Конкурс «Био/Мол/Текст»-2021/2022

Эта статья участвовала в конкурсе «Био/Мол/Текст»-2021/2022 в номинации «Свободная тема» и будет опубликована в журнале «Химия и жизнь».

Партнер номинации — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

---

Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.

---

Генеральный партнер конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Введение. Что такое пластик и почему его не едят?

Все мы постоянно сталкиваемся с пластиковыми отходами: бутылки на обочине дорог, пакеты, летающие над нашими головами... Именно с подобных слов и начинается большинство статей, рассказывающих о новом способе разложения этого вездесущего ксенобиотика. Разумеется, накопление в природе этих веществ ведет к серьезным экологическим проблемам, и на эту тему уже написано множество как научных, так и научно-популярных статей. У человечества есть экономический стимул решать проблему, ведь пластмассы теряют 95% своей материальной ценности после однократного использования, что приводит к потере мировой экономики в размере 110 миллиардов долларов в год. Но вот что странно: использованный пластик воспринимается в лучшем случае как сырье для переработки, хотя это вещество может не только портить вид травы на лужайке, но и приносить пользу.

В этой статье речь пойдет не про абстрактные «пластики», а про конкретное вещество — полиэтилентерефталат (сокращенно ПЭТ). На любом пластиковом изделии есть свой номер внутри маркировки в виде треугольника, и ПЭТ обозначается цифрой 1 (рис. 1). Он часто встречается в быту, например, используется для изготовления пластиковых бутылок и переработки в волокна (для изготовления одежды — волокно в таком случае называется полиэстером). К сожалению, ПЭТ достаточно устойчив к гидролизу, что затрудняет его переработку [1].

Вы все наверняка слышали о таком полимере, как биопластик. Интуитивно кажется, что раз в названии присутствует «био», то речь идет о чем-то легко утилизируемом и не наносящем вреда природе. Однако реальность от этого далека.

ПЭТ, как один из самых часто используемых пластиков, давно пытаются получить с меньшим вредом для природы, и примером такой попытки является ПЭТ на биологической основе из возобновляемого растительного сырья. Его химическая формула ничем не отличается от нефтехимического пластика, только компоненты для его синтеза (терефталат и этиленгликоль) получены при помощи бактерий [2]. Но полученный из природного сырья биопластик — не значит безопасный для природы, он разлагается столько же, сколько и обычные пластмассы.

Есть также так называемые биоразлагаемые пластики — они действительно разлагаются в природе быстрее. Но это совсем не значит, что их можно закопать в саду или выбросить в океан: утилизировать их можно только при определенной температуре, влажности и освещенности. Например, существуют оксоразлагаемые пластики — это пластики с добавками, ускоряющими их распад на мельчайшие фрагменты под действием ультрафиолетовых лучей и кислорода. Такие биопластики приносят много вреда при неправильной утилизации. На полигонах они просто распадаются на микропластик, а добавки, в них входящие, так и вовсе потенциально токсичны.

Даже самые «биоразлагаемые» пластиковые пакеты далеко не так уж легко утилизировать, и это наглядно доказала работа ученых из Международной группы по исследованию отходов в морях. Исследователи поместили пакеты из различных видов пластика в разные природные условия: оставили под открытым небом, закопали в землю, погрузили в воду и протестировали в контролируемых лабораторных условиях. В итоге оставленные на солнце пакеты разложились примерно за 9 месяцев, а помещенные в воду и под землю практически не изменились. Эксперименты показали, что никакого полного разложения не существует и пакеты все равно оставляют после себя микроскопические частицы пластика и другие химические вещества [3]. Зачастую можно встретить данные, что вес пластика убывает на несколько десятков процентов за несколько месяцев, правда, речь там идет о разложении добавок в этом пластике.

Получается, что чудес не бывает и использование пластикового пакета с приставкой «эко» не сильно помогает природе. Но значит ли это, что пластик совсем нельзя утилизировать?

Актуальные методы биодеградации ПЭТ

Еще в 2016 году ученые из японского Университета технологий в Киото (Kyoto institute of technology) обнаружили, что бактерия Ideonella sakaiensis штамма 201-F6 способна разрушать ПЭТ до терефталевой кислоты и этиленгликоля (рис. 2). При этом, разумеется, они делают это с пользой для себя: идеонеллы не просто разрушают материал, но и используют его для получения энергии. Переработать тонкую (до 0,2 миллиметра) пленку Ideonella sakaiensis могут за шесть недель при температуре 30 °C. Оставшиеся в почве частицы ПЭТ могут разлагаться ей же: эта бактерия потребляет содержащийся в материале углерод. В ходе этого процесса микроорганизмы вырабатывают два необходимых для разложения ПЭТ фермента, названных ПЭТазами, которые можно выделить и напрямую использовать для переработки пластика. Однако реакция разложения идет очень медленно, и для переработки ПЭТ требуется генная модификация бактерии [4]. Подробнее об этом читайте в обзоре «Биомолекулы» [5].

