Не найдется молекулярного биолога, который хотя бы раз в жизни не сталкивался с поиском известной последовательности нуклеиновой кислоты в образце. Сегодня эта, наверное, самая частая и надоедливая задача в молекулярной биологии имеет множество решений. Чего только не выдумали молекулярные биологи за полвека. Тут вам и классический ПЦР-скрининг с гель-электрофорезом, отлично справляющийся с простыми качественными анализами, а заодно навевающий теплую ностальгию по уютным университетским практикумам. Есть и количественная ПЦР в реальном времени для задач посложнее. Ну, а для поиска отдельных молекул, затерянных среди миллиардов своих собратьев в сложных образцах, существуют разнообразные варианты анализа на ДНК-чипах и прочие новомодные капельные цифровые ПЦР [1], [2]. Всего не перечислишь .

Статья «Важнейшие методы молекулярной биологии и генной инженерии» [3] рассказывает о многих из них. — Ред.

Многие из этих методов обладают феноменальной точностью и могут найти буквально единичные молекулы нуклеиновых кислот [4]. К сожалению, все они требуют дорогих и громоздких приборов, а также долгого времени на анализ. Но искать нуклеиновые кислоты хочется быстро, дешево и просто — особенно, если ты исследователь-полевик, изучающий вспышку ящура среди оленей Чукотки или состав колбасы в сельском магазине. Система, пригодная для таких исследований, должна работать при мягких температурных условиях, например, при температуре тела и исключать сложное оборудование. Идеальный вариант, если она будет создана в виде тест-полоски.

В создании аналитической системы мечты нам может помочь метод, описанный авторами Science в недавней статье [5]. Из-за своей выдающейся способности быстро находить отдельные молекулы нуклеиновых кислот он получил броское название SHERLOCK. Как часто бывает в таких случаях, расшифровку подогнали под красивую аббревиатуру, но смысл она тем не менее не утратила: SHERLOCK = Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing.

Аналогично большинству аналитических методов, SHERLOCK начинается со стадии амплификации. Но в нем используется не обычная трехстадийная ПЦР, требующая высокотемпературного плавления ДНК, отжига праймеров и элонгации при 72 °С, а ее близкий, но гораздо менее капризный родственник — рекомбиназная полимеразная амплификация [6]. В этой реакции, протекающей в изотермических условиях с оптимумом в 37–42 °С, в обязательном порядке используют набор из трех белков (рекомбиназы, SSB-белка и вытесняющей ДНК-полимеразы) и пары праймеров к амплифицируемому фрагменту. Фермент рекомбиназа провоцирует спаривание олигонуклеотидного праймера с комплементарной последовательностью в двуцепочечной ДНК-матрице уже при комнатной температуре. Чтобы праймер не был вытеснен вернувшейся на свое место второй цепью матрицы, в смеси всегда находится избыток SSB-белков, стабилизирующих одноцепочечную ДНК. С двух праймеров, севших на матрицу с помощью упомянутых белков-помощников, начинается синтез ДНК, который ведет Bst-полимераза, вытесняющая по ходу движения вторую цепь из ДНК-дуплекса. Сталкивавшиеся с ней в работе люди знают, что ее оптимум — 65 °С [7], но и при 37 °С она все еще сохраняет свою активность.

Если мы имеем дело с РНК-матрицей, то описанную смесь реагентов дополняет обратная транскриптаза, превращающая реакцию в RT-RPA. После раунда амплификации, смесь олигонуклеотидов подвергается транскрипции с помощью T7 РНК-полимеразы, промотор которой содержится в праймерах, использованных в RPA. Так после двух или трех (в случае RT-RPA) реакций синтеза мы получаем смесь нуклеиновых кислот, обогащенную молекулами РНК искомой последовательности. И тут мы подходим к главной фишке метода SHERLOCK. В дело вступает уже порядком всех утомившая за последние годы система CRISPR-Cas [8].

Об истории и возможностях этой системы «биомолекула» рассказывала в статьях: «CRISPR-эпопея и ее герои» [9] и «Просто о сложном: CRISPR/Cas» [10]. — Ред.

Как вы уже догадались, в качестве зонда выступает crРНК, часть последовательности которой комплементарна искомой последовательности полинуклеотида-мишени. Образовавшийся РНК-дуплекс активирует фермент нуклеазу, но только не высокоспецифичную Cas9, а неспецифичную Cas13a из Leptotrichia wadei. Связавшись с дуплексом crРНК-мишени, Cas13a начинает неспецифично резать свободные нуклеиновые кислоты и рано или поздно добирается до флуоресцентно-меченых РНК-сенсоров, в избытке плавающих вокруг. Их расщепление легко детектируется флуориметром и свидетельствует о том, что SHERLOCK достиг цели (рис. 1).

