Конкурс «био/мол/текст»-2013

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2013 в номинации «Своя работа».

---

Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Стабильно-изотопные дыхательные тесты

«Хотите узнать о своем здоровье? Выдохните в пробирку!» — так вам скоро скажет доктор, определяющий состояние вашего желудка, кишечника, печени, селезенки и многих других важнейших органов и систем организма. «Как же это — так просто?» — удивитесь вы. Да, и в скором времени вполне реально.

Есть такие способы диагностики самых разных заболеваний, при которых не надо глотать «кишку» (точнее — зонд), облучаться вредными лучами, отдавать драгоценную кровь (или другие жидкости) и надолго ложиться в больницу. Все просто, не больно, достаточно быстро и абсолютно безопасно.

Речь идет о медицинских дыхательных тестах. К примеру, в кабинете гастроэнтеролога вам дают выпить раствор препарата в соке и через 20 минут просят выдохнуть в пробирку. Все, больше от вас ничего не потребуется. Доктор тут же присоединит эту пробирку к прибору и сообщит результат: опаснейшая бактерия H. pylori у вас отсутствует.

Что же это за чудодейственный препарат? А это всем известная мочевина; правда, не совсем обычная. Вместо распространенного углерода ¹²С ее молекула содержит изотоп ¹³С, которого в природе немного — чуть больше 1%, но он есть везде, и в теле человека его около 200 граммов (рис. 1). Это так называемый стабильный изотоп углерода, который не распадается, ничего не излучает и отличается от «обычного» атома ¹²С только тем, что он чуть тяжелее — на один нейтрон.

С физикой покончили. А что касается химии, то ценность изотопа ¹³С как раз в том, что он совершенно не меняет химические свойства веществ, благодаря чему мы можем принимать ¹³С-препараты, ничего не опасаясь. Зато этот изотоп легко увидеть с помощью современных приборов, на чем и основана стабильно-изотопная диагностика: если гнусная H. pylori все же попала в ваш организм, да еще и активна (что бывает далеко не всегда), ее фермент (уреаза) быстро разлагает мочевину, образующийся СО₂ кровью переносится в легкие и удаляется с выдыхаемым воздухом. Выпив раствор ¹³С-мочевины, вы выдохните ¹³СО₂, что и увидит доктор на экране прибора. Кстати, этой ¹³С-мочевины всего-то и надо 1 мг на 1 кг вашего веса (рис. 2).

Вот такая диагностика. И никаких зондов (а дети с ними как мучаются!..). Но кроме перечисленных достоинств, эти методы обладают высочайшей точностью (до 100%) и специфичностью (т.е., поставленный диагноз будет однозначен). Именно благодаря этим достоинствам можно получить массу информации, например: как работает желудок (перистальтика), поджелудочная железа (хорошо ли усваиваются жиры), здорова ли печень (циррозы, гепатиты) и т.д. Можно даже определить угрозу появления опухолей (!) — достаточно вспомнить, что H. pylori может вызывать рак желудка (открытие этой бактерии и ее роли в возникновении болезней ЖКТ в 2005 г. было удостоено Нобелевской премии [1]). Нужно только иметь вполне определенные ¹³С-препараты (т.н. биомаркеры).

Как же обстоят дела в практической медицине? В цивилизованных странах такая диагностика применяется уже почти 20 лет и давно стала рутинной и массовой процедурой [2], [3]: только в США за год проводится 5–7 млн. ¹³С-дыхательных тестов. Врачи применяют все новые и новые ¹³С-биомаркеры, а исследователи расширяют список доступных препаратов.

