Конкурс «био/мол/текст»-2017

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «био/мол/текст»-2017.

---

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

Спонсором приза зрительских симпатий и партнером номинации «Биомедицина сегодня и завтра» выступила фирма «Инвитро».

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Революция в понимании природы метастазирования

Усилия многих онкологов на протяжении последних десятилетий были направлены на установление деталей возникновения и развития рака — механизмов зарождения опухоли и регуляции ее активного роста, формирования благоприятного микроокружения из клеток стромы [2]. Эти знания несомненно привели к разработке новых подходов в терапии онкозаболеваний. Со временем стало понятно, что основная угроза рака заключена в способности к распространению по организму. Так, некоторые раковые клетки первичной опухоли (то есть развившейся изначально) отделяются от нее за счет эпителиально-мезенхимального перехода или других механизмов [3] и, попадая в кровоток или лимфоток, по маленьким капиллярам путешествуют в главные магистрали сосудистой системы. Они покидают ее за счет задержки в узких капиллярах органов, адгезии к их эндотелиальной стенке и выхода из просвета сосуда в строму органа (рис. 1). Лишь небольшой процент раковых клеток, покинувших первичную опухоль, преуспевает в этом процессе и выживает в новой среде. Эти клетки формируют будущие очаги роста опухоли в новых органах — метастазы.

Процесс рассеивания раковых клеток по организму, названный метастазированием (от древнегреч. «менять, переносить»: meta — «через» + histanai — «устанавливать»), впервые описал еще в 1889 году Стивен Педжет [4], но механизм его развития оставался загадкой для ученого сообщества долгое время (рис. 2).

Педжет провел аналогию такого распространения раковых клеток с прорастанием семян. Они тоже выживают и делятся на плодотворной «почве» — в подходящем микроокружении. В те времена невозможно было найти этому экспериментального подтверждения, и долго преобладала совсем иная теория — Джеймса Юинга (рис. 2). Он утверждал, что основную роль в распределении метастазов по организму играет динамика кровотока и устройство сосудистой системы.

Наконец в 1970-е годы в ходе нескольких экспериментов по инъекции радиоактивно меченных раковых клеток мышам Исаак Фидлер смог доказать, что результат метастазирования также зависит от природы раковых клеток. В этом случае клетки меланомы развивали метастазы только в легких, но не в печени, в сосудах которой они также задерживались, но позже не выживали [5].

Позднее было установлено еще больше фактов, подтверждающих, что раковые клетки разной природы метастазируют преимущественно в определенные органы и иногда даже в заданной последовательности. Например, клетки рака молочной железы — сначала в кости, печень, лимфатические узлы, легкие, а потом уже в мозг; клетки рака желудочно-кишечного тракта и яичников — в печень и легкие; рака простаты — в основном, в кости (рис. 1). Явление специфичного распределения метастазов по организму назвали органотропией метастазирования. Чаще всего метастазы встречаются в легких, печени и костях.

Несмотря на активные исследования, в онкологии все еще остается много вопросов без ответа. Отличаются ли метастазные раковые клетки от других клеток первичной опухоли? Что лежит в основе органотропии? Как метастазам удается выжить после удаления первичной опухоли и проведенной химиотерапии?

Генетическая и эпигенетическая гетерогенность при метастазировании

Генетическая информация лежит в основе программирования поведения клетки. Перерождение нормальных клеток организма в раковые (злокачественная трансформация) обусловлено мутациями в генах-драйверах, которые приводят к неконтролируемому клеточному делению. Помимо таких выгодных для опухолевых клеток мутаций, также происходят мутации в генах-пассажирах, то есть тех, что изначально не имеют влияния на рост опухоли. С каждым поколением, новым клоном внутри опухоли, накапливаются эти генетические изменения, и некоторые клоны преуспевают больше остальных, что стало основой для формирования представления об эволюции внутри опухоли. Одна из предложенных гипотез, почему некоторые клетки опухоли приобретают способность к метастазированию, основана на схожем со злокачественной трансформацией принципе. По всей видимости, у них тоже накапливаются мутации в генах-драйверах, которые запускают этот процесс. Однако экспериментального подтверждения она так и не нашла, ученые сходятся во мнении, что большинство клеток первичной опухоли способны метастазировать. А вот что происходит позже с геномами метастазных клеток?

