Подписаться
Оглавление

Тимидин — круг замкнулся

  • 251
  • 0,6
  • 0
  • 0
Добавить в избранное
Обзор

В иммунной системе различные стимулы приводят к активации и последующему делению лимфоцитов. Естественно, каждому делению клетки предшествует репликация ДНК, в процессе которой из свободных нуклеотидов достраиваются дочерние цепи ДНК. Часто пролиферацию клеток исследователи оценивают по включению меченых нуклеозидов. Однако нарушение причинно-следственных связей вашего исследования может завести вас в дремучий лес.

Статья на конкурс «био/мол/текст»: История о том, как мы пошли туда, не знаю куда, чтобы найти то, не знаю что. Если вы думаете, что видите то, что видите, и уверены, что исследуете то, что исследуете — проверьте еще раз, а потом еще раз. На примере нашего почти детективного исследования и поиска неизвестно чего можно увидеть, как важно выбрать правильную стратегию исследования, использовать подходящие методы и подвергать сомнению результаты. Ведь зачастую мы просто забываем о возможности получения каких-то артефактов — мы же строим свои гипотезы на базе опубликованных и проверенных данных. Даже если вы обложились самой лучшей литературой и имеете доступ к самому современному оборудованию, результат, к сожалению, не гарантирован. Для успеха научного эксперимента важны еще и не совсем научные составляющие: это они — везение, капелька удачи, стечение обстоятельств — иногда приводят к весьма неожиданным результатам.

Конкурс «био/мол/текст»-2018

Эта работа опубликована в номинации «Своя работа» конкурса «био/мол/текст»-2018.


«Диа-М»

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.


Genotek

Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.


«Альпина нон-фикшн»

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Введение

История эта началась довольно давно, правда, и закончилась уже не вчера. Во время выполнения всяких экспериментов для моей диссертации, связанной с туберкулезом, мне было нужно оценивать пролиферацию Т-лимфоцитов. Изучали мы тогда взаимодействие макрофагов и нейтрофилов, фагоцитирующих, то есть поглощающих, микобактерии (возбудители туберкулеза), со специфичными к микобактериальным антигенам Т-лимфоцитами.

Макрофаги и Т-лимфоциты — клетки, играющие основную роль в противотуберкулезном иммунитете. Макрофаги фагоцитируют бактерии, что приводит к запуску механизмов активации врожденного иммунитета. А кроме того, макрофаги презентируют на своей поверхности в составе специальных молекул (молекул главного комплекса гистосовместимости МНСII) фрагменты микобактерий (антигены) Т-лимфоцитам, что приводит к их активации и запуску адаптивного звена иммунной системы [1]. Стимулированные Т-лимфоциты, в свою очередь, активируют макрофаги, чтобы те убивали поглощенные бактерии.

Нейтрофилы — клетки врожденного иммунитета, одними из первых мигрирующие в область воспаления. Они активно фагоцитируют микобактерии, но не способны эффективно их убивать и активировать Т-клетки, то есть их нельзя отнести к профессиональным антиген-презентирующим клеткам (АПК). Таким образом, нейтрофилы выступают в качестве «троянского коня», экранируя бактерии от профессиональных АПК, макрофагов и дендритных клеток, и при этом производят различные факторы, провоцирующие излишнее воспаление. Наша лаборатория в числе прочих занималась этими вопросами и одной из первых опубликовала данные о негативной роли нейтрофилов в туберкулезе [2].

Сейчас биологи активно изучают взаимодействие врожденной и приобретенной систем иммунитета, в том числе взаимодействие макрофагов, нейтрофилов и Т-лимфоцитов. В частности, исследователей интересуют различия в активации Т-лимфоцитов макрофагами, поглотившими непосредственно бактерии, и макрофагами, поглотившими нейтрофилы с бактериями внутри.