В последние годы у нас в стране эти методы тоже получили развитие. Благодаря усилиям московских ученых и специалистов, такая диагностика разработана, и во много раз дешевле, чем «у них» — ведь она полностью основана на собственных, российских разработках, а также на нашем изотопном сырье, которого мы производим больше всех в мире. Участие в работе таких всемирно известных медицинских центров, как Российский Онкологический Научный Центр, НИИ Онкологии, ЦНИИ Гастроэнтерологии, институт им. Н.В. Склифосовского (НИИ Скорой Помощи) и даже ИМБП (ранее называвшийся Институтом Космической Медицины), обеспечило также создание принципиально новых методов диагностики опаснейших болезней (рак, язва, гастрит, цирроз). Осталось только официально зарегистрировать эти препараты.

Давайте более внимательно посмотрим на новые достижения российской науки.

Специалистам хорошо знаком мощный метод изучения лекарственных препаратов — «фармакокинетика». Тут нет ничего сложного: применительно к нашей теме, это наблюдение за изменением во времени содержания ¹³СО₂ в выдохе пациента после приема ¹³С-препарата. И именно этот метод современной диагностики позволяет судить не просто о наличии или отсутствии заболевания, но и о его степени (насколько оно «запущено»). Это тем более важно, что выявление болезней на ранней стадии часто является единственным условием излечения (таков, например, рак). Фармакокинетика позволяет с математической точностью определить стадию заболевания, характеристики больного органа, а значит, и указать правильный путь лечащему врачу или хирургу.

Вот, например, препарат метацетин, содержащий изотоп ¹³С (т.е. меченый метацетин). Он интересен тем, что разрушается печенью с выделением того же ¹³СО₂:

И оказалось, что фармакокинетические зависимости (как говорят, «кривые») ¹³С-метацетина позволяют с высокой точностью определить параметры печени, оценить степень ее детоксикационной активности (выведения токсинов) и даже массу, что чрезвычайно важно в послеоперационный период при частичном удалении этого жизненно необходимого органа. Математические модели, разработанные нашими учеными, позволяют различать все степени циррозов (а их четыре), гепатита, других заболеваний. По меткому выражению одного из специалистов ИМБП — «Раньше печень была черным ящиком, а теперь с помощью ¹³С-дыхательного теста мы не только диагностируем заболевание, но и видим, как работают ее ферментные системы». Не правда ли, здесь комментарии излишни? И все это возможно без использования сложного, громоздкого и дорогостоящего оборудования.

Кстати, об оборудовании. Сейчас стали весьма известны медицинские томографы (МРТ), в том числе, вследствие их немалой цены. Так вот, для ¹³С-дыхательных тестов такие приборы не нужны, не нужны и соответствующие помещения, и меры защиты (там ведь магнитные поля). Нужен всего лишь стол, на котором стоит небольшой анализатор — инфракрасный или масс-спектрометрический. А в состав тест-набора входит трубочка и две пробирки (или мешочка) для выдыхаемого воздуха (рис. 4). И все.

За рубежом такие приборы тоже давно выпускаются . Но мы же говорим об отечественной ¹³С-диагностике, поэтому нам нужны свои — чем мы хуже?! Нет, мы вовсе не хуже, и такой анализатор, пригодный для массовой диагностики населения, у нас разработан, изготовлен и испытан (рис. 4). Он имеет ничуть не худшие характеристики, чем зарубежные. И, конечно, он будет дешевле.

В основном применяются ИК-анализаторы (IRIS-2, UBiT IR-300, HeliFAN, POCone, The Oridion BreathIDR) [3] и масс-спектрометры (HeliView, IsoPrime), а также опттогальванический спектрофотометр LARA. Тест-наборы включают: емкость с ¹³С-мочевиной; пробирки, уплотненные мягкой пластиковой пробкой (или герметизируемые пакетики); трубочку для выдыхаемого воздуха (рис. 4); и инструкцию по применению препарата. Чувствительность современных изотопных масс-спектрометров позволяет определять 1000 молекул СО₂ в пробе анализируемого газа, т.е. величину порядка 10^–17% об. при анализе 1 мл газа (выдыхаемый воздух содержит ~0,04% об. ¹³СО₂).

