, артрита, красной волчанки).

Риски, связанные с серьезными последствиями для организма донора в обоих случая минимален, однако при применении перфузионного катетера есть шанс возникновения кровотечения, появления абсцесса или иной местной инфекции [6]. Как правило, спустя 2–3 недели все неприятные ощущения и последствия донации проходят.

В мировой практике существует регламент, по которому донор и реципиент не должны знать друг о друге. Максимум предоставляемой информации — возраст и пол. Знакомство может произойти лишь спустя два года после трансплантации. Донорам также не сообщают: помог ли их костный мозг вылечить больного. Это не тайна, а вынужденная анонимность. Регламент соблюдается в целях предосторожности и в силу психологических и этических причин.

История от реального донора костного мозга

«Я заключила некую сделку с небесами», — говорит Алла Багирянц, которая стала реальным донором костного мозга. В 2015 году маме девушки поставили диагноз: множественная миелома (рак плазматических клеток крови). Это подвигло девушку изучить данную тему. Так она узнала, что при этом типе заболеваний может понадобиться пересадка костного мозга. Лечение миеломы проходило с помощью трансплантации аутологичных стволовых клеток. Это помогло матери Аллы, теперь она в ремиссии. Болезнь близкого человека послужила толчком, и девушка вступила в регистр доноров костного мозга в Центре гематологии.

В 2019 году Алла узнала, что есть совпадение со сторонним реципиентом и необходимо приехать в клинику для расширенного типирования. Следовало провести дополнительные анализы, чтобы удостовериться, что ни одно заболевание не осталось незамеченным. Пересаживать стволовые клетки от не совсем здорового человека может быть опасно для реципиента, ведь на момент трансплантации иммунитет пациента полностью подавлен.

«Когда наступил непосредственный момент донации, — говорит Алла, — меня проконсультировали о двух способах извлечения стволовых клеток: из тазобедренной кости и из периферической крови. Я выбрала второй вариант, доверясь врачам. Мне сделали укол лейкостима. Он стимулирует выход гемопоэтических клеток в кровь. Затем в обе руки вставили катетеры. Из одной забирали кровь, которая проходила через центрифугу, в которой сепарировались гемопоэтические клетки. А во вторую возвращали оставшуюся кровь, не содержащую стволовых клеток. По прошествии некоторого времени после начала донации у меня стали неметь конечности и лицо, но я быстро сообщила медсестрам, и они сделали мне укол, который помог. Весь процесс занял около четырех часов. После процедуры я чувствовала себя хорошо, единственной проблемой была небольшая ломота в костях. Стволовые клетки сдавала в два захода, так как с первого раза не получилось взять нужное количество. Вся донация не страшнее, чем обычная сдача крови».

Расширение базы регистра позволит быстрее находить «генетического близнеца» нуждающемуся, тем самым увеличивая его шанс на выздоровление.

Что происходит при трансплантации с больным?

Перед тем как приступить к введению гемопоэтических клеток, врачи проводят процедуру кондиционирования (химиотерапию или лучевую терапию). Это делается с целью уничтожения раковых клеток (если лечение касается онкозаболеваний) или подавления иммунной системы, чтобы увеличить шанс приживления донорских клеток. Такой процесс имеет свои негативные последствия: тошнота и рвота, выпадение волос, кровотечения, сердечная и почечная недостаточности.

Затем наступает следующий этап. После того как врачи сделали пункцию (прокол стенки сосуда, полости или какого-либо органа с лечебной или диагностической целью) у донора, начинается непосредственное переливание реципиенту. Стволовые клетки попадают в организм больного и начинают свою работу. Донорские клетки с течением времени компенсируют недостаток клеток костного мозга реципиента, налаживая кроветворение и иммунную систему. Процесс приживления обычно требует нескольких недель, после чего показатели крови начинают нормализовываться.

Риск развития патологических реакций существует на всех стадиях адаптации организма после трансплантации. Реакция может начаться в течение первых месяцев после пересадки или развиться куда позже. Это происходит вследствие того, что донорские клетки подвергаются иммунному ответу организма реципиента.

