Отставание учёных легко объяснимо — у них нет в запасе многих миллионов лет, бывших в распоряжении эволюции. Создание новых ферментов, основанное на наших знаниях структуры белковых молекул и механизмов химических реакций, пока приводит к довольно скромным результатам. Принципы, по которым аминокислотная последовательность белков определяет их структуру и каталитические свойства, не понятны нам до конца, и поэтому, все ещё не могут применяться на практике должным образом. Впрочем, существует возможность обойти эту трудность, симулируя эволюцию in vitro. В последнем номере журнала Nature исследователи Зеелиг (Burkhard Seelig) и Шостак (Jack W. Szostak) описывают подобный подход, который позволил им получить новый фермент, соединяющий вместе концы двух фрагментов РНК [1].

Вообще говоря, получение новых ферментов с нужными свойствами — задача большой практической важности. Такие высокоэффективные катализаторы, каковыми являются ферменты, всегда востребованы современной биотехнологией, химической и фармацевтической промышленностью. Например, «дизайнерский» фермент может катализировать реакцию синтеза нужного лекарства.

Существует несколько методов получения новых ферментов. Один подход состоит во внесении случайных изменений в аминокислотную последовательность существующих природных ферментов (рандомизация) с последующим «искусственным отбором» (селекцией) in vitro. Этот подход приносит неплохие результаты, но ограничивается относительно небольшим числом возможных исходных вариантов (10⁶–10⁸, при желаемом 10¹²).

Альтернативный метод использует иммунную систему организма, создающую начальное разнообразие и осуществляющую естественный отбор, и, тем самым, создающую каталитические антитела (абзимы, от англ. abzyme, antibody и enzyme). Один из механизмов работы катализаторов, ферментов в частности — связывание и стабилизация переходного состояния (уже не субстрат, но ещё не продукт) катализируемой химической реакции. Таким образом, если антитело связывает молекулу с пространственной структурой, похожей на структуру переходного состояния, то оно может катализировать и соответствующую реакцию. Но для получения каталитических антител необходимо детальное знание механизма реакции, а также возможность синтезировать вещество, имитирующее переходное состояние — условия, выполняющиеся не часто.

Абзимы можно считать искусственно полученными ферментами, поскольку их создание опирается на знание механизма реакции. Но само «изготовление» конкретных каталитический антител происходит полностью in vivo, в результате чисто генетических перестроек, дающих огромное количество исходных вариантов антител, и процесса иммунной селекции. Абзимы обычно способны увеличивать скорость химических реакций в 10⁴–10⁶ раз, но для природных ферментов это весьма скромный показатель. Дело в том, что стабилизация переходного состояния — это лишь один из нескольких способов катализа, используемых ферментами.

В отличие от искусственно созданных белков-катализаторов, природные ферменты возникли в процессе эволюции в результате естественного отбора, который напрямую опирается на взаимодействие фермента с субстратом и продуктом реакции, и лишь опосредованно — с переходным состоянием. В статье Зеелига и Шостака как раз и применён подход, имитирующий естественный отбор, позволивший этим учёным получить новый фермент, катализирующий реакцию образования ковалентной связи между двумя фрагментами РНК — РНК-лигазу.

Метод, который они использовали, носит название «мРНК дисплей» [2]. Главная особенность метода заключается в том, что белки, проверяемые на наличие каталитической активности, ковалентно связаны каждый с мРНК, которая их и кодирует. Отбор функциональных белков осуществляется из in vitro транскрибируемой и транслируемой библиотеки кДНК, содержащей более 10¹² различных последовательностей. В данном случае использовалась синтетическая кДНК-библиотека, состоящая из последовательностей домена человеческого рецептора ретиноидной кислоты (RXR альфа), в котором две петли были заменены на сегменты по 12 и 9 случайных аминокислотных остатков. Домен содержит два «цинковых пальца», мотив, содержащийся в белках, связывающих нуклеиновые кислоты.

