Конкурс «био/мол/текст»-2015

Эта работа опубликована в номинации «Лучший обзор» конкурса «био/мол/текст»-2015.

---

Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.

---

Спонсоры конкурса: лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.

Общий принцип действия

«Чувством кворума» называют способность некоторых микроорганизмов к общению посредством специфических сигнальных молекул, необходимому для координации действий членов сообщества. Любая система quorum sensing (далее — QS) включает в себя сигнальную молекулу (индуктор), рецептор, фактор транскрипции, и фермент, катализирующий синтез новых молекул индуктора. Иногда рецептор и фактор транскрипции представляют собой один и тот же белок. Среди транскрибируемых генов могут находиться последовательности, кодирующие факторы вирулентности или белки, необходимые для образования биопленки. Но самое главное то, что экспрессия гена синтазы сигнальных молекул тоже QS-зависима. В случае успешного взаимодействия сигнала с рецептором концентрация сигнальных молекул стремительно нарастает. Если взаимодействия не произошло, то нестабильная сигнальная молекула разлагается в окружающей среде. Именно поэтому коллективные действия микробной популяции возможны только при определенной концентрации сигнальных молекул. То есть популяция действует согласованно только тогда, когда собирается кворум. Бактерия может иметь и более одной системы QS для транскрипции различных генов: например, у Pseudomonas aeruginosa их три. У каждой из этих систем есть свой индуктор, срабатывающий при определенной «рабочей» концентрации (рис. 1).

Разные системы QS могут предназначаться для решения разных задач. Система первого типа приспособлена в первую очередь для внутривидового общения, система второго типа — для межвидового, а третьего — для взаимодействия с эукариотами! Приведенная в таблице 1 классификация весьма условна, так как в бактериальной клетке может быть несколько подобных сигнальных путей. Одна и та же бактерия может иметь системы QS для решения как «общих» вопросов, так и «специальных». Иногда остается лишь одна, «специальная» система. Кроме того, открываются всё новые и новые регуляторные пути. Совсем недавно была опубликована статья [5], в которой сообщается об открытии у Photorhabdus asymbiotica (патогена насекомых и человека) альтернативной системы QS, роль сигнальных молекул в которой выполняют диалкилрезорцинолы и циклогександионы. При этом рецепторный белок PauR относится к семейству LuxR-подобных белков, однако не обладает сродством к ацилированным гомосеринлактонам (AHL). По-видимому, «перенастройка» рецептора — результат коэволюции бактерии и хозяина.

Как вносить помехи в бактериальное общение?

Для того чтобы общаться с соседями, бактерия должна подавать сигнал, улавливать его при помощи особых рецепторов и отвечать на него — транскрибировать определенные гены. И каждую из этих трех стадий можно прервать, подобрав соответствующие ингибиторы. Если мы намерены в будущем применять наш ингибитор для лечения микробных инфекций, то для нас крайне важно, чтобы такое соединение не было токсичным для эукариотических клеток. Оно должно быть достаточно стабильным и специфичным именно против систем QS и не должно влиять на основные метаболические процессы в клетке. В противном случае бактерии смогут быстро обзавестись защитными механизмами — как это произошло в случае антибиотиков. Разобщенные бактерии хуже образуют биопленки, что делает их более уязвимыми как для иммунной системы, так и для антимикробных препаратов.

Ингибиторы продукции сигнала («кляп»)

Такие вещества заставят бактерию замолчать в прямом смысле, так как клетка просто перестанет производить сигнальные молекулы. Зная путь биосинтеза индуктора, можно подобрать аналоги предшественников, которые будут нарушать работу ферментов-синтаз. Так, AHL синтезируются с участием LuxI-подобных и AinS-подобных синтаз из S-аденозилметионина (SAM) и ацильного остатка, который связан с белком-переносчиком АСР. Показана эффективность таких аналогов SAM, как S-аденозилгомоцистеин, S-аденозилцистеин и синефунгин в системах in vitro [6], [7]. За конечный этап биосинтеза АСР отвечает бактериальная редуктаза FabI, которая ингибируется триклозаном [8]. Исследование, проведенное в 2007 году, показало, что модификация пептидов-предшественников приводит к ингибированию пептидазы золотистого стафилококка [9]. Несмотря на такое разнообразие ингибиторов, этот подход представляется малоперспективным, так как бактерии смогут приобрести к ним устойчивость. Например, вышеупомянутый триклозан синегнойная палочка способна выкачивать при помощи специальных насосов [10].