Кроме уже упомянутых ¹³С-мочевины и ¹³С-метацетина, давайте посмотрим на далеко не полный список диагностических ¹³С-препаратов, появившихся (но пока не зарегистрированных) в нашей стране в результате проведенных работ (кстати, эти работы проводились в 2007–2012 годах; впервые в России [5] ). Вот препараты с одной меткой ¹³С: октаноат натрия и 1-¹³С-каприловая кислота применяются для диагностики перистальтики желудка и синтеза других ¹³С-препаратов; бикарбонат натрия — для определения кислотности в желудке, выявления опухолей, гиперкапнии (легочное заболевание, вызываемое повышением уровня углекислого газа в крови), изучения энергетического обмена в организме и назначения диет питания; тимидин и глюкоза — для диагностики опухолей (индикаторы роста раковых клеток); формиат натрия — для диагностики функции печени (рис. 5).

Работы выполнялись на основании многолетней научно-технической программы Правительства Москвы по теме «Новые методы и технологии ранней диагностики онкологических и других опасных заболеваний» под руководством Научного и клинического центра «Интермедбиофизхим». Работы были инициированы специалистами научно-технической компании «Ростхим», являвшейся головной организацией по разработке методов синтеза ¹³С-продуктов для стабильно-изотопной диагностики и иных областей [5]. В работах принимали участие 16 научных организаций Москвы, включая институты РАН, РАМН, вузы и ГНЦ.

С помощью ¹³С-глюкозы можно также легко диагностировать диабет: у этих пациентов глюкоза не разлагается, и ¹³СО₂ не выделяется. Но если биомаркер содержит две или более меток ¹³С, чувствительность определения будет выше; это характерно для ¹³С₃-триоктаноина (с тремя атомами ¹³С), применяемого для диагностики усвояемости жиров поджелудочной железой. Кроме того, «полимеченые» ¹³С-препараты используют не только для дыхательных тестов. И здесь мы подошли к очень интересной, совершенно новой тематике, открывающей далекие горизонты в изучении живых организмов и, конечно, в диагностике опаснейших заболеваний, которые не дают покоя человечеству и все еще уносят множество жизней: различные виды рака, болезни Альцгеймера, Канавана, заболевания кровеносных сосудов, эндокринной и других систем.

¹³С-Магниторезонансная диагностика

Давно известно, что в живых организмах постоянно происходит обмен веществ — то, что на языке специалистов называется общим термином «метаболизм», который определяет концентрации участвующих в нем метаболитов. В здоровом теле (как и в его клетках) — одни значения концентраций, но если клетки трансформируются, и начинается рост опухоли, или возникают другие недуги, уровни метаболитов существенно изменяются. Однако обнаружить эти изменения весьма и весьма непросто, поскольку организм — сложнейшая биохимическая система и содержит огромное число самых разнообразных веществ, которые, к тому же, нужно еще суметь проанализировать (вспомните хотя бы, сколько стоит биохимический анализ крови).

Но выход был найден с помощью того же изотопа ¹³С. Физикам и химикам уже давно известно, что ядро этого изотопа — миниатюрный магнитик (т.е. оно имеет магнитный момент), который будет сразу обнаружен, если его внести в магнитное поле (как стрелка компаса в поле Земли). Это свойство веществ, меченных изотопом ¹³С, давно используется в науке для определения их строения, превращений и для решения многих других полезных задач (метод ¹³С-ЯМР). Поэтому ясно, что если «пометить» наши метаболиты изотопом ¹³С, их можно будет не только «засечь», но и определить концентрации, — что и необходимо для диагностики [6]. Но как это сделать, не причинив вреда пациенту? Очень просто: нужно ввести в его организм какой-либо «естественный» ¹³С-биомаркер, принимающий участие в обмене веществ — например, ¹³С-глюкозу. Тогда вскоре, в результате обмена, метка ¹³С перераспределится между другими метаболитами (рис. 6), и мы сможем измерить их содержание с помощью хроматомасс-спектрометрии или уже известных томографов.