Еще один эффективный способ биодеградации (рис. 3) — это использование фермента кутиназы компоста (LCC) из ветвей листьев. Его выделили из компостной кучи в 2012 году исследователи из Университета Осаки. Он разрывает связи между двумя строительными блоками ПЭТ: терефталатом и этиленгликолем. [6]

Ученые решили реконструировать LCC, чтобы увеличить его способность разрушать ПЭТ и сделать его термостабильным при 72 °C (температура быстрого разложения). Для этого исследователи заменили две аминокислоты, которые своей связью обеспечивали стабильную структуру молекулы, на цистеин. Дело в том, что у цистеина в составе есть атом серы, который может образовывать связи с другим таким же атомом. При сближении между цистеиновыми фрагментами образовывался дисульфидный мостик, который скреплял молекулу фермента. Ученые перебирали различные последовательности аминокислот для увеличения активности фермента и увеличения его термостабильности (т.к. разложение полимеров лучше идет при высокой температуре). В итоге полученная кутиназа была в 10 000 раз более эффективна при разрыве связей в ПЭТ, чем нативный (изначальный) LCC.

В небольшом реакторе, предназначенном для тестирования фермента, команда обнаружила, что LCC может расщепить до 90% ПЭТ (в эксперименте брали 200 граммов) за 10 часов. Затем исследователи использовали мономеры ПЭТ (терефталат и этиленгликоль), полученные после обработки ферментом, для синтеза нового ПЭТ. Также в реакции можно получить побочный продукт — сульфат натрия, примерно 600 граммов из одного килограмма ПЭТ.

Это вещество используется в производстве бумаги и моющих средств, а значит, является ценным сырьем для промышленности.

Мы не хотим мучить наших читателей сложной молекулярной и структурной биологией, но трехмерную модель фермента все-таки покажем (рис. 4).

Что объединяет все приведенные способы биодеградации? Люди, занимающиеся этой темой, воспринимают пластик исключительно как отходы, загрязняющие нашу планету. Однако проблему решить не получается, ведь пластик продолжает накапливаться.

Есть ли другой путь? Можно ли сделать из пластика что-то не просто безвредное, но еще и полезное, а главное, ценное? Именно этими вопросами задались ученые из Эдинбургского университета, которые смогли синтезировать из терефталевой кислоты (продукта разложения ПЭТ) известный всем ванилин, придающий кондитерским изделиям приятный запах свежей ванили.

Синтез ванилина из продуктов распада пластика

Натуральный экстракт ванили — это фильтрованная настойка бобов ванили на растворе этанола в воде. Получить такую настойку довольно тяжело, необходимо опускать стручки в горячую воду, ферментировать при высоких температурах в течение недели, и затем долго, в течение месяца сушить на открытом воздухе. Поскольку спрос на ванилин намного превышает возможности его получения из стручков ванили, произрастающих исключительно в тропическом поясе, сейчас активно развиваются способы его химического синтеза.

Наиболее широко использовалось производство ванилина из биомассы лигнина, но выход ванилина в этом процессе очень невысок. Сейчас большую часть ванилина получают синтезом из нефтепродуктов. Ванилин настолько востребован, что в 2007 году разработали новый способ его получения из навоза скота (что попутно решает проблему с фекальным загрязнением), за что автор исследования удостоилась Шнобелевской премии [7].

В недавней статье 2021 года исследователи из Эдинбурга испытали новый ферментативный путь с использованием генномодифицированных клеток Escherichia coli для синтеза ванилина из терефталевой кислоты [6]. Как же у них это получилось?

Авторы выбрали термостабильный фермент LCC WCCG15 (термостабильный вариант кутиназы компоста, далее просто LCC) в качестве биокатализатора, чтобы гидролизовать ПЭТ в терефталевую кислоту. В отличие от ПЭТазы из Ideonella sakaiensis, LCC высвобождает терефталевую кислоту напрямую и не требует дополнительных ферментов для гидролиза промежуточных соединений. ПЭТ получали из выброшенных пластиковых бутылок и обрабатывали полуочищенным LCC при 72 °C . Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и добавляли E. coli, а затем анализировали продукты реакции через 24 часа.

Но как из мономера пластика получить ванилин — известный ароматизатор и вкусовую добавку? Для наглядности приведем химические формулы этих веществ в схеме реакции (рис. 5).

Разумеется, как и в любой реакции, помимо основного продукта образуется множество побочных веществ, выход которых нужно минимизировать. Оптимизация процесса включала в себя добавление микроэлементов (ферменты зависимы от наличия в среде цинка и железа), н-бутанола (это увеличило проницаемость мембран для терефталевой кислоты), установление pH в районе 5, расчет оптимальной температуры реакции в 22 °C. Разумеется, исследователи шли путем проб и ошибок, поэтому условия подбирались экспериментально. После оптимизации процесса выход реакции в лабораторных условиях составил более 79%.

И что самое интересное, этот способ можно комбинировать с катализируемым кутиназой разложением ПЭТ, чтобы получить ванилин непосредственно из терефталевой кислоты при температуре окружающей среды в водных условиях.

