Конкурс «био/мол/текст»-2011

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2011 в номинации «Лучшее новостное сообщение».

Об общих принципах, по которым одна-единственная оплодотворенная клетка превращается в сложное высокоорганизованное существо, уже замечательно рассказал Александр Марков [1]. Теперь же речь пойдет о более конкретной проблеме, а именно о правильном развитии конечностей по проксимально-дистальной оси. Как так получается, что проксимальные (то есть, расположенные ближе к туловищу) и дистальные (то есть, наоборот, более удаленные от туловища) участки конечности не перепутываются в процессе развития? Почему пальцы вырастают у нас на кисти, а не на плече, как получается, что у нас на каждой ноге только одна ляжка, а не несколько штук, соединенных в цепочку? Каковы механизмы, по которым участки конечности выстраиваются вдоль проксимально-дистальной оси в нужном порядке? Эти вопросы уже много лет занимают умы ученых, занимающихся биологией развития.

Почти тридцать лет назад, в 1973 году, английский биолог развития Льюис Вольперт , и его сотрудники выдвинули изящную теорию образования конечностей у куриного эмбриона. По ней, в клетках развивающейся конечности работает что-то вроде автономных часов, которые «считают» клеточные деления, и в зависимости от того, сколько прошло этих делений, запускают образование того или иного участка конечности из недифференцированных клеток. При этом проксимальные участки образуются первыми, и чем больше прошло времени, тем дистальнее будут возникающие структуры.

Вольперту принадлежит афоризм «Главное событие вашей жизни — это не рождение, свадьба или смерть. Это гаструляция».

На эту тему вспомнилась ЛЭШевская шутка: «Памятник Геккелю на стадии бластулы». — Ред.

Казалось бы, гипотеза эта (она получила название «модель прогрессивной зоны») достаточно простая и легко проверяемая — однако не тут-то было. В течение последующих десятилетий исследователям не удалось ни подтвердить, ни опровергнуть это предположение. Зато возникло несколько других гипотез — и одна из них постулировала, что никакие внутренние часы для верного развития конечности не нужны, а нужен правильный градиент некоторых веществ вдоль проксимально-дистальной оси, причем одни из этих веществ имеют наибольшую концентрацию со стороны основания конечности, а другие — со стороны ее кончика.

У каждой теории были косвенные подтверждения и ярые сторонники в научном мире, но прямых доказательств верности ни у одной из них не было.

И вот наконец-то две группы ученых — одна смешанная американо-голландско-испанская, другая чисто испанская — убедительно показали, что модель прогрессивной зоны не верна, внутренних часов у развивающихся конечностей нет, а регулируется их образование градиентами определенных веществ вдоль проксимально-дистальной оси.

Вообще, в управлении развитием конечностей уже давно были заподозрены ретиноевая кислота, которая влияет на растущую конечность с проксимального конца, и факторы роста фибробластов (FGF), которые, наоборот, действуют дистально. Самый простой способ проверить, верны ли эти подозрения, — просто «выключить» данные вещества с помощью блокаторов и посмотреть, как будет развиваться конечность. Но, к сожалению, это невозможно, поскольку в результате прекращается развитие конечностей как таковых.

Однако данную проблему можно обойти, если использовать недавно разработанную методику, которая позволяет сохранить клетки «почки» конечности (участки, из которых у эмбриона развиваются конечности) в культуре в недифференцированном и пролиферирующем состоянии. Для этого необходимо выдерживать их в среде с белком FGF8 — одним из членов FGF-семейства — и белком Wnt3a, который также вовлечен в регуляцию эмбриональных процессов (см. путь Wnt).

При наличии этой методики достаточно добавить к культивируемым клеткам исследуемые вещества, а потом собрать из них так называемую «рекомбинантную конечность», трансплантировать ее в развивающийся эмбрион и посмотреть, какая в результате вырастет конечность и чем она будет отличаться от нормальной.

Итак, исследователи из первой — американо-голландско-испанской — группы создали три варианта рекомбинантных конечностей:

1. Клетки которой вообще не держали в культуре, а сразу, едва диссоциировав, собрали из них рекомбинантную конечность (первый контроль).
2. На клетки которой НЕ действовали ретиноевой кислотой, а просто содержали 36 часов в культуре (второй контроль).
3. На клетки которой в культуре действовали ретиноевой кислотой в течение 36 часов (опыт).

