Снижение затрат на иммуногистохимические исследования — японский подход

Иммуногистохимия (ИГХ) — это методика исследования тканей на выявление клеточных или тканевых маркеров (антигенов) благодаря их связыванию с мечеными антителами, что оценивается с помощью световой или флуоресцентной микроскопии. Специфическое связывание антиген—антитело позволяет локализовать значимые молекулы (ферменты, гормоны, цитокины, транскрипционные факторы и др.) [1]. Подробнее «Биомолекула» об этом рассказывала в статье «Иммунологические технологии» спецпроекта «12 биологических методов в картинках» [2].

ИГХ имеет широкую применимость: молекулярная и клеточная биология, разработка лекарств, клиническая лабораторная диагностика. Так, ИГХ часто используется в медицине (онкологии) для обнаружения онкомаркеров, для диагностики опухолей неясного генеза, для определения типа опухоли и характера ее метастазирования, для прогнозирования ответа на терапию. Помимо этого, ИГХ в медицинской практике используется для диагностики инфекций (вирусы, бактерии, простейшие), нейродегенеративных заболеваний, травм мозга, мышечной дистрофии и др. В научных целях иммуногистохимию применяют для изучения фенотипических изменений ткани (дифференцировка клеток, рост, развитие и деление клеток, апоптоз), характера иммунного ответа, процесса заживления ран, отторжения тканей и взаимодействия ткани и биоматериала и т.д. [3], [4].

Несмотря на давнее начало применения (1941 г.), совершенствование метода ИГХ продолжается. Японская компания Nichirei Biosciences Inc. разработала и запатентовала технологию для ИГХ-окрашивания — иммуно-энзимный полимер, — позволяющую ускорить процесс и существенно снизить затраты на исследование. Анализ рынка подтверждает, что стоимость набора этого производителя в два раза ниже общерыночной. В предложении производителя целая линейка реактивов для ИГХ-исследований на тканях человека, и самые востребованные — серия N-Histofine® Simple Stain. Реактив основан на прецизионно приготовленных полимерах из аминокислот, меченных пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой и конъюгированных с Fab-фрагментами вторичных антител. Реактив Histofine® Simple Stain Max Po может применяться с первичными мышиными или кроличьими антителами, а в комбинации с реактивом Histofine ® Simple Stain AP (M) может использоваться и для тройного мечения на одном срезе.

Для примера, три разных мышиных первичных антитела при разных локализациях (ядро, цитоплазма, мембрана) могут быть выявлены тетразолиевым синим, новым фуксином (красный цвет) и ДАБ (коричневый), что дает хорошие методические возможности.

Наряду с полимерными системами Histofine, для тканей человека разработаны аналоги для тканей экспериментальных животных: мыши и крысы продолжают оставаться самыми частыми объектами исследований (см. статью спецпроекта «Биомолекулы» «Модельные организмы: грызуны») [5]. Применение первичных мышиных антител может вызвать проблемы. В этом случае особенно ценной будет возможность использования Histofine® Mousestain kit, который гарантирует использование первичных мышиных антител на ткани мыши. Это нашло отражение в многочисленных исследованиях японского общества токсикологов-патологов [6], [7].

Хромогены (диаминобензидин, аминоэтил карбазол, новый фуксин, BCIP/NBT) подобраны производителем в оптимальном формате, что позволяет максимально быстро провести заключительный этап выявления антигена.

Принцип метода не отличается от общепринятого:

1. Заключение в парафин фиксированной в формалине ткани или заморозка свежей ткани.
2. Приготовление среза ткани.
3. Температурная демаскировка антигенов. Промывка в PBS.
4. Забивка неспецифических антигенов (3% раствор перекиси водорода для блокировки эндогенной пероксидазы). Промывка в PBS.
5. Добавление первичных антител во влажной камере. Трехкратная промывка в PBS.
6. Добавление реактива Histofine (усилитель первичных антител, вторичные антитела и фермент). Промывка в PBS.
7. Контрастное окрашивание с помощью хромогена в субстратном буфере Histofine.
8. Заключение гистологических срезов в заливочную среду.
9. Анализ результатов на световом микроскопе.

Преимущества системы Histofine® Simple Stain:

1. Уменьшение количества этапов выполняемого протокола. Объединены этапы применения вторичных антител, использования фермента и амплификации сигнала (реактивы в одном флаконе). Реактив не требует предварительного разведения, готов к использованию. Это способствует упрощению и ускорению проведения анализа.

   

2. Высокая чувствительность и высокий сигнал. Ферментная метка выявляется во многих участках аминокислотного полимера, имеющего конфигурацию «грозди винограда», что обеспечивает амплификацию сигнала и высокую чувствительность.

   

3. Чистота сигнала. Не требуется проведение этапа блокирования эндогенного биотина (безбиотиновая система). Уменьшать вероятность фонового окрашивания позволяет использование Fab-фрагментов вторичных антител и использование полимера из аминокислот в отличие от молекулы декстрана. Полноразмерные IgG молекулы способны к опсонизации с Fc-рецепторами на поверхности лейкоцитов; использование Fab-фрагментов позволяет этого избежать. Аминокислотный полимер, по сравнению с традиционно используемой молекулой декстрана, отличается меньшими размерами, что обеспечивает более высокую степень диффузии при отмывке.

   

4. Поливалентность вторичных антител расширяет возможности лаборатории в выборе первичных антител (использование мышиных или кроличьих первичных антител).

   

Ассортимент

Приобрести продукцию Histofine производителя Nichirei Biosciences Inc. вы можете у официального дистрибьютора в России — компании «Микротесты б.м.в.»

Литература

1. Aikawa E . Methods of Analysis in Comprehensive Biomaterials (Volume). Immunohistochemistry, 2011. P. 277–290.
2. 12 биологических методов в картинках
3. Lewis T.L., Roth K.A. Immunohistochemical Detection Methods. University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA, 2014. P. 3829–3840
4. Duraiyan J., Govindarajan R., Kaliyappan K., Palanisamy M. Applications of immunohistochemistry. J Pharm Bioallied Sci., 2012. P.307–S309
5. Модельные организмы: грызуны
6. Furukawa S., Nagaike M., Ozaki K. (2017). Databases for technical aspects of immunohistochemistry. Journal of Toxicologic Pathology. 1, 79–107
7. Takayasu M., Saori M., Hirofumi H., Kiyokazu O. (2021). Databases for technical aspects of immunohistochemistry. Journal of Toxicologic Pathology. 2, 161–180