Библиотека кДНК была транскрибирована in vitro и тем самым превращена в набор соответствующих молекул мРНК, которые затем транслировались in vitro с образованием мРНК-белковых гибридных молекул. Эти молекулы использовались в качестве матриц для реакции обратной транскрипции с затравкой (праймером), слитой с 3′-концом 5′-трифосфорилированного фрагмента РНК (PPP-субстратом). В результате чего получали библиотеку мРНК-кДНК дуплексов с ковалентно связанным белком и субстратом. Далее, эта библиотека инкубировалась в присутствии биотинилированного олигорибонуклеотида (HO-субстрата) и комплементарного обеим субстратам олигонуклеотида (молекулярной «шины»). Белки, которые были способны катализировать образование связи между двумя субстратами (лигирование РНК), ковалентно присоединяли остаток биотина к собственной комплементарной ДНК, которая отделялась от всего остального при отмывке за счёт взаимодействия биотина со стрептавидином, иммобилизованном на твердофазной агарозной матрице. После отмывки, кДНК снималась с матрицы после расщепления светочувствительной вставки между HO-субстратом и остатком биотина. На последнем этапе селекционного цикла, кДНК амплифицировали при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакциии). Полученный материал далее использовался в качестве исходного для следующего цикла.

Чтобы имитировать изменчивость за счёт случайных мутаций и перестроек, как это происходит в природе, после 8-го раунда селекции кДНК подвергли рекомбинации (расщепление эндонуклеазой рестрикции с последующим случайным соединением фрагментов ДНК-лигазой), а затем, «склонной к ошибкам» ПЦР-амплификации (вместо обычной, берётся ДНК-полимераза, неточно копирующая молекулы ДНК).

После этого раунды селекции были продолжены до 17-ого цикла, в ходе которых давление отбора постепенно усиливалось за счёт уменьшения времени реакции образования связи, катализируемой отбираемыми белками.

В результате, авторы статьи [3] создали и изолировали новый фермент — РНК-лигазу. Не известно ни одного природного фермента, способного катализировать лигирование 5′-трифосфорилированного РНК-олигонуклеотида и 3′-концевой гидрокси-группы другой молекулы РНК — реакцию описанную в данной статье. Например, фермент, катализирующий сходную реакцию, РНК-лигаза фага Т4, соединяет 3′-гидрокси-группу и 5′-монофосфорилированную РНК, с одновременным превращением АТФ в АМФ и неорганический фосфат и образованием промежуточного соединения — АМФ, ковалентно связанного в активном центре лигазы. Реакция, катализируемая «дизайнерской» лигазой, скорее напоминает удлинения цепи на один нуклеотид во время РНК-полимеризации: в обоих случаях растущая цепь и трифосфат-содержащий субстрат спариваются азотистыми основаниями с матрицей; 3′-гидроксил растущей цепи атакует альфа-фосфат 5′-трифосфатной группы; наконец, в результате образования связи высвобождается пирофосфат.

Хотя белки и оказались более приспособлены для того, чтобы стать превосходными ферментами в ходе естественного отбора, миллиарды лет назад жизнь, возможно, начиналась с РНК-ферментов, рибозимов (от англ. ribozyme, ribonucleic acid и enzyme), составляющих гипотетический мир РНК, предшествовавший современному миру белков и ДНК. Реакция лигирования РНК занимает особое место для тех, кто изучает эволюцию жизни из мира РНК, поскольку она является существенным этапом процесса саморепликации РНК. Шостак и Дэвид Бартэл (David Bartel) были первыми, кто в 1993 году получили рибозим лигазу методом искусственного отбора in vitro [4]. Тот подход послужил прототипом метода in vitro эволюции рибозимов, и был адаптирован для белковых ферментов в последней статье Зеелига и Шостака.

Литература

1. Burckhard Seelig, Jack W. Szostak. (2007). Selection and evolution of enzymes from a partially randomized non-catalytic scaffold. Nature. 448, 828-831;
2. R. W. Roberts, J. W. Szostak. (1997). RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 12297-12302;
3. Burckhard Seelig, Jack W. Szostak. (2007). Selection and evolution of enzymes from a partially randomized non-catalytic scaffold. Nature. 448, 828-831;
4. D. Bartel, J. Szostak. (1993). Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences [see comment]. Science. 261, 1411-1418.