История эта началась в испанском портовом городке Санта-Пола, куда, по словам Эрика Ландера (рис. 1), прекрасное побережье и обширные солончаки веками привлекали отдыхающих, фламинго и производителей соли [1]. А еще в тамошней соли, незаметно для отдыхающих, нежились экстремалы из мира архей. Вот их-то генетической начинкой в 1989 году и заинтересовался молодой докторант Университета Аликонте Франциско Мохика (рис. 2). В геноме Haloferax mediterranei он обнаружил группы почти совершенных и почти палиндромных прямых 30-нуклеотидных повторов, разделенных спейсерами — уникальными, неповторяющимися участками примерно такой же длины. Эти странные кластеры Мохика сопоставил с устроенными подобно (но не похожими по последовательности) повторами в геноме Escherichia coli, замеченными японцами в 1987 году. Правда, для ученых из Осаки повторы так и остались простой побочной находкой.

В 1995-м Мохика опубликовал статью об обнаружении нового класса прокариотических повторов, названных short regularly spaced repeats (SRSR). Позже по его же предложению их переименовали в clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR).

К 2000 году всё тот же Мохика выявил такие же повторы у массы архей и бактерий, включая возбудителей опасных инфекций — Mycobacterium tuberculosis и Yersinia pestis.

В 2002-м исследовательская группа из Голландии заметила, что к CRISPR всегда прилегает однотипная группа генов. За что эти гены и получили название cas (CRISPR-associated genes) [2]. Конечно, все задумались о функциях этой системы: ведь раз она так распространена у прокариот, значит, зачем-то им очень нужна.

И вот, в 2003-м Мохика решил «пробластить» спейсеры — поискать в мировой базе последовательностей ДНК похожие фрагменты. Снова. Раньше он тоже пытался, но безуспешно: база была еще хиленькой. А теперь повезло: нашлось совпадение одного из спейсеров CRISPR штамма E. coli, устойчивого к фагу Р1, с ДНК этого сáмого фага. К концу недели уже 88 спейсеров обрели «родственников», и большинство — среди фагов и конъюгативных плазмид. Тогда Мохика предположил, что CRISPR кодируют инструкции для реакций адаптивного (приобретенного) иммунитета, защищающих прокариот от инфекций.

Распив с коллегами коньяк в честь рождения идеи, Мохика приступил к написанию статьи. Куда? Ну конечно, в Nature! Ввиду чрезвычайной важности открытия — так ему казалось. Следующие 18 месяцев из жизни испанца Ландер назвал одиссеей разочарований. Редакция Nature статью отклонила, по непонятной причине решив, что идея Мохики вовсе не нова; примерно так же, но усомнившись еще и в ее важности, в 2004-м ответили из PNAS, а затем из Molecular Microbiology и Nucleic Acid Research. Редакторы Journal of Molecular Evolution оказались более прозорливыми, и после года (!) рецензирований-доработок вконец вымотавшийся Мохика увидел свою гипотезу о биологической роли CRISPR изложенной на вполне приличной бумаге. Не Nature, но всё же... Прошло лет 10, и, как заметил один из ведущих исследователей CRISPR Константин Северинов (рис. 3), Nature теперь готов печатать работы даже уровня студенческой курсовой, если они касаются CRISPR-Cas [3].

Примечательно, что тогда же, в 2004–2005 годах, подобную одиссею переживали еще две научные группы, пытавшиеся опубликовать свои идеи относительно функций CRISPR. Эти группы подошли к теме CRISPR с абсолютно разных сторон. Кристин Порсель и Жиль Вернью (рис. 2) работали по заданию Минобороны Франции, типируя штаммы чумной бациллы по ДНК-повторам — то есть подбирая генетические маркеры, способные различить изоляты Y. pestis разного происхождения. Группа показала, что близкородственные штаммы иногда могут различаться лишь CRISPR-локусами и что новые спейсеры, гомологичные фаговым ДНК, встраиваются в один и тот же конец локуса. Четыре журнала отказались принять статью с идеей о том, что CRISPR — это бактериальная память о прошлых генетических агрессорах. То же самое, но относительно стрептококковых CRISPR, утверждал Александр Болотин из Французского национального института сельскохозяйственных исследований. И он первым предположил, как именно работает эта иммунная система. Гипотеза Болотина, хоть и не совсем верная касательно механизма, нашла «свой» журнал всего со второй попытки.

