Конкурс «био/мол/текст»-2014

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2014 в номинации «Лучшее новостное сообщение».

---

Главный спонсор конкурса — дальновидная компания «Генотек».
Конкурс поддержан ОАО «РВК».

---

Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики.
Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.
Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий.

Представление о сопряжении процессов транскрипции и трансляции у бактерий (см. заглавный рисунок) основаны на изучении относительно простых модельных микроорганизмов — Escherichia coli и Bacillus subtilis. Бактерия Gemmata obscuriglobus обладает хорошо развитой системой внутриклеточных мембран, из-за которых многие рибосомы утрачивают возможность прямого доступа к нуклеоиду. Это явление побудило авторов статьи в журнале Доклады Академии Наук США [1] проверить гипотезу о том, что у Gemmata obscuriglobus транскрипция и трансляция в значительной степени пространственно разобщены. Они впервые показали, что у Gemmata obscuriglobus эндомембраны могут являться препятствием для совместной локализации транскрипции и трансляции (о подобной роли эндомембран у прокариот до настоящего времени не было известно).

Механизмы транскрипции и трансляции высококонсервативны, но их пространственная организация у про- и эукариот отличается. Сопряжение транскрипции и трансляции у прокариот возникает из-за отсутствия физического барьера (ядерной мембраны) между нуклеоидом и цитоплазмой. Сопряжение способствует повышению стабильности мРНК и трансляционной регуляции транскрипции [3]. При исследовании Caulobacter crescentus [4] было показано, что колокализация не универсальна. Как у Bacillus subtilis [5], так и у Escherichia coli [5–7] наблюдается пространственное разделение между некоторыми рибосомами и РНК-полимеразой, ассоциированной с нуклеоидом. Таким образом, пространственная организация транскрипции и трансляции была изучена лишь у трёх модельных видов бактерий.

Бактерия Gemmata obscuriglobus (порядок Planctomycetales) обладает сложной сетью внутренних мембран [8–17]. Обнаружение эндоцитозоподобных процессов [14], [18] у этого микроорганизма указывает на то, что основной функцией мембранной сети является участие в процессах внутриклеточного транспорта. Вначале (на основании электронно-микроскопических исследований) полагали, что эти мембраны, формирующие компартменты вокруг нуклеоида [9–12], являются уникальными и отличаются от цитоплазматической мембраны. Более поздние исследования (электронная томография) [13], [15–17] как подтверждают [17], так и не подтверждают [13], [15], [16] эту точку зрения. Исследования Acehan и др. [15] и Santarella-Mellwig и др. [16] свидетельствуют о том, что эндомембраны представляют собой впячивания типичной грамотрицательной цитоплазматической мембраны, и что все цитоплазматические компартменты взаимосвязаны. До сих нет однозначного мнения об эволюционных связях G. obscuriglobus и эукариот [19–21], но сложная сеть эндомембран вне зависимости от своей эволюционной истории может представлять собой физический барьер, обусловливающий особенности пространственной организации экспрессии генов. Авторы работы [1] решили проверить гипотезу о том, что у G. obscuriglobus значительная часть трансляции может быть пространственно отделена от транскрипции.

Поскольку клеточная структура G. obscuriglobus является вариабельной и динамичной [9], [13], [15], [16], авторы сравнили при помощи просвечивающей электронной микроскопии ультраструктуру клеток G. obscuriglobus из собственных культур с другими данными, представленными в литературе ранее. Они наблюдали характерную систему внутренних мембран (одно- и двухслойные мембраны), конденсированный нуклеоид и много областей, дистальных по отношению к клеточному нуклеоиду (рис. 1). Аналогичные результаты были получены ранее в работах [9], [10], [12]. Поскольку при помощи данного метода получаются двумерные изображения, авторы не могли корректно интерпретировать число нуклеоидов (один или несколько) или степень связности различных клеточных компартментов и мембран [15], [16].