В результате сравнения геномов клеток первичных опухолей молочных желез и их локальных (в ближайших лимфатических узлах) и отдаленных метастазов (в печени, легких, дальних лимфатических узлах) было установлено, что геномы метастазов продолжают эволюционировать в своих очагах роста независимо от первичной опухоли [6]. Интересно, что паттерн мутаций схож между метастазами в одном органе, но различен между метастазами в разных органах. Это означает, что раковые клетки на самом глубоком уровне адаптируются к новому микроокружению в зависимости от занятой ими ниши. Изучение генетических изменений при метастазировании рака поджелудочной железы выявило наличие разных субклонов (новых поколений клона), которые формируют метастазы. Однако различия между ними оказались не больше, чем между двумя случайно взятыми клетками одного организма [7].

Интересно, что обнаружили как минимум один ген, FBXW7, мутации в котором противодействуют метастазированию [8]. Происходит это за счет усиления провоспалительной реакции, пролиферации и активности T-лимфоцитов, которые стимулируют формирование адаптивного иммунитета к опухолевым клеткам. Таким образом, мутации в гене FBXW7 противодействуют опухолевой иммунносупрессии. Ее проявления, такие как уменьшение количества лимфатических сосудов и эффекторных T-лимфоцитов в первичной опухоли, связаны с лицензированием метастазирования [8].

Следующую ступень в регуляции экспрессии генов после непосредственных изменений в ДНК (мутаций, вариаций числа копий и т.д.) занимают эпигенетические изменения (метилирование гистонов, ДНК и др.) (рис. 3). По своей природе они более пластичны, более переменчивы по сравнению с генетическими изменениями и подвластны влиянию клеточной сигнализации, которая подстраивается под воздействие внешних факторов. Оказалось, что эпигенетический код значительно отличается в клетках метастазов по сравнению с первичной опухолью. При раке поджелудочной железы потеря большого количества меток неактивного хроматина (гетерохроматина) — метилирования гистонов (H3K9, H4K20) — и ослабление метилирования ДНК связаны с метастазированием. Эти модификации в раковых клетках переводят участки гетерохроматина в активное состояние, доступное для транскрипционных факторов, и в результате усиливают экспрессию генов онкогенеза, таких как регуляторы мезенхимального фенотипа, KRAS-сигнализации и метаболизма [9].

Метаболическая пластичность при метастазировании

Эпигенетическая регуляция является одним из важнейших механизмов программирования клеточного метаболизма. С ростом опухоли внутри нее образуются области с недостаточным снабжением кислородом (гипоксией), так как до них не доходят кровеносные сосуды. Это вызывает в раковых клетках активацию гена фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1α). Происходит это за счет эпигенетического освобождения, деметилирования промотора гена, который становится доступным для транскрипционных факторов. Усиленное образование и активность белка HIF-1α, в свою очередь, регулирует экспрессию генов множества метаболических ферментов и транспортеров, что приводит к комплексным изменениям метаболизма раковых клеток и поддерживает их потребности.

Клеточный метаболизм разделен на процессы расщепления с выделением энергии (катаболизм) и образования соединений с использованием энергии (анаболизм). Энергетический обмен клетки протекает за счет этапов клеточного дыхания — гликолиза, цикла трикарбоновых кислот и окислительного фосфорилирования. Раковые клетки по-своему приспосабливаются к сохранению продуктивности энергетического обмена в условиях недостатка кислорода. В первичной опухоли они, в основном, используют анаэробный гликолиз, а не окислительное фосфорилирование, как в нормальных клетках. Это усиленное поглощение глюкозы с преобразованием до лактата, выделяемого раковыми клетками, названо эффектом Варбурга. Он позволяет им выжить при гипоксии и активно пролиферировать за счет использования промежуточных соединений для биосинтеза и выделения энергии [10].