Ингибиторы распространения сигнала («глушилка»)

Если бактерию нельзя заставить просто замолчать, то можно — тоже с помощью химических агентов — значительно подпортить качество межклеточной связи. Перспективным инструментом могут быть ферменты, разлагающие сигнальные молекулы. В частности, AHL могут разлагаться лактоназами [11], ацилазами [12] и оксидоредуктазами. Эти ферменты необходимы бактериям для успешной колонизации ризосферы, где обитает много конкурентов. Есть и еще более удивительное обстоятельство: некоторые бактерии способны использовать AHL в качестве единственного источника углерода и энергии, то есть попросту питаться им [13]. Получается, что с помощью лактоназ бактерии «перехватывают сигналы», которые используют конкурентные виды [14]. Настоящим специалистом по захвату территории таким способом признан почвенный штамм Rhizobium sp. NGR234 [15]. Интересно, что ученые нашли способ заставить ферменты, входящие в состав системы QS, действовать наоборот [16]. У E. coli в цитоплазме есть киназа LsrK, фосфорилирующая сигнальную молекулу AI-2 (табл. 1). Если обработать культуру кишечной палочки этой киназой, то сигнальные молекулы будут фосфорилироваться во внешней среде и не смогут попасть внутрь клеток. Несмотря на внушительный перечень подобных ферментов, сообщений об эффективных антибактериальных препаратах, созданных на их основе, пока нет. Зато уже получены трансгенные растения, в которых встроен ген aiiA. Модифицированные таким способом картошка и табак намного устойчивее к инфекции, вызываемой Erwinia carotovora. Лактоназа AiiA сдерживает развитие «мягких гнилей», так как деградация растением AHL приводит к снижению активности бактериальных протеаз [14].

Ингибиторы рецепции сигнала («затычка»)

Итак, мы уже умеем заставить бактерию молчать, а также перехватывать сигналы, которые она посылает другим клеткам. А еще можно заставить бактерию не воспринимать посылаемые соседями сигналы. Для этого нам нужно ингибировать рецепцию за счет конкурентного связывания со специфическим сайтом рецептора. В случае AHL порой достаточно изменить (желательно в бόльшую сторону) длину ацильного хвоста сигнальной молекулы. Хвост можно сделать не только длиннее, но и жестче, обогатив его ненасыщенными связями. Также можно модифицировать и лактонные кольца молекул AHL [17]. Модифицированные индукторы могут быть как с широким, так и с узким спектром действия. Наибольшей избирательностью обладают производные сигнальных молекул АI-2. Нетоксичность их для клеток млекопитающих тоже является большим плюсом [18]. Некоторые исследователи, правда, сомневаются в их стабильности, в связи с чем предполагается использовать такие индукторы в виде эфирных производных или же в сочетании с другими ингибиторами QS [19].

Блокаторы природного происхождения

Не следует думать, что человек является в этой области первопроходцем. Системы бактериального общения уже давно служат мишенями для многочисленных природных соединений (рис. 2). Как и в случае природных антибиотиков, количество их огромно. О бактериальных лактоназах уже шла речь ранее. Ферменты животных (параоксаназы) также способны разлагать сигнальные молекулы. Однако в настоящее время наибольший спектр «антикворумных» препаратов получен именно из растений.

«Многочисленные природные соединения» в процессе эволюции научились выводить из строя и куда более сложные коммуникационные системы — например, нервную систему человека: «Яды — высокоточное оружие: компьютерное исследование природных нейротоксинов» [20]. — Ред.