Лечение спинного мозга с применением костного

Центральная нервная система имеет ограниченные способности к восстановлению, на которые негативно влияют различные факторы, в том числе связанные с повреждениями спинного мозга. Нарушения нервных структур и воспалительные процессы в них могут привести к инвалидности.

Однако исследования в области восстановления нейронов ЦНС дали почву для развития регенеративных методов лечения. Одним из многообещающих направлений в исследовании является метод введения стволовых клеток костного мозга совместно с плазмой крови, обогащенной тромбоцитами. Такой метод стимулирует регенерацию нейронов, поддерживая рост аксонов. Предполагалось, что данный вид лечения, с использованием концентрата клеток костного мозга, предпочтительнее из-за низкой способности на иммунный ответ и их большой распространенности.

На базе института Cedar Stem Cell Institute (штат Огайо, США) проводились процедуры ввода PRP (плазмы крови, обогащенной тромбоцитами) совместно с BMAC (концентратом стволовых клеток костного мозга) пациентам, имеющим повреждения в спинном мозге. Целью исследования было оценить изменения в состоянии пациентов, имеющих любой тип SCI (повреждение спинного мозга), а также отследить изменения индекса инвалидности ODI (показателя инвалидности, где более высокие значения эквивалентны более высокой инвалидности: от 0% до 100%).

Первый этап — выделение PRP и BMAC

Для получения PRP у пациентов отбирают по 60 мл периферической крови, добавляют 10 мл антикоагулянта цитратдекстрозы и центрифугируют полученную смесь с последующим концентрированием. В результате этого в среднем получается 7–8 мл плазмы, обогащенной тромбоцитами.

Получения BMAC проводят с помощью иглы для биопсии, которая через кожу и подкожные ткани вводится в правый гребень подвздошной кости. При помощи медленной аспирации отбирается 2 шприца по 25 мл, в которые добавляется по 1000 ед\мл гепарина. Полученную смесь фильтруют и центрифугируют в течение 10 минут, получая в итоге 17 мл BMAC.

После отбора PRP и BMAC смешивают в соотношении 1:2. Последним этапом данного метода является введение полученного препарата пациенту.

В эксперименте принимали участие семь человек с различными повреждениями спинного мозга, средний возраст пациентов составил 43,7 ± 2,33 года. После получения травмы пациенты перенесли минимум два вмешательства (физиотерапию и хирургическое вмешательство), а в период от 2,4 месяцев до 6,2 лет после травмы получили лечение смесью PRP и BMAC.

Показатели ODI отслеживали с помощью опроса по категориям: интенсивность боли, уход за собой, подъем, ходьба, положения сидя и стоя, сон, сексуальная жизнь, социальная жизнь и путешествия. Пациенты должны были оценить свое состояние от 0 (нет дискомфорта из-за травмы) до 5 (максимальный дискомфорт) в каждой категории. Все оценки складывались и делились на 50, чтобы получить процент функциональной инвалидности.

У 6 из 7 пациентов на момент начала эксперимента имелась значительная функциональная инвалидность. Один пациент после процедуры прекратил свои наблюдения, а динамика остальных пяти была отображена в исследовании. У двух пациентов наблюдались изменения от «тяжелой инвалидности» до «минимальной инвалидности», они вернули способность выполнять все бытовые дела самостоятельно. Показатели третьего пациента улучшились на 40% за год, а у четвертого улучшилось состояние на 28% за два месяца наблюдения.

Побочные эффекты наблюдались у одного из семи подопечных. Он не мог получать внутривенное введение препарата. Пациент сообщил о головной боли и трудностях, связанных с памятью.

Данный метод лечения помогает избежать дополнительного травмирования, которое возникает при введении инъекций в пораженный участок спинного мозга. Он безопасен и эффективен для восстановления после травм. У пациентов наблюдается положительная динамика и минимальное количество побочных эффектов. Потенциал такого лечения велик, и оно претендует занять передовое место при борьбе с повреждениями спинного мозга.

Как сегодня ищут донора костного мозга?

Мировая практика показала, что данные о донорах, протипированных по HLA, лучше хранить в виде единой информационной базы. Регистр Всемирной ассоциации доноров костного мозга содержит данные 37 млн добровольцев из 55 стран.