Тем, кто занимается иммунологией, хорошо известно, что оценивать активность Т-лимфоцитов можно по их способности пролиферировать (делиться) в ответ на различные стимулы. Одним из быстрых, удобных и доступных в нашей лаборатории способов оценки пролиферации клеток было определение включения 3[H]тимидина в реплицирующуюся ДНК. Метод очень прост: в культуру анализируемых клеток добавляют 3[H]тимидин — меченый тритием тимидин, один из четырех нуклеозидов, входящих в состав ДНК. Следовательно, если клетки делятся, этому предшествует репликация ДНК — синтез новых цепей ДНК на основе уже имеющихся в клетке. Если синтезируется новая ДНК, то меченый тимидин будет в неё включаться наравне с немечеными нуклеозидами. Остается лишь измерить интенсивность включения метки счетчиком радиоактивности. Несмотря на то, что этот метод довольно старый, он очень прост и до сих пор довольно широко применяется во всём мире.

В процессе наших изысканий мы заметили: если в смешанной культуре клеток присутствуют нейтрофилы — с бактериями внутри или без них, — включение 3[H]тимидина, а значит, как мы думали, и пролиферация Т-лимфоцитов сильно снижается (рис. 1). В некоторых случаях — почти на 90%, что, безусловно, нас очень заинтересовало.

Макрофаги захватывают микобактерии

Рисунок 1. Макрофаги захватывают микобактерии и «размещают» их внутри клеток в специальных пузырьках — фагосомах, а затем лизосомах. В этих пузырьках микобактерии разрушаются, а их фрагменты (антигены) в составе молекул главного комплекса гистосовместимоти класса II (MHCII) представляются на поверхности макрофагов. Т-лимфоциты CD4+ могут «видеть» такие молекулы с фрагментами бактерий, в результате чего Т-клетки получают сигнал к активации и делению (подробнее об этом рассказывает статья «Иммунитет: борьба с чужими и… своими» [7]). Мы оценивали интенсивность пролиферации Т-клеток по включению 3[Н]тимидина в реплицирующуюся ДНК (а). Если в такой системе in vitro есть нейтрофилы, то Т-лимфоциты не включают радиоактивный 3[Н]тимидин, то есть, по идее, и не делятся (б).

рисунок автора статьи

Материалы, много методов и никакого результата

Конечно, сразу встал вопрос, что же это за компонент, приводящий к практически полному прекращению пролиферации Т-клеток. На первый взгляд всё казалось довольно простым: прошерсти литературу, оцени экспрессию генов в нейтрофилах, определи концентрацию известных супрессоров Т-клеточной пролиферации, попробуй их заблокировать, глядишь и найдешь что... А если не найдешь, тогда другой путь ждет тебя, более извилистый. Так мы, конечно, и сделали, но... ничего не нашли.

Первым делом мы проверили в системе Transwell (там клетки физически изолированы друг от друга мембраной, проницаемой только для молекул), необходим ли для подобного действия контакт нейтрофилов с Т-лимфоцитами или же нейтрофилы просто выделяют некий растворимый фактор. Убедились, что это нечто растворимое.

Затем мы выяснили, что в нашем случае к подавлению Т-клеточной пролиферации не причастны самые известные супрессоры — IL-10, TGF-b, аргиназа и простагландины, обнаруженные в супернатанте (надосадочной жидкости) нейтрофилов. Кроме того, оказалось, что это «нечто» довольно стабильное. Его можно перезамораживать по нескольку раз, кипятить, в воде оно не горит, в огне не тонет — вообще ничего не меняется: это «нечто» по-прежнему прекрасно подавляет включение метки в ДНК специфических Т-лимфоцитов.

На следующем этапе мы решили проверить, ограничивается ли это явление только специфическими к микобактериальным антигенам Т-лимфоцитами или же оно гораздо шире. Для этого стимулировали Т-лимфоциты неспецифически, через ко-рецептор CD3, и с помощью конканавалина А, через лектиновые рецепторы. Результат был тот же.

Наконец мы взяли миелому и испробовали неизвестное вещество на ней. И когда мы увидели, что и миелома не включает тимидин при добавлении этого «нечто»... Ну, думаю, Нобелевская, не меньше! Стало понятно, что всё это лежит уже вне области туберкулеза, но хочется же найти ответ на мучающий вопрос. Тогда как определить это «нечто»? А главное, стоит ли вообще за это браться, ведь дальнейшие действия, скорее всего, будут вне нашей компетенции...

Итак, стратегия, вроде бы, опять вполне понятна: раздели́ полученный от нейтрофилов супернатант на фракции, как-то определи массу, элементный состав и структуру искомого вещества — и получишь ответ. Но, как обычно, путь исследователя тернист и извилист. То, что умещается в описании в несколько строк, в реальности растягивается на годы.