Фураноны

Фураноны — вторичные метаболиты красной водоросли Delisea pulchra. Причем растение-продуцент использует их по прямому назначению: таллом водоросли защищен от бактериального обрастания именно благодаря этим веществам [21]. В настоящий момент многочисленные производные фуранонов уже синтезированы химически. Их спектр действия поистине впечатляет: они способны ингибировать системы как первого, так и второго типа у самых разных бактерий, в том числе и патогенных — например, у синегнойной палочки. Тем не менее механизм их действия по-прежнему остается загадкой. Если раньше полагали, что фураноны блокируют рецепцию по принципу молекулярной мимикрии [22], то теперь появились данные, указывающие на неконкурентное ингибирование сенсорного белка [23]. Это показано в частности для рецептора LuxR системы первого типа. Еще одно достоинство фуранонов — их повышенная стабильность по сравнению с теми же производными DPD. Однако, несмотря на ряд достоинств, перспектива применения фуранонов ставится под сомнение, так как есть указания на их цитотоксичность [24].

Ингибиторы QS, вырабатываемые высшими растениями

В последние 10 лет появилось огромное количество работ, в которых сообщается о том или ином растительном экстракте, обладающем избирательным эффектом против систем QS. В таких случаях достаточно проделать несложный эксперимент с биосенсором, чтобы проверить, обладает растительный экстракт QS-ингибирующей активностью или нет. Среди таких биосенсоров особенной популярностью пользуется штамм Chromobacterium violaceum CV026. Бактерии этого штамма вырабатывают сиреневый пигмент виолацеин, причем его синтез находится под контролем сигнальной системы QS первого типа. Штамм CV026 не способен производить собственные сигнальные молекулы (ген AHL-синтазы испорчен вставкой транспозона), но при наличии сигнальных молекул в питательной среде он продуцирует пигмент, окрашивая эту среду. Ингибиторную активность оценивают по образованию светлых зон при сохранении бактериального роста на чашке. Можно использовать и другие сенсоры — например, специально сконструированных светящихся мутантов E. coli, — а активность ингибитора отслеживать по снижению биолюминесценции.

С помощью биосенсора CV026 была показана «антикворумная» активность большого числа растительных экстрактов, в том числе съедобных растений (цитрусовых, черники, клюквы, ванили) [25], [26], лекарственных (розмарина, куркумы) и даже кофеина [27]! Интересно, что многие из исследуемых растений применяются в традиционной медицине. Может быть, именно способность «выключать» кворум делает их столь полезными?

Очень часто исследование заканчивается на этой стадии (по сути, скрининговой), однако в ряде работ были сделаны попытки выделить нужный компонент из неочищенного растительного экстракта. Из чесночного экстракта, например, выделили аджоен (ajoene, 4,5,9-тритиододека-1,6,11-триен 9-оксид), а из экстракта хрена — иберин [25]. Первое соединение обладает выраженным антимикробным эффектом. Оба вещества способны блокировать работу AHL-зависимых систем синегнойной палочки. Аджоен также обладает выраженным антимикробным действием по отношению к представителям родов Klebsiella и Xanthomonas [28]. Эффективность аджоена значительно возрастает в сочетании с антибиотиком тобрамицином.

«Антикворумная» прививка

Среди ингибиторов QS животного происхождения особый интерес представляют моноклональные антитела [29], полученные с применением гаптенов (полуантигенов — соединений, способных вызывать синтез антител только в связке с другой молекулой), содержащих лактамное кольцо. Было показано, что иммунизация мышей, зараженных синегнойной палочкой, бычьим сывороточным альбумином, связанным с сигнальной молекулой (3-оксододеканоилгомосеринлактоном), приводит к существенному увеличению их выживаемости [30]. На появление в организме иммунизированных мышей специфических «антикворумных» антител указывала более низкая концентрация сигнальной молекулы в их крови в сравнении с теми животными, которые не получили «антикворумной» прививки. Особенная польза такой прививки заключается в предотвращении QS-зависимого синтеза факторов вирулентности. Помимо связывающих антител, можно использовать и каталитические, то есть те, которые ускоряют реакции гидролиза молекулы-мишени. Для этого определенным образом модифицируют вводимый гаптен. Например, использование сульфонов, имеющих структурное сходство по принципу молекулярной мимикрии с промежуточным комплексом в реакциях гидролиза AHL, позволяет получать антитела с гораздо более высокой активностью [31]. Антитела можно использовать не только против системы первого типа. Например, Джунгук Парк с коллегами разработал гаптен AP4-5, «мимикрирующий» под сигнальный пептид AIP-4 золотистого стафилококка [32].