Надо сказать, что изучением и классификацией Cas-белков (только они тогда так не назывались) еще с конца 1990-х занималась группа Евгения Кунина (рис. 4), эксперта NCBI в области биоинформатики и эволюционной биологии. Кира Макарова и другие члены группы в 2002 году опубликовали статью о возможном участии этих белков в репарации ДНК (что, кстати, тоже случается [4]). В том же году голландцы связали их топологически с CRISPR-кассетами и назвали Cas. Всё встало на свои места, и уже в 2005 году группа Кунина, как и Мохика с Вернью, вычислила иммунное предназначение CRISPR-Cas-системы. И, подобно Болотину, предположила в качестве иммунного механизма РНК-интерференцию. Гипотетическая схема прокариотической автовакцинации во благо потомства — с передачей приобретенного иммунитета в духе ламаркизма — оформилась в статью в 2006-м [5].

Показали адаптивную иммунную систему прокариот в действии промышленные микробиологи, призванные транснациональным пищепромом генотипировать штаммы Streptococcus thermophilus: для изготовления йогуртов и сыров нужно было научиться отбирать устойчивых к фагам «рабочих лошадок», а еще лучше — делать их таковыми. Группа Филиппа Хорвата (рис. 4) связала эту устойчивость с CRISPR незадолго до выхода статьи Мохики, а к 2006 году целенаправленно вывела устойчивые к фагам штаммы, заметив, что уверенность стрептококка в противостоянии фагам росла пропорционально числу заимствованных у этих вирусов спейсеров. Но даже однонуклеотидных различий между спейсером и комплементарной ему фаговой мишенью хватало для отключения защиты.

Эта же группа микробиологов выяснила функции белков Cas7 и Cas9 (будущего героя генно-инженерных триллеров тогда называли Cas5 или Csn1) в адаптивном бактериальном иммунитете. В 2010-м команда уже знала, как именно и где именно режет мишень Cas9, белок-киллер CRISPR-системы II типа. И что для его работы мишень обязательно должна содержать три конкретных нуклеотида — PAM-последовательность (proto-spacer adjacent motif). Всё это не только продвинуло ученых в понимании работы системы , но и повысило эффективность производства заквасок, а следовательно, и объемы их продаж. И сейчас есть огромная вероятность того, что в нашем холодильнике стоит «криспризованный» йогурт. Особо пугливых производитель заверяет, что там нет никаких «ГМО» — искусственно модифицированных стрептококков, — а есть лишь те, что накопили спейсеры естественным путем, будучи атакованными фагами под строгим контролем микробиологов [6].

Устройство CRISPR-Cas-системы и ее работа — так, как это известно сейчас — не раз разбирались на «биомолекуле». Предлагаем, например, посмотреть новейшую конкурсную инфографику «Просто о сложном: CRISPR/Cas» [4].

Голландец Джон ван дер Ост (рис. 4), заразившийся интересом к CRISPR от Кунина, вместе с коллегами биохимически описал Cas-белки комплекса Cascade (CRISPR-система I типа) и их участие в нарезании рабочих транскриптов CRISPR-кассеты (crРНК), а в 2008 году впервые экспериментально «запрограммировал» CRISPR на уничтожение конкретного фага — «привил» E. coli от фага λ, косвенно показав, что цель crРНК — ДНК, а не РНК. В том же году это подтвердили Марраффини и Зонтхаймер (рис. 5), предположившие, что CRISPR — это программируемые нуклеазные системы, которыми можно препарировать нужные участки ДНК in vitro и, возможно, даже в эукариотических клетках.

В 2010–2011 годах микробиологи-инфекционисты Эммануэль Шарпантье и Йорг Фогель (рис. 6), изучающие транскриптомы (совокупность РНК) патогенов, включая Streptococcus pyogenes, обнаружили недостающее звено в CRISPR-системе II типа — напарницу crРНК, которую назвали tracrРНК (trans-activating CRISPR RNA). Они же показали, что эта молекула, комплементарная повторам CRISPR и закодированная в непосредственной близости от локуса, нужна для процессинга («созревания») crРНК. В 2012-м к этой функции добавилась еще и помощь Cas9 в уничтожении мишени.