Заключение

Без сомнений, исследователи из Эдинбургского университета проделали замечательную работу, но в чем ее принципиальное отличие от множества других? Обычно на утилизацию пластика компании тратят деньги, а с помощью этого метода деньги можно получать. Цена за 1 кг использованного пластика — 5 рублей. Цена же синтетического ванилина — 520 рублей за тот же 1 кг. Мировой спрос на ванилин составил около 37 000 тонн в 2018 году, а к концу 2025 года превысит 59 000 тонн [8].

Ванилин широко используется в качестве ароматизатора в различных продуктах пищевой промышленности, таких как хлебобулочные и кондитерские изделия, мороженое, шоколад и алкогольные напитки. Кроме того, он применяется в фармацевтической промышленности для маскировки неприятного вкуса. Ванилин также выступает как промежуточное соединение при производстве некоторых агрохимикатов и фармацевтических препаратов. Кроме того, сейчас ванилин исследуют в качестве возможного препарата для лечения псориаза на мышиной модели [9].

Впрочем, не стоит радоваться раньше времени, сами авторы работы недостаточно подробно разобрались в экономической части вопроса. Например, была оценена стоимость фермента, но сколько же суммарно стоят все остальные необходимые реагенты: щелочь, серная кислота и этиленгликоль? Также стоит помнить, что ПЭТ необходимо отсортировать от других пластиков, подготовить, очистить и измельчить, и это все тоже стоит денег. С другой стороны сами исследователи, проводя финальную проверку, брали «использованную пластиковую бутылку», значит, технология будет работать не только с химически чистым ПЭТ, но и с тем, который широко используют в промышленности.

Возникает вопрос: в чем подвох, почему мы не видим на полках магазинов ванилина с маркировкой «получен из пластика»? Дело в том, что сама статья вышла лишь в 2021 и на данный момент попросту нет налаженной схемы производства.

Существует также немаловажная проблема востребованности такого ванилина. Будут ли покупать люди товары с маркировкой «получено из переработанного пластика»? Если такой способ переработки ПЭТ и будет применяться, на масштабную рекламную акцию можно не рассчитывать.

Однако если это действительно такой эффективный способ, то совсем скоро мы, завтракая булочкой с ванилью, сможем внести свой вклад в борьбу с загрязнением планеты. С помощью этой технологии, мы, наконец, сможем извлекать выгоду из использованного ПЭТ, избегая вторичной переработки. Значит, появилась перспектива для финансирования новых разработок в этой области. Ведь как бы ни волновало широкую общественность проблема загрязнения планеты, никто не хочет выбрасывать деньги на ветер.

Литература

1. Elke Marten, Rolf-Joachim Müller, Wolf-Dieter Deckwer. (2005). Studies on the enzymatic hydrolysis of polyesters. II. Aliphatic–aromatic copolyesters. Polymer Degradation and Stability. 88, 371-381;
2. Manuel Salvador, Umar Abdulmutalib, Jaime Gonzalez, Juhyun Kim, Alex A. Smith, et. al.. (2019). Microbial Genes for a Circular and Sustainable Bio-PET Economy. Genes. 10, 373;
3. Imogen E. Napper, Richard C. Thompson. (2019). Environmental Deterioration of Biodegradable, Oxo-biodegradable, Compostable, and Conventional Plastic Carrier Bags in the Sea, Soil, and Open-Air Over a 3-Year Period. Environ. Sci. Technol.. 53, 4775-4783;
4. Yang L., Liu Y., Gao J., Peng X.W., Bai Z.H., Zhuang X.L. (2020). [Biodegradation of Expanded Polystyrene Foams in Zophobas morio: Effects of Gut Microbiota]. Huan Jing Ke Xue. 12, 5609–5616;
5. «Пластик, сэр!», или Бактериальная диета в стиле хай-тек;
6. Joanna C. Sadler, Stephen Wallace. (2021). Microbial synthesis of vanillin from waste poly(ethylene terephthalate). Green Chem.. 23, 4665-4672;
7. Mayu Yamamoto, Yasuhiro Futamura, Kouki Fujioka, Kenji Yamamoto. (2008). Novel Production Method for Plant Polyphenol from Livestock Excrement Using Subcritical Water Reaction. International Journal of Chemical Engineering. 2008, 1-5;
8. Vanillin Market Size, Share & Trends Analysis Report By End-use (Food & Beverage, Fragrance, Pharmaceutical), By Region (North America, Europe, Asia Pacific, Central & South America, MEA), And Segment Forecasts, 2018–2025. (2017). Grand View Research;
9. Hui-Man Cheng, Feng-Yuan Chen, Chia-Cheng Li, Hsin-Yi Lo, Yi-Fang Liao, et. al.. (2017). Oral Administration of Vanillin Improves Imiquimod-Induced Psoriatic Skin Inflammation in Mice. J. Agric. Food Chem.. 65, 10233-10242;
10. Uwe T. Bornscheuer. (2016). Feeding on plastic. Science. 351, 1154-1155;
11. V. Tournier, C. M. Topham, A. Gilles, B. David, C. Folgoas, et. al.. (2020). An engineered PET depolymerase to break down and recycle plastic bottles. Nature. 580, 216-219.