«Био/мол/текст»-2016

Эта работа опубликована в номинации «Наглядно о ненаглядном» конкурса «био/мол/текст»-2016.

---

Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

---

Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма «Атлас».

Наши читатели, конечно, понимают, что на рисунках ДНК, РНК и вирус СПИДа изображены схематически. Как они выглядят на самом деле, на примере 3D-моделей можно посмотреть по этим адресам: ДНК — factfile.org, РНК — elife-publishing-cdn.s3.amazonaws.com, ВИЧ — visual-science.com. — Ред.

Основная мишень для вируса иммунодефицита человека — это Т-лимфоциты, которые отвечают за иммунитет. Вирус проникает внутрь этих клеток, связываясь с рецептором CD4. Далее c его генетического аппарата, представленного РНК, копируется молекула ДНК [1]. После заражения ВИЧ Т-лимфоциты перестают поддерживать иммунитет в организме человека и становятся фабриками по производству все новых и новых копий вируса. При поражении иммунной системы даже самая незначительная простуда способна привести к тяжелым последствиям. Именно поэтому ВИЧ так опасен.

В 2007 году ученые модифицировали Cre-рекомбиназу , заставив ее распознавать концевые повторы последовательности ВИЧ и удалять их из генома человека [2], [3]. Но тогда речь шла всего лишь об одной последовательности, в то время как существует множество модификаций вируса иммунодефицита, имеющих разные концевые повторы.

Рекомбиназа Сre (causes recombination) была впервые обнаружена в 1981 году у бактериофага P1 исследователями Н. Стернбергом и Д. Гамильтоном. Рекомбиназа — это фермент, который способен удалять последовательность ДНК, узнавая ее концевые специфические сайты. Cre-рекомбиназа распознает концевые последовательности loxP (locus of crossing (x) over, P1) и вырезает фрагмент ДНК вируса P1, заключенный между ними. Узнав о таком замечательном свойстве этого фермента, многие молекулярные биологи стали применять его в своих экспериментах по редактированию генома.

Поэтому задача, стоящая перед авторами новой работы [4], заключалась в поиске такой последовательности длинных концевых повторов, которая бы максимально совпадала со всеми известными вариантами вирусной ДНК.

Для поиска такой консервативной последовательности они анализировали базу данных с геномами ВИЧ. Эта база данных, созданная при участии Лос-Аламосской национальной лаборатории (США), — крупнейшее в мире хранилище всех известных на сегодняшний день генетических данных о вирусе иммунодефицита человека. Информация хранится в виде непрерывных строчек из четырех букв, которые обозначают нуклеотиды ДНК. В отличие от подавляющего большинства организмов, ДНК для ВИЧ — это не «родная» генетическая молекула, а «перекодированный» вариант его собственной РНК. Молекула ДНК, полученная на базе РНК, называется обратным транскриптом.

Анализ всех концевых повторов из этой библиотеки позволил выявить наиболее подходящую последовательность, на 90% схожую с большинством подтипов вируса иммунодефицита.

Следующий этап работы заключался в создании рекомбиназы, способной распознавать такую последовательность и вырезать ее из генома. Для этого ученые применили уже хорошо зарекомендовавший себя метод молекулярной эволюции (чаще используется термин «метод направленной эволюции белковых молекул»).

Как правило, эволюционные процессы происходят без активного участия человека и длятся многие сотни лет. В ходе таких процессов наступает адаптация признаков в ответ на изменяющиеся условия. В XXI веке человечеству удалось «приручить» эволюцию, запуская ее в пробирке. Став одним из лабораторных методов, молекулярная эволюция, в частности, позволяет производить отбор белковых молекул с заданными свойствами. В ходе этой работы из множества мутантных белков рекомбиназ со случайно измененными аминокислотами был отобран один-единственный, способный узнавать вычисленную универсальную последовательность для всех известных ВИЧ.