Еще в 2007-м литовский биохимик Виргиниюс Шикшнис (рис. 3) предпочел нудному изучению структуры нуклеаз участие в набирающей обороты CRISPR-эпопее. В 2011-м его команде удалось в целости и функциональной сохранности перенести из стрептококка в кишечную палочку CRISPR-систему II типа. Стало очевидно, что для целенаправленного разрезания мишени действительно нужны всего три компонента: crРНК–tracrРНК–Cas9, — вполне работоспособных даже в гетерологичных системах.

А дальше сразу две группы (одна — Шикшниса, другая — скооперировавшихся Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудны (рис. 6), РНК-эксперта из Калифорнийского университета) упражнялись в получении in vitro функциональных систем с определенной специфичностью. И в 2012-м обе группы доложили о потенциале простейшей системы CRISPR-Cas9 для РНК-программируемого редактирования генома. При этом Шарпантье и Дудна еще и успешно объединили crРНК и tracrРНК в одну укороченную молекулу — sgРНК. Единственная направляющая РНК впоследствии существенно облегчила жизнь генным инженерам.

Например, таким как Фэн Чжан (рис. 3). С 16 лет погрузившийся в дебри молекулярной биологии, а затем и оптогенетики, он мечтал искоренить нервно-психические недуги, управляя активностью нейронных генов с помощью света. И кое-что ему удалось. Однако в 2011-м он услышал о CRISPR, а в середине 2012-го у Чжана уже была готовая трехкомпонентная система редактирования, оптимизированная для клеток млекопитающих и состоящая из стрептококковых Cas9, tracrРНК и CRISPR-локуса, «нацеленного» сразу на 16 сайтов человеческого и мышиного геномов. Система работала с приличной точностью и эффективностью: мутации удавались — как делеции, так и замещения фрагментов ДНК. После выхода статьи Шарпантье и Дудны Чжан перешел на двухкомпонентную систему, но выяснил, что in vivo эффективнее работает полноразмерный вариант sgРНК, а не укороченный. Статья Чжана, вышедшая в январе 2013 года в Science, стала самой цитируемой в этой области, а его векторы, кодирующие CRISPR-Cas9, уже три года разлетаются как горячие пирожки через некоммерческую организацию Addgene [1]. Врочем, как и реагенты других лабораторий.

Практически одновременно вышла статья воспитанников известного своими провокационными, но очень заманчивыми, идеями Джорджа Чёрча. Прашант Мали и Лухан Ян (рис. 7) провели те же усовершенствования CRISPR-Cas9, что и Чжан, и сообщили об успешном редактировании генома человеческих клеток. При этом преимущества полноразмерной sgРНК в работе in vivo они оценили раньше, чем команда Чжана.

Однако новости об успешной работе этой программируемой нуклеазной системы in vivo разлетелись по научному сообществу еще до выхода знаковых публикаций. А в 2013-м началась настоящая CRISPR-эпидемия: поисковик Google тошнило от запросов со словом «CRISPR», а биологи по всему миру резали и кроили геномы дрожжей, растений, червей, мушек, мышек, рыбок, аксолотлей и обезьян.

В 2015-м коллективы Чжана, ван дер Оста и Кунина описали работу нового, «минимального» типа природных CRISPR-систем — CRISPR-Cpf1 (тип V-А). До этого система считалась гипотетической: ее обнаружила специальная биоинформатическая программа у Francisella novicida и ряда других бактерий. Оказалось, что CRISPR-Cpf1 не нуждается в tracrРНК. Не менее важная «изюминка» системы — эффекторный белок Cpf1, способный работать и в человеческих клетках: он распознает другой тип PAM в мишени и режет мишень иначе, чем Cas9, — оставляя «липкие» концы (надрезы цепей ДНК располагаются не напротив друг друга, а со смещением) [7]. Этот же белок, как годом позже сообщила группа Шарпантье, активно участвует в созревании crРНК [8].

В 2016-м журнал Science опубликовал результаты изучения другой, тоже двухкомпонентной, CRISPR-системы VI типа — с эффекторным белком C2c2, атакующим не ДНК, а исключительно РНК. Среди авторов — Северинов, Кунин, Чжан и сам Ландер [9]. Ученые экспрессировали систему из Leptotrichia shahii в E. coli и показали, что C2c2 — это направляемая crРНК рибонуклеаза, режущая, например, фаговую РНК, но не прямо в месте узнавания, и не только ее. После активации, то есть взаимодействия с мишенью, C2c2 устраивает настоящую резню — уничтожает любую РНК, доводя зараженную бактерию до самоубийства. Собственно, похожим образом борются с вирусами и клетки человека. Поскольку система CRISPR-C2c2 действует по принципу РНК-интерференции, думается, что ученые, ранее предполагавшие именно такой механизм реализации бактериального иммунитета, не очень-то и ошибались.