И вот, стала я искать, кто бы мне разделил этот супернатант на составляющие. Сначала всё выглядело как-то безрадостно: я застряла, подходящих людей найти не могла. Ведь человек должен быть знающий и умеющий, не занятый по горло своими интересами и почему-то готовый погрузиться в твою проблему и осуществить твои желания. И как обычно, в разговорах, вдруг выяснилось, что у коллег есть знакомый, в полной мере владеющий методами HPLC (high performance liquid chromatography). И вот еду я со своей пробиркой, надеясь на чудо. Первый же личный контакт почему-то вызывает интерес к моей проблеме, и человек решается мне помочь. И помогает. И притом совершено бесплатно, то есть даром. Супернатант разделили.

Как сейчас помню, стою я у счетчика радиоактивности и жду заветных цифр — и вот они! Адреналин, сердце стучит, получилось! А что, собственно, получилось? Да просто всё как-то сдвинулось с мертвой точки: только одна из полученных фракций подавляла включение метки. В этот момент ощущаешь прилив счастья и осознание, что ты занимаешься тем, что тебе действительно нравится. Итак, наше плодотворное сотрудничество привело к тому, что после нескольких последовательных разделений вычленилась фракция, содержащая монокомпонент, добавление которого ингибировало включение тимидина в активированные Т-лимфоциты. Но по-прежнему было неясно, что это?

На каком-то очередном сборище, школе/конференции, я разговорилась с одним физиком, который сказал, что они как раз занимаются определением элементного состава веществ и, возможно, смогут мне помочь. Договорились списаться, чтобы подробнее это обсудить. И вот я получаю письмо, подтверждающее, что они могут это сделать, но для анализа им необходимо 10 мг этого «нечто». Тут я призадумалась... Непосвященному читателю может показаться, что это ерунда: ну что такое 10 мг — и не заметишь! Но тут нужно пояснить, как мы получали это неизвестное вещество. Оно секретируется нейтрофилами мышей, и чтобы его получить, мышам нужно внутрибрюшинно ввести, например, пептон: он вызывает неспецифическое воспаление и мощный приток нейтрофилов в область введения. Затем нужно выделить нейтрофилы из брюшной полости (от одной мыши можно добыть 15–20 млн клеток), поместить их в культуру in vitro и через 24 часа собрать супернатант, содержащий много всего помимо того самого «нечто». Затем надо разделить супернатант с помощью HPLC, сконцентрировать или высушить нужную фракцию и тогда уже отдавать на определение.

Я начала считать, сколько килограммов мышей мне нужно и сколько литров супернатанта потребуется прогнать через хроматографические колонки, чтобы получить заветные 10 мг. Это казалось совершенно нереальным.

Параллельно я нашла несколько мест, где попытались определить массу моего «нечто» с помощью масс-спектрометрии. Единственное, что я знала на тот момент о размере этого вещества, — то, что оно меньше 10 кДа. Это мы определили с помощью диализа, но, к сожалению, диализных мешков с меньшим диаметром пор в ближайшем окружении не нашлось. Метод очень прост: помещаешь интересующий раствор в диализный мешок с определенного размера порами, а мешок — в соответствующую среду в большем объеме. Если молекулы искомого вещества меньше диаметра пор, то оно выйдет наружу.

Результаты масс-спектрометрии, несмотря на предполагаемую высокую точность метода, были довольно противоречивыми. В одном месте мне определили, что это вовсе не монокомпонент, а два компонента массой примерно 3 кДа и 7 кДа. В другом месте мне сказали, что образец имеет массу 1 кДа. В третьем определили чрезвычайно интересную структуру, но когда я приехала за результатом и стала внимательно изучать диаграмму, выданную масс-спектрометром, мы с оператором прибора пришли к выводу, что это спектр частички пластика, случайно попавшей в эппендорф, видимо, при вакуумной сушке образца. И наконец, коммерческое предприятие, предлагающее услуги по определению элементного состава веществ, на деле расписалось в своем бессилии. Надо признать, что всё это ввергало меня в уныние. Я понимала, что лезть и заниматься чем-то совершенно не из своей области непросто — как говорится, не суйся в воду, не зная броду. Но внутри всё же надеешься, что что-то как-то где-то сложится. В очередной раз меня посетила мысль: «А не бросить ли всё это?..»

