Конкурс «био/мол/текст»-2018

Эта работа опубликована в номинации «Биофармацевтика» конкурса «био/мол/текст»-2018.

---

Партнер номинации — медицинская компания «Инвитро».

---

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Биотехнология vs. Химия

Существует несколько способов получения биологически активных веществ (БАВ), однако наибольшее значение в промышленном масштабе имеют химический и биотехнологический.

Под химическим синтезом понимают так называемый тонкий органический синтез. Он имеет следующие особенности:

• многостадийность;
• необходимость очистки продукта;
• небольшой выход (то есть получение небольшого объема продукта в ходе химических реакций);
• высокая стоимость продуктов синтеза;
• возможность автоматизации процесса.

Основой для синтеза БАВ биотехнологическим способом являются биообъекты: вирусы, грибы, бактерии, растительные или животные клетки, а также биомолекулы, обладающие различными физиологическими свойствами. Особенности этого способа следующие:

• сложность работы с питательными средами (многокомпонентность, обеспечение стерильности при сохранении качеств среды);
• трудности в управлении биосинтезом (например, неожиданные мутации могут привести к непредвиденному изменению биотехнологического процесса);
• сложность автоматизации.

Однако применение микробиологического синтеза значительно облегчает процесс создания БАВ за счет следующих факторов:

• простота организации генома бактерий;
• легкая приспосабливаемость бактерий к среде обитания;
• высокие скорости протекания бактериальных ферментативных реакций при низких температурах (20–60 °C);
• быстрое увеличение клеточной массы [1].

Кажется, что корпеть день и ночь над живым объектом намного сложнее, чем разработать технологию автоматического химического синтеза, однако выход и чистота продукта тоже вещи очень важные.

Казалось бы, все ясно: микробиологический синтез сегодня более предпочтителен для пищевой и фармакологической промышленностей, где особенно требуется чистота получаемого вещества, однако существует удобный инструмент, объединяющий в себе биологическую точность и химическую простоту, о котором-то и пойдет речь далее.

Химические штучки

Клик-химия (click chemistry, от англ. click — «щелчок») — набор химических реакций, приспособленных для быстрого и надежного получения разнообразных химических веществ путем соединения между собой относительно небольшого количества маленьких элементов (рис. 1) [2].

Предложенная в начале 20 столетия американским химиком Барри Шарплессом клик-химия была исходно задумана как подражание природе, которая создает большие биомолекулы из маленьких частей. Концепция клик-химии заключается в модульности и простоте химических реакций: никаких сложных условий протекания, большой выход и избирательность процесса делают клик-химию удобным инструментом для проведения различных медико-биологических манипуляций.

Клик-химия — это не конкретная реакция, это концепция, под которую в настоящее время подходит широкий ряд химических превращений, открытых еще до появления такого понятия. В области химии биополимеров под клик-реакцией обычно принято понимать взаимодействие азидов с алкинами, приводящее к получению замещенных триазолов (рис. 2).

В этой статье я постараюсь описать, как именно клик-химия нашла свое применение в медицине и биологии, мы пробежимся по широкому ряду подходов к синтезу лекарств и созданию диагностических методик, а также поймем, что даст клик-химия рядовым научным сотрудникам.

Синтез пептидомиметиков

Пептидомиметики — это вещества небелковой природы, имеющие такие же функциональные фрагменты, как и конкретный пептид, а потому обладающие такой же активностью [3]. Пептидомиметики обычно «притворяются» пептидом, являющимся лигандом какого-то рецептора — молекулярной мишени, на которую должно действовать изобретаемое нами лекарство. Отличительная черта пептидомиметика по сравнению с обычным пептидом — бóльшая устойчивость к агрессивным средам, а также хорошая растворимость в воде (рис. 3). Как говорится, тот же пептид, только лучше.

Изменение фармакокинетических свойств вещества происходит благодаря изменению его структуры, что непосредственно влияет на активность вещества. Именно поэтому такие изменения должны производиться с «наименьшими потерями». Для этой цели идеально подходят клик-химические реакции.

Например, в недавнем исследовании таким образом видоизменили антимикробный пептид низин, являющийся лигандом липида-II плазматической мембраны бактерий (рис. 4) [4]. Липид-II выполняет роль переносчика пептидогликановых строительных белков с внутренней стороны клеточной мембраны на наружную, где эти белки встраиваются в клеточную стенку. При этом липид-II — «дефицитная» молекула, а потому вещества, нацеленные на ее захват, не оставляют бактерии шансов на выживание [5], [6]. К таким веществам относят и низин, однако как антибиотик его использовать не получается из-за быстрого расщепления в организме человека, а также потому, что его невозможно запатентовать: это вещество известно уже почти сто лет, и давно используется не в медицине, а в... пищевой промышленности — как консервант.