Преимущественный способ генерирования энергии у метастазов, однако, до сих пор мало изучен. Используя клетки рака молочной железы, обладающие широкой или специфической органотропией при метастазировании, ученые обнаружили различия в метаболизме первичной опухоли и метастазов. Раковые клетки, колонизировавшие кости и легкие, активировали использование окислительного фосфорилирования, колонизировавшие печень — гликолиз. Когда раковые клетки колонизировали все вышеперечисленные очаги, они активировали сразу оба метаболических пути (рис. 4) [11]. Похоже, что такая пластичность помогает раковым клеткам освоить новые ниши для колонизации. Например, в печени гликолитический фенотип поддерживается при росте метастазов за счет активности упомянутого ранее фактора HIF-1α, а также повышенной экспрессии белка PDK1. Это фермент, который ингибирует формирование соединения ацетил-КоА. И так как его поток на развилке с гликолитическим путем в цикл трикарбоновых кислот уменьшается, усиливается образование конечного продукта гликолиза — лактата [12].

Почему же для метастазов в одном органе выгоднее использовать преимущественно один вид метаболизма, чем другой? Ответ на этот вопрос и роль различных факторов в регуляции метаболической пластичности раковых клеток еще только предстоит узнать.

Понятие о преметастазных нишах

И все же метастазные раковые клетки не могут в одиночку справиться со столь непростой задачей — освоением совершенно незнакомого места обитания. Эксперименты группы Дэвида Лидена в 2005 году впервые показали, что первичная опухоль за счет продуцируемых факторов стимулирует формирование так называемых преметастазных ниш в различных органах. Ученые показали, что раковые клетки первичной опухоли за счет стимулирования рецептора фактора роста сосудов (VEGFR-1) на миелоидных клетках-предшественниках активируют их распространение из костного мозга в известные очаги развития метастазов [13]. Кроме того, в этих очагах запускается избыточная экспрессия фибробластами одного из компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) — фибронектина. Миелоидные клетки-предшественники, имея рецепторы клеточной адгезии (интегрины) к этому белку, активно «ловятся на удочку» и заселяют преметастазные ниши. Они секретируют воспалительные цитокины, факторы роста и проангиогенные факторы, стимулирующие формирование сосудов. Это способствует ремоделированию стромы и колонизации ее метастазами (рис. 5) [13].

Таким образом, в текущем представлении формирование метастазов происходит в несколько стадий. Начиная с раннего роста первичной опухоли происходит прайминг — обучение будущих ниш развития метастазов с помощью выделения различных факторов раковыми клетками, привлечения клеток из костного мозга. Затем клетки стромы первичной опухоли и преметастазных ниш (фибробласты, клетки миелоидного ряда, T-лимфоциты) формируют благоприятное микроокружение, лицензируя дальнейшее расселение метастазов. Фаза инициирования метастазирования заключается в росте сосудов, ангиогенезе, по которым метастазные клетки покидают первичную опухоль и приходят в преметастазные ниши. Прогрессирование — это финальный этап перехода микрометастазов в макрометастазы — вторичные сформированные опухоли. Он может занять от нескольких месяцев до нескольких лет (рис. 5).

Гетерогенность в механизмах формирования преметастазных ниш

Хотя для большинства органов характерна эта общая схема, существуют некоторые особенности в зависимости от места (органа) формирования ниши. Например, преметастазная ниша в печени и легких также формируется за счет привлечения нейтрофилов. Известно, что они могут помогать метастазирующим клеткам при интеграции в новую нишу за счет секретирования протеаз, цитокинов и непосредственного контакта с раковыми клетками при выходе из капилляров. Другой пример — клетки рака поджелудочной железы. Они выделяют экзосомы — липидные везикулы, которые переносят макрофаг-ингибирующий фактор (MIF). Их поглощают клетки Купфера в печени, и это запускает цепочку обучения ниши. Клетки Купфера синтезируют трансформирующий фактор роста β (TGF-β), клетки Ито активируются им и запускают перестраивание ВКМ, затем привлекая к нему макрофагов [15]. Их роль в микроокружении опухоли подробнее рассмотрена в статье «Одураченные макрофаги, или несколько слов о том, как злокачественные опухоли обманывают иммунитет» [16].

Метастазы в костях — одни из самых коварных, и их преметастазная ниша по-своему особенна. Например, оказалось, что при раке молочной железы только раковые клетки без рецепторов к эстрогену метастазируют в кости. Такие клетки первичной опухоли активно выделяют фермент лизилоксидазу. В костях он вызывает образование взрослых остеокластов и за счет этого стимулирует резорбцию кости. [17]. Именно эти «емкости» внутри кости метастазы занимают позднее. Другая и, пожалуй, основная функция лизилоксидазы — формирование поперечных связей между коллагеновыми волокнами ВКМ — также связана с образованием преметастазных ниш, но в легких. Преобразование коллагеновых волокон привлекает миелоидные клетки, а те позднее разрушают коллагеновые сети и дают путь раковым клеткам при заселении ткани легкого [18].