Для того, чтобы определить клеточную локализацию активных транслирующих рибосом G. obscuriglobus, авторы использовали иммунофлуоресцентную микроскопию с первичными антителами к белкам S10 и EF-Tu, а также флуоресцентные красители, связывающиеся с ДНК (DAPI) и мембранами (DiOC₆). Оказалось, что S10 и EF-Tu чаще встречались в участках, удалённых от нуклеоида (периферические области, где отсутствовал сигнал от DAPI; рис. 2а и 2б).

Для того чтобы обеспечить локализацию с высоким разрешением, авторы использовали иммуноэлектронную микроскопию. Местонахождение РНК-полимеразы в клетках G. obscuriglobus визуализировали при помощи иммуноэлектронной микроскопии с первичными антителами к β-субъединице РНК-полимеразы и вторичными антителами, конъюгированными с наночастицами золота (рис. 3а). β-субъединица РНК-полимеразы была локализована возле нуклеоида G. obscuriglobus, причём наночастицы золота группировались в 1–3 кластера. Концентрирование РНК-полимеразы в центральной области нуклеоида также было описано у B. subtilis [5].

При исследовании локализации компонентов аппарата трансляции в качестве первичных были взяты антитела к белкам S10 и EF-Tu, а вторичные антитела были конъюгированы с наночастицами золота (15 нм). Также были использованы антитела к двухцепочечной ДНК и соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с наночастицами золота. При помощи мечения с антителами к двухцепочечной ДНК (рис. 3б) был визуализирован конденсированный нуклеоид G. obscuriglobus.

Авторы также провели флуоресцентное мечение рибосом при помощи сульфата гентамицина, конъюгированного с сукцинимидным эфиром флуоресцентного красителя Texas Red (GTTR). Поскольку аминогликозидный антибиотик гентамицин связывается с 16S-рРНК 30S малой рибосомной субъединицы (с А-сайтом собранной рибосомы) [23], он является удобным альтернативным маркером активной трансляции. Когда клетки G. obscuriglobus были подвергнуты воздействию GTTR, сигнал от Texas Red наблюдался только в удалённых от нуклеоида областях (рис. 4а); аналогичный результат был получен для клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae (рис. 4б).

Таким образом, с использованием подхода, независимого от антител (мечение гентамицином, конъюгированным с сукцинимидным эфиром красителя Texas Red), авторами было показано то, что участки, удалённые от нуклеоида, обогащены транслирующими рибосомами, что, в свою очередь, подтверждает выводы, сделанные на основании данных иммунофлуоресценции.

Авторы представили убедительные доказательства того, что у микроорганизма G. obscuriglobus, содержащего эндомембраны, значительная часть активной трансляции, по-видимому, осуществляется в участках, удалённых от нуклеоида(ов). Это скорее всего происходит за счёт того, что мембраны отделяют нуклеоид от периферических рибосом и, следовательно, могут быть препятствием для совместной локализации процессов транскрипции и трансляции, что ранее не сообщалось для прокариотических организмов. Исследование может являться полезной основой для рассмотрения эволюции организации клеток эукариот и возникновения в её ходе пространственного разобщения процессов экспрессии генов.