Формирование РДКМ (регистр доноров костного мозга) в России только начинает набирать обороты. Например, Русфонд совместно с Первым Санкт-Петербургским государственным медицинским университетом им. академика Павлова создал базу доноров костного мозга. Регистр был назван в честь Васи Перевощикова — больного, умершего от лейкоза в девять лет из-за отсутствия донора. Сегодня в регистре числится 40 258 потенциальных доноров. Однако регистра, объединяющего все города России, — нет, что усложняет поиск донора по всей стране. База разрознена по городам и учреждениям, поэтому шанс встретить генетически подходящего донора составляет 1:10 000.

Обращение к зарубежным регистрам возможно не всегда, поскольку процедура донации от иностранного гражданина может стоить порядка 20–50 тысяч долларов. Помимо этого, из-за многовариантности генотипов (связанной, например, с многонациональностью России) поиски донора могут закончиться провалом, т.к. не будет обнаружен подходящий по HLA-типу человека.

Вследствие этого в 20–40% случаев поиск в европейских регистрах заканчивается неудачей.

«В России нет обобщенной базы доноров костного мозга, — комментирует Виктор Андронов, заслуженный донор России, основатель движения “Энергия жизни”. — Они сообщаются между собой, обмениваясь данными, но дружат не все. Проблема заключается в том, что у нас до сих пор отсутствует законодательная база — нет закона о донорстве костного мозга. Организация Русфонд создала большую базу доноров, которая сейчас является самой перспективной в стране.

Помимо отсутствия общероссийского регистра проблемой является недостаточная информированность людей. Многие путают костный со спинным мозгом, считают, что процедура является болезненной, а иногда и вовсе не знают о донорстве.

В идеале, в регистре должен быть каждый. Нам стоило бы жить под лозунгом: “Все помогают всем”. В условиях коронавируса это крайне важно, т.к. нам с иностранными донорами очень сложно в этот период.

Количество доноров в регистре — вопрос национальной безопасности и индекса человеческой отзывчивости».

Создание единого регистра является решением проблем с трансплантацией, поскольку это снизит затраты на поиск и активацию донора, что увеличит шансы на жизнь нуждающихся в пересадке.

Людей спасет отзывчивость и причастность к общему делу. Донорство способно объединять против общей проблемы, связанной с серьезными заболеваниями. Трансплантация костного мозга — шанс на жизнь.

Литература

1. Mescher A.L. Junqueira’s Basic Histology text and atlas. McGraw-Hill Education / Medical, 2018. — 576 p.;
2. Sean J. Morrison, David T. Scadden. (2014). The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334;
3. Быков В.Л. Цитология и общая гистология. Функциональная морфология клеток и тканей человека. СПб.: «Сотис», 2002;
4. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Остроумов Е.Н., Честухин В.В. и др. (2003). Первый опыт клинического применения аутологичныхмезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции миокарда. «Российский кардиологический журнал». 5, 42–50;
5. What does my bone marrow do? (2016). Myelodysplastic Syndromes Foundation;
6. Гедро Н.Н. (2013). Современное отделение трансплантации костного мозга. «Медицинская сестра». 2, 7–9;
7. Субботина Н.Н., Долгополов И.С., Попа А.В., Бояршинов В.К., Пименов Р.И., Менткевич Г.Л. (2014). Гаплоидентичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей с острыми миелоидными лейкозами: эволюция метода и собственные данные. «Клиническая онкогематология». 2, 131–136;
8. O. V. Paina, N. V. Stancheva, Ye. V. Semenova, S. N. Bondarenko, O. A. Slesarchuk, et. al.. (2015). Haploidentical hematopoietic stem cell transplantation in the treatment of children and adolescents with resistant forms of acute leukemia. Ross. ž. det. gematol. onkol.. 2, 39-45;
9. E. G. Khamaganova, L. A. Kuzmina. (2019). ASSESSMENT OF HLA-COMPATIBILITY AND REQUIREMENTS FOR HLA-TYPING OF PATIENT AND DONOR IN ALLOGENEIC HEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION. Gematologiâ i transfuziologiâ. 64, 175-187.