Да, в данном случае без томографов не обойтись. Но это гораздо дешевле и безопаснее, чем использовать, например, метод ПЭТ (позитронно-эмиссионную томографию), в котором применяются радиоактивные вещества, необходимы синхротроны (занимают целое помещение) и часто имеются жесткие ограничения по времени, поскольку радиофармпрепараты быстро распадаются и теряют свою активность.

Один из самых уважаемых в мире журналов — Science — в мае 2012 г. опубликовал данные о скорости процессов поглощения и выделения 111 различных метаболитов для 60 видов опухолей [7] (рис. 7). Проанализировав этот большой материал, специалисты установили, каким видам опухолей соответствуют те или иные соотношения метаболитов. Появились даже так называемые «карты метаболитов» (или SIDMAP — Stable Isotope-based Dynamic Metabolic Profiling) [6]. Например, скорости выделения аденозина клетками с меланомой (рак кожи и слизистых) на порядок выше, чем у клеток с лейкемией (рак крови); а для другого метаболита — орнитина — эта скорость в сотни раз больше, чем у аденозина для всех видов опухолей.

При раке легких в пораженных клетках, в отличие от здоровых, наблюдаются очень высокие концентрации молочной и янтарной кислот, а также глутаминовой и некоторых других аминокислот, тогда как концентрации глюкозы понижены (рис. 8) [8]. Установлены «характеристические» значения уровней метаболитов для рака груди, мозга, печени, толстой кишки, яичников, простаты. Многие из этих результатов получены именно с помощью спектроскопии магнитного резонанса на ядрах ¹³С (¹³С-ЯМР), которые оказались весьма информативны для диагностики заболеваний на основе анализа состава ¹³С-метаболитов.

Эти работы открывают большие перспективы для диагностики опухолей ¹³С-магниторезонансным методом. Уже опубликованы результаты клинического применения такой диагностики. Так, записывая сигналы ¹³С-ЯМР ¹³С-креатина и ¹³С-холина после введения пациенту ¹³С-глюкозы, удалось получить четкое изображение опухоли мозга (глиобластомы) на обычной томограмме, где эта опухоль не видна (рис. 9а) [9]. Но такие работы пока еще редкость: значительно больше исследований выполняется на животных (крысы, мыши, собаки) (рис. 9б) [10]. Специальная математическая обработка сигналов ¹³С-ЯМР меченых метаболитов позволяет получать цветные изображения опухолей, что значительно облегчит работу врача.

В настоящее время конструируются датчики для обследования человека — например, в форме подголовника для исследования мозга (рис. 10) [11], изучаются режимы записи резонансных сигналов, разрабатываются методики введения ¹³С-препаратов — как внутривенно, так и путем обычного приема внутрь в виде таблетки, раствора и т.п. Добавим, что для записи спектров ¹³С-ЯМР используют обычные серийные томографы. И недалеко время, когда мы сможем «увидеть» в организме то, что не под силу обычному МРТ, не прибегая к рентгеновским лучам, радиоактивности или иным «сильным» (а порой и разрушительным) воздействиям.

Но в основе этих новейших спасительных методов, о которых мы рассказали, лежат вещества с изотопом ¹³С, без которых такая диагностика невозможна. Россия обладает уникальными возможностями: крупнейшим в мире производством изотопов, готовыми к внедрению процессами получения ¹³С-продуктов и приборами для медицинской диагностики, новейшими методиками проведения ¹³С-изотопных дыхательных тестов. Нужно использовать это богатство. Иначе все эти услуги придется покупать, а последствия нам хорошо известны.

И в заключение — еще два интересных момента.

