Геном человека состоит из 46 хромосом — длинных линейных отрезков ДНК, плотно и иерархически (в несколько этапов) упакованных с помощью специальных белков в компактные образования. Минимальная единица этой иерархической упаковки — нуклеосома. Нуклеосома — это комплекс из восьми молекул гистонов (класс ядерных белков), похожий на катушку, вокруг которой приблизительно в 1,7 оборота намотано 150 нуклеотидных пар (п.н.) ДНК (рис. 1). Таким образом, ДНК в наших клетках напоминает бусы из «катушек»-нуклеосом.

Поскольку считывать генетическую информацию можно только с ненамотанной ДНК, подобная укладка оказывает огромное влияние на уровень экспрессии генов. Значение имеет и тип гистонов, из которых состоят нуклеосомы, и претерпеваемые ими модификации, и место расположения на ДНК. В основной массе эти белки хаотично расположены по всему геному, постоянно меняя свое место связывания, однако есть участки ДНК, требующие строго определенного позиционирования гистонов.

Наиболее изучены в этом плане места начала транскрипции (transcription start sites, TSS). На клеточных линиях дрожжей [1] и T-лимфоцитов человека [2] ранее было показано, что у активно экспрессируемых генов нуклеосома жестко расположена в районе 100 п.н. в направлении 5′→3′ от TSS и нет нуклеосомы в районе 50 п.н. в обратном направлении (рис. 2), в то время как у «молчащих» генов нуклеосомы расположены в области TSS хаотически. Такой паттерн укладки нуклеосом, скорее всего, связан с необходимостью организации транскрипционного комплекса: гистоны конкурируют с транскрипционными факторами, ДНК-полимеразой и прочими белками за место посадки. Таким образом, расположение нуклеосом в гене указывает на то, как активно он экспрессируется в данной клетке [3].

Остается вопрос — как узнать о расположении нуклеосом без непосредственного доступа к клетке организма? Ответ дает апоптоз (запрограммированная клеточная смерть): во время апоптоза ДНК претерпевает конденсацию и ферментативную деградацию эндонуклеазами. Поскольку гистоны, как уже отмечалось выше, конкурируют с прочими белками за связывание с ДНК, то расщепляющие ее ферменты имеют доступ в основном только к участкам ДНК между нуклеосомами — так называемым линкерам, — по ним ДНК и разрезается (рис. 1). Впоследствии с помощью везикулярных телец деградированная ДНК высвобождается в кровь, где она либо связывается с мембранными белками форменных элементов в сыворотке, либо свободно «плавает» в плазме. Таким образом, циркулирующая в крови ДНК (цирДНК) представлена квантующимися размерами: превалируют мононуклеосомы, потом ди-, тринуклеосомы и так далее, формируя при электрофорезе в агарозном геле «апоптотическую лестницу» — отдельные полосы, соответствующие различным по молекулярной массе фрагментам.

Далее, если мы проанализируем последовательности коротких фрагментов ДНК в крови и определим, откуда они пришли из генома (картируем по референсному геному человека), то сможем определить ту самую картину нуклеосомной укладки в ткани — источнике ДНК (паттерн нуклеосомной укладки). А поскольку знание паттерна нуклеосомной укладки позволяет судить об уровне экспрессии гена, можно, к примеру, обнаружить признаки аномальной экспрессии генов опухолевых супрессоров или онкогенов, что указывает на развитие опухолевого процесса.

Идея проста на словах. В реальности же помимо нуклеосомной укладки на характер деградации ДНК влияет множество факторов, а сама ДНК в крови человека представляет собой смесь фрагментов из множества тканей-источников: она собирается в кровь со всего организма, а в разных тканях разные гены экспрессируются по-разному, поэтому картины накладываются друг на друга. Таким образом, до сих пор не удавалось продемонстрировать возможность реализации этой идеи.

В течение последнего десятилетия активно велись исследования методик анализа паттерна фрагментации ДНК на клеточных линиях — дрожжей и клеток крови человека. Впервые к анализу непосредственно цирДНК подобрался коллектив российских ученых из Медико-Генетического Научного Центра, Университета Джорджа Мэйсона и  компании «Атлас-Онкодиагностика»: они использовали данные высокопроизводительного секвенирования (NGS) экзома цирДНК, выделенной из плазмы двух пациентов со злокачественными новообразованиями. То, что казалось проблемой, удалось обернуть себе на пользу: поскольку цирДНК представляет собой смесь ДНК из всех тканей организма, если взять гены, активно экспрессируемые во всех тканях (так называемые гены домашнего хозяйства), и посмотреть на их паттерн нуклеосомной укладки по сравнению с тканеспецифичными генами, то мы должны ожидать, что первые будут демонстрировать картину, характерную для активно экспрессируемых генов, а вторые — для «молчащих», так как в большинстве тканей они активно не работают. И эту разницу удалось увидеть: отношение высоты +1 пика (рис. 2) к последующему минимуму было значительно больше для генов домашнего хозяйства (рис. 3) [3], [4]. Так удалось подтвердить новую «биомаркерную концепцию» — по ДНК из плазмы крови можно воспроизвести картину нуклеосомной укладки в тканях и судить об особенностях эпигенетической регуляции.

Спустя месяц после публикации российских исследователей, в Cell вышла статья с новой информацией в поддержку этой концепции: получив большой объем данных секвенирования плазмы крови больных и здоровых, удалось идентифицировать даже ткань, проявляющую аномальную экспрессию [5]. Для 44 образцов плазмы крови пациентов с диагностированным раком IV стадии (твердые опухоли различных органов и гистологии) провели полногеномное секвенирование. Для каждой позиции генома считали сигнал L-WPS — количество фрагментов, полностью перекрывающихся с окном в 120 п.н., центрированным по позиции. Далее полученный сигнал обрабатывали с помощью быстрого преобразования Фурье. Среднюю интенсивность сигнала в окне частот 193–199 п.н. для преобразования первых 10 т.п.н. гена принимали за меру его экспрессии. Затем вычисляли корреляцию посчитанных таким образом профилей экспрессии и заранее известных профилей экспрессии клеточных линий. Результаты приведены на рисунке 4.

Благодаря результатам российских ученых, подтвержденным в работе зарубежных коллег, появляются новые возможности неинвазивной диагностики онкологических заболеваний и открывается новый пласт фундаментальных исследований, которые, возможно, смогут пролить свет не только на онкологические, но и на другие патологические процессы.

Более популярно суть анализа и перспективы его применения описаны в российской прессе: «Раннюю диагностику рака скоро будут проводить по анализу крови» [6].

Литература

1. Kaplan N., Moore I.K., Fondufe-Mittendorf Y., Gossett A.J., Tillo D., Field Y. et al. (2009). The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362–366;
2. Valouev A., Johnson S.M., Boyd S.D., Smith C.L., Fire A.Z., Sidow A. (2011). Determinants of nucleosome organization in primary human cells. Nature. 474, 516–520;
3. Jiang C. and Pugh B.F. (2009). Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nat. Rev. Genet. 10, 161–172;
4. Ivanov M., Baranova A., Butler T., Spellman P., Mileyko V. (2015). Non-random fragmentation patterns in circulating cell-free DNA reflect epigenetic regulation. BMC Genomics. 16, S1;
5. Snyder M.W., Kircher M., Hill A.J., Daza R.M., Shendure J. (2016). Cell-free DNA comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin. Cell. 164, 57–68;
6. Пичугина Е. (2016). Раннюю диагностику рака скоро будут проводить по анализу крови. «MK.ru».