Литература

1. E. Y. Gottshall, C. Seebart, J. C. Gatlin, N. L. Ward. (2014). Spatially segregated transcription and translation in cells of the endomembrane-containing bacterium Gemmata obscuriglobus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 11067-11072;
2. Nelson D.L. and Cox M.M. Lehninger principles of biochemistry (5 Edition). New York: W. H. Freeman and company, 2008;
3. J. Gowrishankar, R. Harinarayanan. (2004). Why is transcription coupled to translation in bacteria?. Molecular Microbiology. 54, 598-603;
4. Paula Montero Llopis, Audrey F. Jackson, Oleksii Sliusarenko, Ivan Surovtsev, Jennifer Heinritz, et. al.. (2010). Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria. Nature. 466, 77-81;
5. Peter J. Lewis, Shail D. Thaker, Jeffrey Errington. (2000). Compartmentalization of transcription and translation in Bacillus subtilis. EMBO J. 19, 710-718;
6. Judita Mascarenhas, Michael H W Weber, Peter L Graumann. (2001). Specific polar localization of ribosomes inBacillus subtilisdepends on active transcription. EMBO Rep. 2, 685-689;
7. Talukder Ali Azam, Sota Hiraga, Akira Ishihama. (2000). Two types of localization of the DNA-binding proteins within the Escherichia coli nucleoid. Genes Cells. 5, 613-626;
8. P. D. Franzmann, V. B. D. Skerman. (1984). Gemmata obscuriglobus, a new genus and species of the budding bacteria. Antonie van Leeuwenhoek. 50, 261-268;
9. J. A. Fuerst, R. I. Webb. (1991). Membrane-bounded nucleoid in the eubacterium Gemmatata obscuriglobus.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88, 8184-8188;
10. J. A. Fuerst. (1995). The planctomycetes: emerging models for microbial ecology, evolution and cell biology. Microbiology. 141, 1493-1506;
11. John A. Fuerst. (2005). INTRACELLULAR COMPARTMENTATION IN PLANCTOMYCETES. Annu. Rev. Microbiol.. 59, 299-328;
12. Margaret Lindsay, Richard Webb, Marc Strous, Mike Jetten, Margaret Butler, et. al.. (2001). Cell compartmentalisation in planctomycetes: novel types of structural organisation for the bacterial cell. Archives of Microbiology. 175, 413-429;
13. Arnon Lieber, Andrew Leis, Ariel Kushmaro, Abraham Minsky, Ohad Medalia. (2009). Chromatin Organization and Radio Resistance in the Bacterium Gemmata obscuriglobus. JB. 191, 1439-1445;
14. John A. Fuerst, Evgeny Sagulenko. (2010). Protein uptake by bacteria. Communicative & Integrative Biology. 3, 572-575;
15. D. Acehan, R. Santarella-Mellwig, D. P. Devos. (2014). A bacterial tubulovesicular network. Journal of Cell Science. 127, 277-280;
16. Rachel Santarella-Mellwig, Sabine Pruggnaller, Norbert Roos, Iain W. Mattaj, Damien P. Devos. (2013). Three-Dimensional Reconstruction of Bacteria with a Complex Endomembrane System. PLoS Biol. 11, e1001565;
17. Evgeny Sagulenko, Garry P. Morgan, Richard I. Webb, Benjamin Yee, Kuo-Chang Lee, John A. Fuerst. (2014). Structural Studies of Planctomycete Gemmata obscuriglobus Support Cell Compartmentalisation in a Bacterium. PLoS ONE. 9, e91344;
18. T. G. A. Lonhienne, E. Sagulenko, R. I. Webb, K.-C. Lee, J. Franke, et. al.. (2010). Endocytosis-like protein uptake in the bacterium Gemmata obscuriglobus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 12883-12888;
19. John Fuerst. (2012). Keys to eukaryality: Planctomycetes and ancestral evolution of cellular complexity. Front. Microbio.. 3;
20. James O. McInerney, William F. Martin, Eugene V. Koonin, John F. Allen, Michael Y. Galperin, et. al.. (2011). Planctomycetes and eukaryotes: A case of analogy not homology. Bioessays. 33, 810-817;
21. Damien P. Devos. (2012). Regarding the presence of membrane coat proteins in bacteria: Confusion? What confusion?. Bioessays. 34, 38-39;
22. John A. Fuerst, Evgeny Sagulenko. (2011). Beyond the bacterium: planctomycetes challenge our concepts of microbial structure and function. Nat Rev Microbiol. 9, 403-413;
23. S. Yoshizawa. (1998). Structural origins of gentamicin antibiotic action. The EMBO Journal. 17, 6437-6448.