Уже более десяти лет публикуются работы о грандиозном увеличении чувствительности ¹³С-магниторезонансной диагностики, если использовать так называемую процедуру гиперполяризации магнитных моментов ядер ¹³С. Не вдаваясь в подробности, отметим только, что при этом значительно возрастает доля ядер ¹³С, ориентирующих свою «стрелку» вдоль магнитного поля, что приводит к увеличению интенсивности сигнала в 10 000–100 000 раз! (рис. 11) [12]. А в этом случае можно получать уже не только спектры, чтобы потом накладывать их на снимки МРТ, а столь же качественные снимки внутренних органов, порой даже превосходящие по качеству обычные снимки МРТ (рис. 11) [13]. Метод активно развивается (за рубежом), при этом даже используются современные российские устройства, в частности, СВЧ-генератор ELVA-1 из Санкт-Петербурга [14].

Наконец, необходимо сказать и о том, что не только медикам нужны препараты с изотопом ¹³С. Их широко используют в криминалистике, судебно-медицинской экспертизе, космической медицине, антидопинговом контроле, экологии, геологии, геофизике, изучении биосинтеза, при защите патентных прав на химические технологии, в изучении механизмов химических реакций, процессов эволюции живых организмов и других научных исследованиях, в производстве стандартных образцов — везде, где необходимы маркеры и можно отказаться от опасных радиоактивных изотопов. Все это стало возможным благодаря новейшим достижениям методов изотопного анализа и органического синтеза. При этом вслед за ¹³С обязательно придет очередь других стабильных изотопов (см. подзаголовок статьи) — ¹⁰B, ¹¹B, ²⁸Si, ³³S, обладающих другими ценными свойствами. Однако суть этих методов — темы отдельных статей.

Литература

1. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2005;
2. Рапопорт С.И., Шубина Н.А., Семенова Н.В. ¹³С-Дыхательный тест в практике гастроэнтеролога. М.: «ИД-МЕДПРАКТИКА-М», 2007. — 136 с.;
3. Anil S Modak. (2007). Stable isotope breath tests in clinical medicine: a review. Journal of Breath Research. 1, 014003;
4. Артемов В.М., Баранов В.Ю., Невмержицкий В.И. (2003). «Способ измерения отклонения отношений концентраций двух компонент газовой смеси от заданной величины». Патент РФ № 2216724;
5. История ООО «Ростхим». Сайт «Ростхим»;
6. László G. Boros, Natalie J. Serkova, Marta S. Cascante, Wai-Nang Paul Lee. (2004). Use of metabolic pathway flux information in targeted cancer drug design. Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies. 1, 435-443;
7. M. Jain, R. Nilsson, S. Sharma, N. Madhusudhan, T. Kitami, et. al.. (2012). Metabolite Profiling Identifies a Key Role for Glycine in Rapid Cancer Cell Proliferation. Science. 336, 1040-1044;
8. Teresa WM Fan, Andrew N Lane, Richard M Higashi, Mohamed A Farag, Hong Gao, et. al.. (2009). Altered regulation of metabolic pathways in human lung cancer discerned by 13C stable isotope-resolved metabolomics (SIRM). Molecular Cancer. 8, 41;
9. A. Gregory Sorensen. (2006). Magnetic Resonance As a Cancer Imaging Biomarker. JCO. 24, 3274-3281;
10. John Kurhanewicz, Daniel B. Vigneron, Kevin Brindle, Eduard Y. Chekmenev, Arnaud Comment, et. al.. (2011). Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research. Neoplasia. 13, 81-97;
11. Brian Ross, Alexander Lin, Kent Harris, Pratip Bhattacharya, Brian Schweinsburg. (2003). Clinical experience with13C MRSin vivo. NMR Biomed.. 16, 358-369;
12. Sven Månsson, Edvin Johansson, Peter Magnusson, Chun-Ming Chai, Georg Hansson, et. al.. (2006). 13C imaging—a new diagnostic platform. Eur Radiol. 16, 57-67;
13. K. Golman, J. H. Ardenkjaer-Larsen, J. S. Petersson, S. Mansson, I. Leunbach. (2003). Molecular imaging with endogenous substances. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 10435-10439;
14. J. H. Ardenkjaer-Larsen, B. Fridlund, A. Gram, G. Hansson, L. Hansson, et. al.. (2003). Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 10158-10163.