При некоторых типах рака, таких как меланома, для успешного метастазирования в лимфатические узлы и органы необходимо формирование новых лимфатических сосудов в их преметастазной нише. Недавно ученые установили, что такой лимфангиогенез начинается на ранних стадиях роста первичной опухоли, и медиатором его запуска является фактор роста мидкин, секретируемый клетками меланомы в составе экзосом или в свободном виде [19].

Безусловно, механизмы формирования преметастазных ниш в комплексе позволяют лучше понять развитие рака и не перестают удивлять своей сложностью.

Причины органотропии

Описанные различия в специфичных механизмах формирования ниш могут служить одним из объяснений органотропному метастазированию, но как раковые клетки, которые могут метастазировать сразу в несколько органов, выбирают только один из них?

Ключевой механизм, известный на данный момент, основан на обучении будущих очагов рассеивания метастазов с помощью специфичных к ним экзосом. Эти везикулы, ранее описанные в статье «Экзосома — механизм координации и взаимопомощи клеток организма» [20], представляют собой структуры с рецепторами на своей поверхности и генетическим и секретируемым материалом внутри. Ученые провели интересный эксперимент — выделили экзосомы от раковых клеток разного происхождения (рака груди, поджелудочной железы и пр.) и, внедрив их в кровоток мышей с отличным типом опухоли, показали, что с их помощью возможно перепрограммировать распределение метастазов по органам. Это обусловлено тем, что экзосомы разных типов рака преимущественно содержат на своей поверхности основные рецепторы адгезии, интегрины, специфичные к определенному белку ВКМ (к ламинину — α₆β₄ и α₆β₁; к фибронектину — α_vβ₅ и т.д.).

Именно они адресуют доставку экзосом в определенный орган, который преимущественно имеет этот специфический ВКМ-белок в составе стромы. Сливаясь с мембранами клеток стромы того или иного органа, экзосомы доставляют содержимое и запускают свою программу: в фибробластах легких — через экспрессию одних генов S100, в клетках Купфера в печени — через экспрессию других. Активность этих генов стимулирует клеточную сигнализацию и воспалительные реакции, которые занимаются обучением преметастазной ниши (рис. 6) [21].

Перспективы в терапии метастазирования

Подведем итог: описанные здесь механизмы, очевидно, усложняют картину течения онкозаболеваний и развития тактик их лечения. Важно подчеркнуть, что гетерогенность первичной опухоли и метастазов по ряду рассмотренных здесь признаков (генетическая, метаболическая, нишевая) дает понимание того, что следует использовать комбинированное и таргетное лечение на разных стадиях течения болезни. Как подтверждение тому — результаты одного из последних исследований, проведенных на материалах пациента с рецидивами между курсами длительной иммунотерапии. Сравнение популяций T-лимфоцитов из микроокружения разных метастазов показало, что они гетерогенны [22] и, следовательно, первичная, вторичные и т.д. опухоли по-разному отвечали на лечение.

Мы также знаем, что после химиотерапии зачастую выживают субклоны раковых клеток с полезными в новой среде мутациями. Под стрессом воздействия цитостатиков субклоны раковых клеток активируют секрецию факторов роста и запускают клеточную сигнализацию, препятствующую гибели (рис. 7). Кроме того, их выживанию помогает поддержка клеток стромы, заодно изменяющих свое поведение на «оборонительное» под эффектом терапии.

Обнаружение преметастазных ниш и понимание их устройства предложили по-новому взглянуть на развитие подходов в терапии. Если бы стало возможным предотвратить формирование преметастазных ниш, то с большой вероятностью было бы остановлено метастазирование, а значит, и возможность ремиссии. Будем и дальше следить за прорывами в этой области.