Для начала «отбора» берутся генетические конструкции, нарабатывающие мутантные Cre-рекомбиназы, и смешиваются с ДНК, из которой им предстоит вырезать последовательность-мишень. Если рекомбиназа узнала мишень, то она вырезает ее. В результате ДНК теряет особый маркерный участок, который называется сайтом рестрикции (разрезания). При добавлении к ДНК фермента, который распознает этот сайт, молекула ДНК разделяется поперек на два фрагмента, и исследователи, поместив ДНК в специальный гель с красителем, видимом в ультрафиолетовом спектре, могут наблюдать две полоски вместо одной. В случае, когда рекомбиназа срабатывает верно, такого сайта нет, и при добавлении фермента ДНК не распадается на части. Именно по наличию одного фрагмента ДНК вместо двух и отбирали лучшие из лучших рекомбиназ. Отбор проходил в несколько этапов, пока наконец «правильная» рекомбиназа не была найдена.

Далее необходимо было проверить эффективность такой рекомбиназы при столкновении с реальной угрозой — вирусом инфицированного человека. Поэтому полученный фермент транспортировали в инфицированные иммунные клетки, взятые у пациента. После обработки рекомбиназой определили последовательность ДНК в клетках больного. Вирусных генов найдено не было. Поэтому эксперимент был признан удачным.

А что же происходит с теми участками, которые вырезали из генома? Они образуют кольцевую молекулу, которая уже не может встроиться обратно. Не может такая молекула и себя копировать. Вскоре она подвергается уничтожению ферментами — эндонуклеазами, расщепляющими ее на много маленьких нуклеотидов, которые затем идут на «строительство» собственной клеточной ДНК.

Но, как и десять лет назад, говорить о том, что ВИЧ полностью побежден, еще рано. Теперь основная проблема в такой системе лечения — придумать способ адресной доставки фермента рекомбиназы в пораженные клетки организма. Но учитывая бурно развивающиеся технологии, связанные как с геномным редактированием (например, широко известная система CRISPR/Cas9 [5]), так и с применением нанотехнологий [6] с участием молекул ДНК и золота [7] и робототехники при доставке медикаментов [8], [9], хочется верить, что скоро и эта задача будет решена.

Об истории открытия и усовершенствования системы CRISPR-Cas «биомолекула» недавно рассказала в обзоре «CRISPR-эпопея и ее герои» [10]. Строение и работу системы наглядно описывает инфографика «Просто о сложном: CRISPR/Cas» [11]. Также на страницах нашего портала вы найдете материалы об экспериментах китайских ученых в борьбе с раком при помощи CRISPR-технологий («От слов к делу: технологию CRISPR-Cas впервые применили для лечения онкозаболеваний» [12]) и успехах американских исследователей, которым удалось вырезать ДНК ВИЧ из генома культуры клеток Т-хелперов («Битва века: CRISPR vs ВИЧ» [13]). — Ред.

Литература

1. Rettner R. (2013). DNA: definition, structure & discovery. Live Science;
2. Sarkar I., Hauber I., Hauber J., Buchholz F. (2007). HIV-1 proviral DNA excision using an evolved recombinase. Science. 316, 1912–1915;
3. Как «вырезать» вирус?;
4. Karpinski J., Hauber I., Chemnitz J., Schäfer K., Paszkowski-Rogacz M., Chakraborty D. et al. (2016). Directed evolution of a recombinase that excises the provirus of most HIV-1 primary isolates with high specificity. Nature Biotechnology. 34, 401–409;
5. Северинов К. (2016). Редактирование генома с CRISPR/Cas9. ПостНаука;
6. Исламов Р.А. (2010). Нанотехнология для медицины. Нанометр;
7. Шуваев С.В. (2011). Лекарство заказывали? Нанометр;
8. Хель И. (2014). Как будут работать нанороботы? Hi-News.ru;
9. Хель И. (2014). Нанороботы: какое будущее нас ждёт с их удивительным потенциалом? Hi-News.ru;
10. CRISPR-эпопея и ее герои;
11. Просто о сложном: CRISPR/Cas;
12. От слов к делу: технологию CRISPR-Cas впервые применили для лечения онкозаболеваний;
13. Битва века: CRISPR vs ВИЧ.