Результаты данного эксперимента показаны на рис. 1. Видно, что хотя «ретиноевая» конечность не совершенно безупречна (например, у нее нарушены соотношения размеров сегментов), но в ней, по крайней мере, развиты все три сегмента, в то время как при отсутствии ретиноевой кислоты вместо полноценной конечности развивается всего один палец.

Этот эксперимент явно свидетельствовал о «проксимализующей» роли ретиноевой кислоты, а, кроме того, наносил сокрушительный удар по модели прогрессивной зоны. Ведь если в клетках развивающейся конечности работают автономные часы, то при содержании в культуре они должны отсчитывать прошедшие деления, и, после трансплантации в эмбрион, запустить образование сразу дистальных структур. Но если под влиянием ретиноевой кислоты в конечности все же развиваются проксимальные сегменты, это означает, что автономных часов в клетках нет, и развитие конечности определяется градиентом веществ вдоль проксимо-дистальной оси, а отнюдь не прошедшим с начала ее образования временем. Кроме того, в данном эксперименте выработана методика сохранения в культуре клеток, которые могут дать начало почти полноценной новой конечности, что открывает огромные возможности для дальнейших исследований.

Итак, как же развивается конечность? Вначале, еще в почке, ее клетки находятся под влиянием сразу двух веществ — ретиноевой кислоты и факторов роста фибробластов (последние, как уже было здесь замечено, среди прочих своих свойств обладают способностью сохранять клетки в недифференцированном состоянии). Ретиноевой кислоты больше в основании почки, а факторов роста фибробластов — в кончике, и поэтому клетки основания могут дифференцироваться и образуют под воздействием ретиноевой кислоты проксимальные структуры. Клетки растут и дифференцируются, конечность удлиняется, и вот расположенные на ее кончике клетки уже сильно удалены от источника ретиноевой кислоты. «Проксимализующее» влияние ретиноевой кислоты затухает, и клетки начинают образовывать все более дистальные структуры.

Хорошо, но какова же тогда роль FGF? Позволяют ли эти белки образоваться дистальным структурам при отсутствии влияния ретиноевой кислоты — или заставляют их образоваться, каким-то образом на них влияя? Судя по всему, все-таки заставляют — по крайней мере, об этом свидетельствуют результаты экспериментов, проведенных второй — испанской — группой исследователей. В этих экспериментах в почке конечности затормаживали активность факторов роста фибробластов с помощью блокировки одного из рецепторов, на которые они действуют. В результате прекращалась экспрессия маркеров дистальных участков конечности. Это означает, что для развития дистальной части конечности необходимо влияние FGF. Иными словами, факторы роста фибробластов имеют «дистализирующий» эффект, а ретиноевая кислота — «проксимализующий». В таком случае развитие того или иного участка конечности определяется балансом между концентрациями FGF и ретиноевой кислоты.

Итак, роль ретиноевой кислоты в образовании конечностей в «цыплячьих» экспериментах показана достаточно убедительно. Но, увы, триумф биологов развития омрачается одним обстоятельством. В недавних экспериментах было обнаружено, что у мышей ретиноевая кислота, наоборот, НЕ играет важной роли в развитии конечности по проксимально-дистальной оси. Может быть, так оно и есть, и млекопитающим для правильного развития конечностей не нужна ретиноевая кислота. А может быть, картина сложнее, и на самом деле ретиноевая кислота действует не сама по себе, а через цепочку неисследованных пока посредников. В любом случае, тема нуждается в дальнейших исследованиях.

Первоначально эта статья была опубликована на «Элементах» [4].

Литература

1. Элементы: «Как клетки понимают, что одни должны стать волосами, другие костями, третьи мозгами и т. п.? И из какого центра им подаются команды?»;
2. K. L. Cooper, J. K.-H. Hu, D. ten Berge, M. Fernandez-Teran, M. A. Ros, C. J. Tabin. (2011). Initiation of Proximal-Distal Patterning in the Vertebrate Limb by Signals and Growth. Science. 332, 1083-1086;
3. A. Rosello-Diez, M. A. Ros, M. Torres. (2011). Diffusible Signals, Not Autonomous Mechanisms, Determine the Main Proximodistal Limb Subdivision. Science. 332, 1086-1088;
4. Элементы: «Уточнен механизм, по которому развиваются конечности у куриного эмбриона».