Литература

1. Shimpei I. Kubota, Kei Takahashi, Jun Nishida, Yasuyuki Morishita, Shogo Ehata, et. al.. (2017). Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250;
2. Опухолевые разговоры, или Роль микроокружения в развитии рака;
3. Krakhmal N.V., Zavyalova M.V., Denisov E.V., Vtorushin S.V., Perelmuter V.M. (2015). Cancer invasion: patterns and mechanisms. Acta Naturae. 7, 17–28;
4. Stephen Paget. (1889). THE DISTRIBUTION OF SECONDARY GROWTHS IN CANCER OF THE BREAST.. The Lancet. 133, 571-573;
5. Fidler I.J. (1970). Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor emboli labeled with 125 I-5-iodo-2’-deoxyuridine. J. Natl. Cancer Inst. 45, 773–782;
6. Lucy R. Yates, Stian Knappskog, David Wedge, James H.R. Farmery, Santiago Gonzalez, et. al.. (2017). Genomic Evolution of Breast Cancer Metastasis and Relapse. Cancer Cell. 32, 169-184.e7;
7. Alvin P Makohon-Moore, Ming Zhang, Johannes G Reiter, Ivana Bozic, Benjamin Allen, et. al.. (2017). Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nat Genet. 49, 358-366;
8. B. Mlecnik, G. Bindea, A. Kirilovsky, H. K. Angell, A. C. Obenauf, et. al.. (2016). The tumor microenvironment and Immunoscore are critical determinants of dissemination to distant metastasis. Science Translational Medicine. 8, 327ra26-327ra26;
9. Oliver G McDonald, Xin Li, Tyler Saunders, Rakel Tryggvadottir, Samantha J Mentch, et. al.. (2017). Epigenomic reprogramming during pancreatic cancer progression links anabolic glucose metabolism to distant metastasis. Nat Genet. 49, 367-376;
10. Вослед Варбургу — последние достижения в изучении биоэнергетики рака;
11. J. M. Rosen, C. T. Jordan. (2009). The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm. Science. 324, 1670-1673;
12. Fanny Dupuy, Sébastien Tabariès, Sylvia Andrzejewski, Zhifeng Dong, Julianna Blagih, et. al.. (2015). PDK1-Dependent Metabolic Reprogramming Dictates Metastatic Potential in Breast Cancer. Cell Metabolism. 22, 577-589;
13. Rosandra N. Kaplan, Rebecca D. Riba, Stergios Zacharoulis, Anna H. Bramley, Loïc Vincent, et. al.. (2005). VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827;
14. Yang Liu, Xuetao Cao. (2016). Characteristics and Significance of the Pre-metastatic Niche. Cancer Cell. 30, 668-681;
15. Bruno Costa-Silva, Nicole M. Aiello, Allyson J. Ocean, Swarnima Singh, Haiying Zhang, et. al.. (2015). Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826;
16. Одураченные макрофаги, или Несколько слов о том, как злокачественные опухоли обманывают иммунитет;
17. Thomas R. Cox, Robin M. H. Rumney, Erwin M. Schoof, Lara Perryman, Anette M. Høye, et. al.. (2015). The hypoxic cancer secretome induces pre-metastatic bone lesions through lysyl oxidase. Nature. 522, 106-110;
18. Janine T. Erler, Kevin L. Bennewith, Thomas R. Cox, Georgina Lang, Demelza Bird, et. al.. (2009). Hypoxia-Induced Lysyl Oxidase Is a Critical Mediator of Bone Marrow Cell Recruitment to Form the Premetastatic Niche. Cancer Cell. 15, 35-44;
19. David Olmeda, Daniela Cerezo-Wallis, Erica Riveiro-Falkenbach, Paula C. Pennacchi, Marta Contreras-Alcalde, et. al.. (2017). Whole-body imaging of lymphovascular niches identifies pre-metastatic roles of midkine. Nature. 546, 676-680;
20. Экзосома — механизм координации и взаимопомощи клеток организма;
21. Ayuko Hoshino, Bruno Costa-Silva, Tang-Long Shen, Goncalo Rodrigues, Ayako Hashimoto, et. al.. (2015). Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335;
22. Alejandro Jiménez-Sánchez, Danish Memon, Stephane Pourpe, Harini Veeraraghavan, Yanyun Li, et. al.. (2017). Heterogeneous Tumor-Immune Microenvironments among Differentially Growing Metastases in an Ovarian Cancer Patient. Cell. 170, 927-938.e20;
23. Joan Massagué, Anna C. Obenauf. (2016). Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529, 298-306.