В своем повествовании я почти случайно упустила важный факт. Каждый раз при проверке действия вещества на пролиферирующие Т-лимфоциты я, конечно же, смотрела в микроскоп на культуру клеток. Делящиеся Т-лимфоциты от неделящихся, как правило, можно отличить на глаз: при делении Т-лимфоциты образуют кластеры, то есть собираются в кучки, а покоящиеся клетки равномерно распределены на дне лунки планшета. Так вот, ко всем имеющимся загадкам добавлялась еще одна: на глаз всё выглядело одинаково — как будто все клетки делятся. Закрадывалось подозрение, что всё не совсем так, как мы думаем.

Чтобы развеять сомнения мы оценили пролиферацию двумя способами одновременно: по включению 3[Н]тимидина и с помощью CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester), проникающего в клетку и ковалентно связывающегося с различными макромолекулами. Оказалось, что Т-клетки прекрасно делятся, но меченый тимидин по-прежнему не включают. Так стало понятно, что речь уже идет не о блокировке пролиферации, а о блокировке включения тимидина в ДНК Т-лимфоцитов. Это немного меняло постановку задач и ход размышлений, зачем природе это нужно, но совершенно не облегчало определения «нечто». Мысль просто забыть о нём посещала меня всё чаще…

Что из этого всё-таки вышло? Результат, наконец

В это же время я собиралась ехать в Штаты поучиться гистологии, иммуногистохимии и всему, чему придется. В обсуждении предварительных планов на работу я, естественно, упомянула, что у меня есть некое загадочное вещество, которое никак не удается определить. И решила взять его с собой на случай, если кто-то захочет мне помочь. Поскольку оно довольно стабильное, проблем с перевозкой возникнуть не должно было. И вот оно вместе со мной полетело к Ниагаре. С легкой руки моего волшебного наставника «нечто» получило имя «змеиное масло» и теперь хранилось в холодильнике Roswell Park Cancer Institute. Мы попробовали его действие на других клетках, посмотрели, что при этом происходит с клеточным циклом, обнаружили небольшие изменения в одной из фаз, но не принципиальные. В это же время туда приехал один замечательный химик, который на одном из «перекуров» почему-то согласился взять образец и отдать его на анализ. Таким образом «змеиное масло» потекло с севера на юг, в Сан-Диего, и, к счастью, никто не разлил его. Командировка моя подходила к концу. Приобрела я там много, и в основном не материального, что хранится гораздо дольше.

Время шло, другие проекты как-то продвигались, и в один прекрасный день я получила письмо с отчетом о проведенном анализе. За какие-то 70 долларов, которые так никто с нас и не взял, ребята из солнечного Сан-Диего определили, что «змеиное масло» имеет массу 242 Да и что в его составе точно есть водород. Не очень обнадеживающе, но всё же… На остальное определение, к сожалению, вещества не хватило. Тем не менее это был очередной шаг на пути преодоления.

Попытки биться во все встречающиеся двери и окна привели к нашим коллабораторам, занимающимся ЯМР. В очередной раз я услышала, сколько нужно вещества, чтобы его качественно проанализировать. Теперь было необходимо 2 мг, что, конечно, не 10, но тоже прилично. Договорились, что я сконцентрирую всё добытое «змеиное масло», высушу и привезу его для анализа — вдруг что-то получится. В очередной раз я отвезла пробирку, практически ни на что не надеясь, и уехала в отпуск гулять по горам Гармиш-Партенкирхена.