Заключение

Несмотря на то, что структура сигнальных молекул у некоторых бактерий до сих пор не ясна, механизм бактериальной коммуникации уже известен. Путем синтеза de novo и из природных материалов получено огромное количество соединений, способных блокировать бактериальное общение на самых разных стадиях. «Антикворумные» препараты многими рассматриваются как альтернатива антибиотикам , как новое поколение лекарств будущего. Будем же реалистами: пока лишь малая часть подобных препаратов прошла клинические испытания. Эффективность большинства из них подтверждена пока только в системах in vitro. Но огорчаться не стоит: по самым оптимистичным прогнозам, масштабное применение ингибиторов QS — вопрос двух ближайших десятилетий. И словосочетание «постантибиотическая эра» встречается в научных обзорах всё чаще.

Альтернативу антибиотикам или инструменты борьбы с устойчивостью к ним ищут в разных направлениях. Об одном из них — разработке пептидов-диверсантов — рассказывает статья «Антимикробные пептиды — возможная альтернатива традиционным антибиотикам» [33]. — Ред.

Литература

1. Li Y.H. and Tian X. (2012). Quorum sensing and bacterial social interactions in biofilms. Sensors (Basel). 12, 2519–2538;
2. Worthington R.J., Richards J.J., Melander C. (2012). Small molecule control of bacterial biofilms. Org. Biomol. Chem. 10, 7457–7474;
3. Xavier K.B. and Bassler B.L. (2005). Interference with AI-2-mediated bacterial cell-cell communication. Nature. 437, 750–753;
4. Asad S. and Opal S.M. (2008). Bench-to-bedside review: quorum sensing and the role of cell-to-cell communication during invasive bacterial infection. Crit. Care. 12, 236;
5. Brameyer S., Kresovic D., Bode H.B., Нeermann R. (2015). Dialkylresorcinols as bacterial signaling molecules. PNAS. 112, 572–577;
6. Parsek M.R, Val D.L., Hanzelka B.L., Cronan J.E. Jr, Greenberg E.P. (1999). Acyl homoserine-lactone quorum sensing signal generation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4360–4365;
7. Rasmussen T.B. and Givskov M. (2006). Quorum sensing inhibitors: a bargain of effects. Microbiology. 152, 895–904;
8. Hoang T.T. and Schweizer H.P. (1999). Characterization of Pseudomonas aeruginosa enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI): a target for the antimicrobial triclosan and its role in acylated homoserine lactone synthesis. J. Bacteriol. 181, 5489–5497;
9. Kavanaugh J.S., Thoendel M., Horswill A.R. (2007). A role for type I signal peptidase in Staphylococcus aureus quorum sensing. Mol. Microbiol. 65, 780–798;
10. Schweizer H.P. (2003). Efflux as a mechanism of resistance to antimicrobial sin Pseudomonas aeruginosa and related bacteria: unanswered questions. Genet. Mol. Res. 2, 48–62;
11. Dong Y.H., Xu J.L., Li X.Z., Zhang L.H. (2000). AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 3526–3531;
12. Sio C.F., Otten L.G., Cool R.H., Diggle S.P., Braun P.G., Bos R. et al. (2006). Quorum quenching by an N-acyl-homoserine lactone acylase from Pseudomonas aeruginosa PAO1. Infect. Immun. 74, 1673–1682;
13. Chan K.G., Atkinson S., Mathee K., Sam C.K., Chlhabra S.R., Camara M. et al. (2011). Characterization of N-acylhomoserine lactone-degrading bacteria associated with the Zingiber officinale (ginger) rhizosphere: co-existence of quorum quenching and quorum sensing in Acinetobacter and Burkholderia. BMC Microbiol. 11, 51;
14. Uroz S., Dessaux Y., Oger P. (2009). Quorum sensing and quorum quenching: the yin and yang of bacterial communication. ChemBioChem. 10, 205–216;