Получение пептоида на основе низина отвечает всем требованиям клик-химических реакций, делая его более фармакокинетически удобным для применения. Более того, новое вещество уничтожает золотистого стафилококка, чего уже нельзя сказать о природном низине. Изучение нового вещества и испытание его на других штаммах бактерий будет вестись и дальше.

Еще одним видом пептидомиметиков можно назвать пептид-олигонуклеотидные конъюгаты. Суть в том, что для подавления экспрессии генов обычно применяют искусственно созданные антисмысловые олигонуклеотиды, которые связываются с участками мРНК клетки по принципу комплементарности. К сожалению, самостоятельно эти олигонуклеотиды пробраться в клетку не могут. На помощь им приходят пептиды, проникающие через клеточную мембрану [7]. Пептид-олигонуклеотиды рассматриваются, как потенциальные высокоселективные мембранотропные регуляторы экспрессии генов, и простота проведения клик-реакции наряду с высокими выходами конденсации сделали этот метод одним из наиболее популярных для синтеза таких соединений [8].

Микрокликочип

Даже при изготовлении ДНК-микрочипов пригодилась клик-химия! Такие чипы представляют собой маленькие пластинки, на которые нанесены фрагменты ДНК известной последовательности (рис. 5).

С помощью этих устройств изучают экспрессию генов и производят поиск мутаций [9]. Кстати, если вы хотите больше узнать про ДНК-микрочипы — на «Биомолекуле» есть отдельная тема, посвященная этому замечательному изобретению.

Как и большинство современных биоаналитических методов, технология ДНК-чипов основана на использовании гетерофазных систем. На данный момент, клик-иммобилизация олигонуклеотидов на подложке позволяет получать воспроизводимую плотность молекул в поверхностном слое, а также разрабатывать новые высокотехнологичные методы по сборке чипов. Одним «но» является Cu(I) — катализатор данной реакции, а заодно — так уж получилось — разрушитель нуклеиновых кислот [10]. Чтобы справиться с этой проблемой, либо применяют хелатирующие лиганды, либо обходятся без меди как таковой [11]. Однако о сравнимой с Cu(I) каталитической активности говорить еще рано.

CuAAC-иммобилизация, под приставкой «клик» здесь и далее имеется в виду реакция азид-алкинового циклоприсоединения, если не указано другое.

ДНК не по канону

Если вы представляете ДНК как линейную двухцепочечную молекулу, то вам просто необходимо бросить всё и начать читать потрясающую статью на «Биомолекуле» [12], где рассказывается, что еще ДНК способна вот на что: шпильки, кресты, тройные и четверные спирали, организованные различным образом, — сплошной бодипозитив (рис. 6 и 7).

Особенно активно в последнее время изучают G-квадруплексы — структуры, представляющие собой спирали из четырех нитей ДНК или РНК, соединенных одними только гуанинами (рис. 8).

Интересны такие структуры из-за частой встречаемости в геноме и возможных применений в биологии. Считается, что G-квадруплексы образуются в области теломер, тем самым стабилизируя ДНК, а присутствие квадруплексов в промоторных регионах обеспечивает регуляцию экспрессии генов.

Изучение структуры квадруплексов на данный момент проводят с помощью ЯМР-спектроскопии [13], однако это довольно трудоемко и не всегда информативно. Альтернативным методом анализа является клик-лигирование. Например, благодаря клик-реакции показали возможность образования ДНК/РНК-квадруплексов в последовательности теломер человека (рис 9).

Такая реакция проводилась в отсутствии катализатора, а значит, лигирование могло происходить только за счет пространственной близости теломерных олигомеров азидных и алкиновых групп, что и подтверждало наличие G-квадруплексов [14].

Что там у нас в клетке?

Традиционные методы контроля синтеза ДНК предлагают применение радиографических и иммунологических методик диагностики. Однако данные способы контроля имеют ряд недостатков: радиографический — трудоемкий, а в результате получаются микрофотографии с очень низким разрешением; иммунологический, в свою очередь, требует жестких условий проведения контроля. Клик-метод позволяет снять все эти ограничения.

В данном случае изучение внутриклеточных процессов с участием нуклеиновых кислот in vivo проводят при помощи клик-маркирования ДНК. Этот метод очень избирателен и дает возможность вводить функциональные группы в нуклеиновые кислоты прямо во время их ферментативного синтеза. Например, таким образом проводится контроль синтеза ДНК в активно делящихся клетках. Суть метода заключается во встраивании в растущие цепи ДНК аналога тимина, а затем инкубации образца с азидсодержащими флуорофорами, то есть маркирование [15]. Данные флуорофоры с азидогруппами легко проникают в клетку, а сам метод не требует фиксации или денатурации ДНК (рис. 10).