И вот в одно прекрасное утро я открываю почту и вижу письмо, которое, как не сложно догадаться, содержит две новости: одну хорошую и одну плохую. «Змеиное масло» расшифровано, и это не может не радовать. Тут глаза начинают перескакивать с первых строчек письма на последние, чтобы поскорей узнать результат, но одновременно хочется и оттянуть этот момент. Как будто читаешь детектив и дошел до страницы с разгадкой — и глаз бегает по странице в поисках имени, и летят мысли: «Нет-нет-нет, он не может быть убийцей... нет-нет-нет, это не может быть нашей разгадкой... это “нечто”, это “змеиное масло” — что?! Самый обыкновенный тимидин?! Самый обыкновенный?!» То есть меченый тимидин не включался в синтезирующуюся ДНК просто потому, что в растворе был избыток обычного, немеченого тимидина, который по какой-то неведомой причине активно выделяют нейтрофилы, никак не влияя на пролиферацию Т-клеток? Ну да, получается, что так (рис. 2) [3]. В этот момент показалось, что всё было так просто и очевидно, но эта мудрая мысль почему-то раньше не приходила в голову. Нобелевская не состоялась, и Cell с Science будут по-прежнему как-то обходиться без меня… Стало немного грустно, но и легко одновременно — как раз для прогулки в горах.

Нейтрофилы мышей выделяют тимидин

Рисунок 2. Нейтрофилы мышей выделяют тимидин в большом количестве, что препятствует включению 3[H]тимидина в ДНК при репликации

рисунок автора статьи

Выводы. В основном очевидные

Полученные данные можно интерпретировать по-разному. Пока нет ответа на вопрос, почему и для чего нейтрофилы выделяют большие количества тимидина. Впервые подобную информацию опубликовали около 40 лет назад, а затем спустя 30 лет. Было показано, что макрофаги [4] и некоторые виды миелом [5] тоже способны по неизвестным причинам выделять тимидин. Вместе с тем, для некоторых видов опухолей тимидин просто токсичен. В клеточной биологии тимидин используют для синхронизации клеточного цикла in vitro. Может ли выделяемый нейтрофилами тимидин играть подобную роль in vivo — не известно. Возможно, секреция тимидина нейтрофилами как-то связана с их способностью делать знаменитые ловушки — NETs (neutrophil extracellular traps), в состав которых входит ДНК [6]. Однако остается неясным, секретируют ли нейтрофилы другие виды нуклеозидов.

Возможно, эта история не совсем научно-популярная, а больше популярно-научная, но она приводит к важным выводам. У нас есть стереотипы. В голове иммунолога сидит формула «включение тимидина = пролиферация», которая, как показывает пройденный нами путь, не всегда справедлива. Наверняка аналогичных ситуаций довольно много встречается в разных областях науки. Далеко не всегда четко определяется причинно-следственная связь. Поэтому проверяй себя разными доступными способами, чтобы быть уверенным в получаемых результатах. И наконец, последний и самый важный вывод. Среди нас действительно много замечательных людей и специалистов, готовых помогать на разных уровнях, — нужно только правильно искать. Нетворкинг — вещь очень важная. Оставаясь в тени или даже в темноте, сложнее найти верный путь. Нужно ли заниматься делом, в котором ты не специалист? Скорее всего, нет. Но если очень хочется и есть время и силы, то, конечно, можно — может, вам и повезет. Дорогу осилит идущий.

May the force be with you!

Литература

  1. Anne O'Garra, Paul S. Redford, Finlay W. McNab, Chloe I. Bloom, Robert J. Wilkinson, Matthew P.R. Berry. (2013). The Immune Response in Tuberculosis. Annu. Rev. Immunol.. 31, 475-527;
  2. E. B. Eruslanov, I. V. Lyadova, T. K. Kondratieva, K. B. Majorov, I. V. Scheglov, et. al.. (2005). Neutrophil Responses to Mycobacterium tuberculosis Infection in Genetically Susceptible and Resistant Mice. Infection and Immunity. 73, 1744-1753;
  3. I. A. Linge, E. V. Kondratieva, T. K. Kondratieva, V. A. Makarov, V. I. Polshakov, et. al.. (2016). “Suppressor factor” of neutrophils: A short story of a long-term misconception. Biochemistry Moscow. 81, 1284-1292;
  4. Stadecker M.J., Calderon J., Karnovsky M.L., Unanue E.R. (1977). Synthesis and release of thymidine by macrophages. J. Immunol. 119, 1738–1743;
  5. Bjørn Spilsberg, Frode Rise, Dirk Petersen, Jon Nissen-Meyer. (2006). Thymidine secretion by hybridoma and myeloma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 342, 221-226;
  6. Volker Brinkmann. (2018). Neutrophil Extracellular Traps in the Second Decade. J Innate Immun. 1-8;
  7. Иммунитет: борьба с чужими и… своими.

Комментарии