Перспективы метода выглядят многообещающе. SHERLOCK с успехом прошел множество безжалостных проверок. Он безропотно соглашался работать даже с «грязными» образцами, содержащими до 2% человеческой сыворотки. Оказалось, что он с успехом находит как ДНК-, так и РНК-мишени. И даже при совмещении всех его компонентов в одной реакционной смеси сохраняется аттомолярная чувствительность. Все эти достоинства сочетаются с высокой специфичностью: с помощью SHERLOCK удалось различить образцы близкородственных вирусов Зика и Денге с титром меньше 2 аттомоль!

Вдохновленные этим результатом исследователи решили опробовать метод в распознавании однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) человеческого генома. Образцы геномной ДНК получили из слюны четырех добровольцев. Протокол выделения включал либо полноценную очистку ДНК на колонке, либо обычный нагрев образца с разрушением клеток в течение 5 минут. В обоих различающихся по чистоте образцах SHERLOCK идентифицировал искомые аллели с чувствительностью, достаточной для распознавания гомо- и гетерозиготного генотипов.

Для того чтобы доказать пригодность метода к использованию в виде тест-полосок, все его компоненты были подвергнуты сорбции на твердофазный носитель и лиофилизированы. Чувствительность метода несколько снизилась, но 20-аттомолярные концентрации вирусов оказались вполне по плечу такому «походно-полевому Шерлоку».

На первый взгляд кажется, что SHERLOCK имеет много общего с методом LAMP. «Биомолекула» уже писала об этом быстром способе детекции нуклеиновых кислот [11]. Ведущую роль в нем так же играет та же самая Bst-полимераза, а время реакции составляет 5–30 минут. Возможность смеси всех компонентов в одной пробирке и изотермическая амплификация так же делают этот метод крайне привлекательным как для ученых, так и для медиков [12]. Однако, чтобы детектировать нуклеиновую кислоту-мишень методом LAMP, амплификация должна пройти как можно более полно и с максимальным выходом, что вынуждает проводить ее при «комфортных» для Bst-полимеразы 65 °С, а не при «хулиганских» 37 °С, как у SHERLOCK. В результате LAMP постепенно завоевывает себе место в стенах лабораторий, но в виде тест-полосок он так и не появился (рис. 2). А вот у SHERLOCK, работающего при температуре человеческого тела, самые блестящие перспективы! Тем более что единственный прибор, необходимый для его работы, — флуориметр — легко можно сконструировать в карманном формате.

Литература

1. Marco Severgnini, Paola Cremonesi, Clarissa Consolandi, Gianluca De Bellis, Bianca Castiglioni. (2011). Advances in DNA Microarray Technology for the Detection of Foodborne Pathogens. Food Bioprocess Technol. 4, 936-953;
2. Matthew C. Strain, Steven M. Lada, Tiffany Luong, Steffney E. Rought, Sara Gianella, et. al.. (2013). Highly Precise Measurement of HIV DNA by Droplet Digital PCR. PLoS ONE. 8, e55943;
3. Важнейшие методы молекулярной биологии и генной инженерии;
4. R. T. Hayden, Z. Gu, J. Ingersoll, D. Abdul-Ali, L. Shi, et. al.. (2013). Comparison of Droplet Digital PCR to Real-Time PCR for Quantitative Detection of Cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51, 540-546;
5. Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Jeong Wook Lee, Patrick Essletzbichler, Aaron J. Dy, et. al.. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356, 438-442;
6. Olaf Piepenburg, Colin H Williams, Derek L Stemple, Niall A Armes. (2006). DNA Detection Using Recombination Proteins. PLoS Biol. 4, e204;
7. Bst DNA polymerase, large fragment. Сайт NEB;
8. L. Cong, F. A. Ran, D. Cox, S. Lin, R. Barretto, et. al.. (2013). Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, 819-823;
9. CRISPR-эпопея и ее герои;
10. Просто о сложном: CRISPR/Cas;
11. Поиск иголки в стоге сена за 10 минут — подсвети себе LAMPой;
12. Manmohan Parida, Santhosh Sannarangaiah, Paban Kumar Dash, P. V. L. Rao, Kouichi Morita. (2008). Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev. Med. Virol.. 18, 407-421.