Поделки из ДНК

Такие структуры как катенаны также могут быть созданы с помощью клик-химических превращений. Особенность подобных веществ — отсутствие химической связи между их циклическими «мономерами»: один цикл просто продевается через другой, образуется по сути механическая связь. Кстати, не так давно даже нашли фермент, имеющий такое строение [16].

Клик-синтезированные катенаны представляют из себя триазолсодержащие ДНК-наноструктуры, что позволяет называть их синтетическими плазмидами (рис. 11) [17].

Однако их биологическая роль еще изучена недостаточно. Возможно, что они будут обладать бóльшей устойчивостью к экзонуклеазам in vivo [18].

Другим примером клик-сборки наноструктур являются клетки с олигонуклеотидными последовательностями на поверхности. Как нетрудно догадаться, такие клетки способны к ассоциации за счет комплементарности нуклеотидных последовательностей. Клетки, собранные таким образом вместе, по сути, представляют собой трехмерную ткань с функционально обусловленной клеточной совместимостью. Существует несколько достаточно эффективных методов, позволяющих прикреплять олигонуклеотиды к поверхности клетки, например, аффинная иммобилизация олигонуклеотидов со стрептавидином за счет взаимодействия с биотинилированными мембранными белками [19], [20]. Подобная методика является отличным подспорьем для тканевой инженерии, где актуален предмет создания межклеточных контактов.

Древообразные молекулы

Речь, конечно же, идет о дендримерах — макромолекулах, которые имеют симметричное и регулярное «ветвление» своих частей (рис. 12).

Такие молекулы имеют довольно большое число ветвлений, часто даже бóльшее, чем у современных промышленных полимеров [21]. Обычно дендримеры получают из мономеров, проводя последовательные конвергентную и дивергентную полимеризации. Контролируемые размеры и свойства поверхности, а также стабильность дендримеров делают их весьма перспективными для использования в качестве переносчиков лекарств (рис. 13) [22].

Удобным и быстрым способом получения дендримеров является клик-лигирование. Например, молекулы азидотимидина, соединенные алкильными линкерами, обладают антибактериальной активностью и потенциальным пролонгированным действием [23].

Благодаря клик-реакциям практически нет ограничений для синтеза сложных молекул: несимметричные, гибридные, содержащие регулярные линейные группы, многослойные, функционализированные на концах дендримеры — все они синтезируются за один клик [24].

Подобные дендримерные структуры обязательно найдут свое применение в таких высокоценных областях, как таргетная доставка лекарств, тканевая инженерия, создание маркеров для диагностической визуализации и многое другое. Например, австралийская нанобиотехнологическая компания StarPharma разработала вагинальный гель, предотвращающий проникновение ВИЧ в организм человека половым путем. Активное вещество представляет из себя полилизиновый дендример, «украшенный» нафталиндисульфонатом по периферии [25].

Фармацевтическая помощница

Антибиотикорезистентные бактерии наступают, и нужны новые способы борьбы с ними. В настоящее время используются пептиды, нацеленные на разрушение бактериальных мембран. А что если сделать антибактериальный препарат из сахара? И это возможно благодаря клик-химии!

Предметом для модификации в недавнем исследовании выбрали циклодекстрин. Ученые заметили, что гамма-циклодекстрин содержит восемь D-глюкозных остатков, создающих структуру усеченного конуса диаметром около 1 нм, причем аналогичной структурой обладает и полимиксин B, пептидный антибиотик (рис. 14).

«Кайма» конуса была клик-химически модифицирована алкиламиногруппой так, чтобы взаимодействовать с мембраной бактерий наилучшим образом. И действительно, модифицированный циклодекстрин проявил высокую активность против многих штаммов бактерий (Bacillus subtilis, Streptococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium и другие). Таким же образом были модифицированы и некоторые другие сахара, также проявившие разную по интенсивности антибактериальную активность. Исследования в этой области еще только начались, но, возможно, полученные вещества смогут стать альтернативой привычным антибиотикам [26].

Заключение

За последнее десятилетие клик-химия показала себя как очень удобный инструмент решения важных проблем биологии и медицины. На данный момент разрабатываются новые противораковые, антимикотические и антибактериальные препараты, и, создаваемые с помощью клик-химических методик, они смогут стать достойной заменой современным лекарствам, а также, что немаловажно, позволят снизить экономические затраты на производство как таковое.

Более того, простота клик-химических превращений позволит выполнять их людям даже без чисто химической специализации. Химия в массы — это очень удобно!