15. Krysciak D., Schmeisser C., Preuss S., Riethausen J., Quitschau M., Grond S., Streit W.R. (2011). Involvement of multiple loci in quorum quenching of autoinducer I molecules in the nitrogen-fixing symbiont Rhizobium (Sinorhizobium) sp. strain NGR234. Appl. Environ. Microbiol. 77, 5089–5099;
16. Roy V., Fernandes R., Tsao C.Y., Bentley W.E. (2010). Cross species quorum quenching using a native AI-2 processing enzyme. ACS Chem. Biol. 5, 223–232;
17. Hentzer M. and Givskov M. (2003). Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections. J. Clin. Invest. 112, 1300–1307;
18. Lowery C.A., Park J., Kaufmann G.F., Janda K.D. (2008). An unexpected switch in the modulation of AI-2-based quorum sensing discovered through synthetic 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione analogues. J. Am. Chem. Soc. 130, 9200–9201;
19. Guo M., Gamby S., Nakayama S., Smith J., Sintim H.O. (2012). A pro-drug approach for selective modulation of AI-2-mediated bacterial cell-to-cell communication. Sensors (Basel). 12, 3762–3772;
20. Яды — высокоточное оружие: компьютерное исследование природных нейротоксинов;
21. Zhang L.H. (2003). Quorum quenching and proactive host defense. Trends Plant. Sci. 8, 238–244;
22. Ren D., Sims J.J., Wood T.K. (2001). Inhibition of biofilm formation and swarming of Escherichia coli by (5Z)-4-bromo-5(bromomethylene)-3-butyl-2(5H)-furanone. Environ. Microbiol. 3, 731–736;
23. Koch B., Liljefors T., Persson T., Nielsen J., Kjelleberg S., Givskov M. (2005). The LuxR receptor: the sites of interaction with quorum-sensing signals and inhibitors. Microbiology. 151, 3589–3602;
24. Lonn-Stensrud J., Naemi A.O., Benneche T., Petersen F.C, Scheie A.A. (2012). Thiophenones inhibit Staphylococcus epidermidis biofilm formation at nontoxic concentrations. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 65, 326–334;
25. Jakobsen T.H, Bragason S.K., Phipps R.K., Christensen L.D., van Gennip M., Alhede M. et al. (2012). Food as a source for quorum sensing inhibitors: iberin from horseradish revealed as a quorum sensing inhibitor of Pseudomonas aeruginosa. Appl. Environ. Microbiol. 78, 2410–2421;
26. Musthafa K.S., Ravi A.V., Annapoorani A., Packiavathy I.S.V., Pandian S.K. (2010). Evaluation of anti-quorum-sensing activity of edible plants and fruits through inhibition of the N-acyl-homoserine lactone system in Chromobacterium violaceum and Pseudomonas aeruginosa. Chemotherapy. 56, 333–339;
27. Norizan S.N.M., Yin W.F., Chan K.G. (2013). Caffeine as a potential quorum sensing inhibitor. Sensors. 13, 5117–5129;
28. Jakobsen T.H., van Gennip M., Phipps R.K., Shanmugham M.S., Christensen L.D., Alhede M. et al. (2012). Ajoene, a sulfur-rich molecule from garlic, inhibits genes controlled by quorum sensing. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 2314–2325;
29. Моноклональные антитела;
30. Miyairi S., Tateda K., Fuse E.T., Ueda C., Saito H., Takabatake T. et al. (2006). Immunization with 3-oxododecanoyl-L-homoserine lactone-protein conjugate protects mice from lethal Pseudomonas aeruginosa lung infection. J. Med. Microbiol. 55, 1381–1387;
31. Kapadnis P.B., Hall E., Ramstedt M., Galloway W.R., Welch M., Spring D.R. (2009). Towards quorum-quenching catalytic antibodies. Chem. Commun. Camb. 5, 538–540;
32. Park J., Jagasia R., Kaufmann G.F., Mathison J.C., Ruiz D.I., Moss J.A. et al. (2007). Infection control by antibody disruption of bacterial quorum sensing signaling. Chem. Biol. 14, 1119–1127;
33. Антимикробные пептиды — возможная альтернатива традиционным антибиотикам.