Это была CRISPR-теория 2015–2016 годов. А CRISPR-практика тем временем оказалась на пике не только научного, но и общественного внимания. В 2015-м детонировали эксперименты с нежизнеспособными человеческими эмбрионами [10], [11]. Несмотря на умопомрачительные терапевтические перспективы, над применением CRISPR-технологии в отношении половых и эмбриональных клеток человека нависла тень моратория . И если проблема «дизайнерских детей» будоражит умы обывателей, то ученых в основном беспокоит несовершенство технологии. Но даже самые осторожные признают, что процесс не остановить. И не только в форпосте авантюрных биотехнологий, Китае . Говорят, что работы по коррекции зародышевой линии могут разрешить в Калифорнии [3].

Этот и другие моратории в биологии упомянуты в конкурсной статье «Еще раз про ГМО» [12], посвященной вопросам генетической модификации и интересным применениям ГМО.

Новейший эксперимент китайских ученых по CRISPR-терапии рака легких описан в материале «От слов к делу: технологию CRISPR-Cas впервые применили для лечения онкозаболеваний» [13].

В конце своего исторического расследования Ландер делает интересные выводы [1].

1. «Когда б вы знали, из какого сора...». Никогда не знаешь, из чего вызреет крупный медицинский прорыв. Первым героям CRISPR-эпопеи «дизайнерские дети» и во сне не снились: кто-то разгадывал загадку причудливых прокариотических ДНК-повторов, кого-то рекрутировали для работ, связанных с биооружием, кого-то — для повышения эффективности производства молочных продуктов.
2. Среди CRISPR-героев много молодых, даже не достигших 30 лет, людей.
3. Свои ключевые находки многие участники истории сделали в местах, которые кто-то — например, редактор авторитетного журнала — мог бы назвать «задворками науки», и это могло поспособствовать тем самым «одиссеям разочарований».
4. Открытия, основанные на выдвижении гипотез и сделанные с помощью классических, «мокрых» методов, всё больше теснятся открытиями, основанными на big data и совершёнными «сухим» способом — биоинформатически [14], [15].
5. Научные прорывы всё реже представляют собой «эврику». Обычно это плод многолетних коллективных усилий, где вклады участников не просто суммируются, а в синергизме рождают нечто большее.

Литература

1. Lander E.S. (2016). The Heroes of CRISPR. Cell. 164 (1–2), 18–28;
2. Jansen R., Embden J.D., Gaastra W., Schouls L.M. (2002). Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol. Microbiol. 43 (6), 1565–1575;
3. Ершов А. (2016). «Просто это очень красиво». Константин Северинов о новом типе CRISPR-систем и последних трендах в редактировании геномов. N+1;
4. Просто о сложном: CRISPR/Cas;
5. Makarova K.S., Grishin N.V., Shabalina S.A., Wolf Y.I., Koonin E.V. (2006). A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol. Direct. 1, 7;
6. Grens K. (2015). There’s CRISPR in your yogurt. The Scientist;
7. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Slaymaker I.M., Makarova K.S., Essletzbichler P. et al. (2015). Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759–771;
8. Fonfara I., Richter H., Bratovič M., Le Rhun A., Charpentier E. (2016). The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517–521;
9. Abudayyeh O.O., Gootenberg J.S., Konermann S., Joung J., Slaymaker I.M., Cox D.B. et al. (2016). C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), aaf5573;
10. Liang P., Xu Y., Zhang X., Ding C., Huang R., Zhang Z. et al. (2015). CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 6 (5), 363–372;
11. Мутагенная цепная реакция: редактирование геномов на грани фантастики;
12. Еще раз про ГМО;
13. От слов к делу: технологию CRISPR-Cas впервые применили для лечения онкозаболеваний;
14. Вычислительное будущее биологии;
15. Исследовательская группа Филиппа Хайтовича, или Как биологи работают с большими массивами данных;
16. Ledford H. (2016). The unsung heroes of CRISPR. Nature. 535 (7612), 342–344.