Литература

1. Громова Н.Ю., Косивцов Ю.Ю., Сульман Э.М. Tехнология синтеза и биосинтеза биологически активных веществ. Тверь: ТГТУ, 2006. — С. 19–20, 60–62;
2. Тарантул В.З. Толковый словарь по молекулярной и клеточной биотехнологии. М.: «Языки славянской культуры», 2015. — 984 с.;
3. Josef Vagner, Hongchang Qu, Victor J Hruby. (2008). Peptidomimetics, a synthetic tool of drug discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 292-296;
4. Hannah Bolt, Laurens Kleijn, Nathaniel Martin, Steven Cobb. (2018). Synthesis of Antibacterial Nisin–Peptoid Hybrids Using Click Methodology. Molecules. 23, 1566;
5. Элементы: «Компьютерное моделирование мембран, липид-II и покрывало Пенелопы»;
6. Anton Chugunov, Darya Pyrkova, Dmitry Nolde, Anton Polyansky, Vladimir Pentkovsky, Roman Efremov. (2013). Lipid-II forms potential “landing terrain” for lantibiotics in simulated bacterial membrane. Sci Rep. 3;
7. Арзуманов А.А., Гейт М.Д, Коршунов В.А. (2009). Пептид-олигонуклеотидные конъюгаты как антисмысловые агенты нового поколения. Молекулярная биология. 9, 998–1006;
8. Северов В.В., Варижук А.М., Позмогова Г.Е. (2012). Перспективы использования методов клик-химии в биологии и медицине. Эфферентная и физико-химическая медицина. 7, 10–16.;
9. Генетическое тестирование и патернализм в медицине;
10. Sunita Thyagarajan, Narasimha N. Murthy, Amy A. Narducci Sarjeant, Kenneth D. Karlin, Steve E. Rokita. (2006). Selective DNA Strand Scission with Binuclear Copper Complexes:  Implications for an Active Cu2−O2Species. J. Am. Chem. Soc.. 128, 7003-7008;
11. Dorota I. Rozkiewicz, Johannes Gierlich, Glenn A. Burley, Katrin Gutsmiedl, Thomas Carell, et. al.. (2007). Transfer Printing of DNA by “Click” Chemistry. ChemBioChem. 8, 1997-2002;
12. Реалии ДНК-«аномалии»;
13. Сверхпроводящие магниты и рецепторы биомембран: Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН;
14. Yan Xu, Yuta Suzuki, Makoto Komiyama. (2009). Click Chemistry for the Identification of G-Quadruplex Structures: Discovery of a DNA-RNA G-Quadruplex. Angew. Chem. Int. Ed.. 48, 3281-3284;
15. A. Salic, T. J. Mitchison. (2008). A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 2415-2420;
16. Фермент-катенан, или Зацепленные кольца без химической связи;
17. Мобильные генетические элементы прокариот: стратификация «общества» бродяжек и домоседов;
18. Ravindra Kumar, Afaf El-Sagheer, John Tumpane, Per Lincoln, L. Marcus Wilhelmsson, Tom Brown. (2007). Template-Directed Oligonucleotide Strand Ligation, Covalent Intramolecular DNA Circularization and Catenation Using Click Chemistry. J. Am. Chem. Soc.. 129, 6859-6864;
19. A.J. Foster, R.A. Bird, S.N. Smith. (2007). Biotinylation and characterization of Cryptococcus neoformans cell surface proteins. J Appl Microbiol. 103, 390-399;
20. Grigory G. Borisenko, Marina A. Zaitseva, Andrey N. Chuvilin, Galina E. Pozmogova. (2009). DNA modification of live cell surface. Nucleic Acids Research. 37, e28-e28;
21. Невидимая граница: где сталкиваются «нано» и «био»;
22. Наномедицина будущего: трансдермальная доставка с использованием наночастиц;
23. Yong Ju, Pei-Yuan Jin, Peng Jin, Yi-An Ruan, Yu-Fen Zhao. (2007). Synthesis of Some Novel 1,2,3-Triazole-Fused Oligonucleoside and Oligosaccharide Analogues. Synlett. 2007, 3003-3006;
24. Anna Carlmark, Craig Hawker, Anders Hult, Michael Malkoch. (2009). New methodologies in the construction of dendritic materials. Chem. Soc. Rev.. 38, 352-362;
25. B. Helms. (2006). CHEMISTRY: Dendrimers at Work. Science. 313, 929-930;
26. Hatsuo Yamamura, Takahiro Mabuchi, Tomoki Ishida, Atsushi Miyagawa. (2017). Syntheses and structure-membrane active antimicrobial activity relationship of alkylamino-modified glucose, maltooligosaccharide, and amylose. Chem Biol Drug Des. 90, 1012-1018.