Подписаться
Оглавление
Биомолекула

Антибиотики прямо под нашим носом

Антибиотики прямо под нашим носом

  • 21728
  • 10,9
  • 0
  • 9
Добавить в избранное print
Новость

Структурная формула нового пептидного антибиотика.

Немецкие ученые обнаружили новое оружие для борьбы с больничным монстром — мультирезистентным золотистым стафилококком. Долгие годы оно скрывалось не в вечной мерзлоте или Марианской впадине, а прямо под нашим носом. Вернее — в нём.

В последние годы во всем мире увеличилось количество инфекционных заболеваний, вызванных устойчивыми к антибиотикам бактериями. Организмы с множественной лекарственной резистентностью (multidrug-resistant organisms, MDRO), такие как метициллин-резистентный золотистый стафилококк, нечувствительные к ванкомицину энтерококки или резистентные к цефалоспоринам третьего поколения грамотрицательные бактерии, в ближайшие десятилетия могут стать более частыми причинами смерти, чем рак [1].

Доступные населению антибиотики теряют эффективность, а их частое и необоснованное применение приводит к отбору устойчивых форм бактерий внутри организмов людей и животных. MDRO в человеческом микробиоме трудно выявить, ведь обычно их носительство бессимптомно. Однако в стрессовых условиях (после хирургических операций, при травмах или иммуносупрессии) оно может перерасти в агрессивную инфекцию, побороть которую будет крайне сложно. А если еще учесть и частую устойчивость подобных бактерий к классическим дезинфектантам, становится понятным, почему MDRO считают настоящим бичом стационаров и роддомов. Они — куда более осязаемая угроза для населения всех континентов, чем тот же вирус Эбола, поэтому огромные усилия сейчас направляются на поиск и производство новых антибиотиков, способных «взломать» защитные системы MDRO.

Несколько лет назад удалось обнаружить, что представители человеческой микробиоты способны производить бактериоцины, поражающие близкородственных бактерий [2]. Например, в 2014 году из человеческого комменсала Lactobacillus gasseri выделили и описали новый синтезируемый рибосомами тиопептидный антибиотик  — лактоциллин [3].

О пептидных антибиотиках «биомолекула» подробно рассказывала ранее: «Антимикробные пептиды — возможная альтернатива традиционным антибиотикам» [4].

Может показаться странным, что человеческая микробиота производит антибиотики, ведь индустрия поиска противомикробных веществ всегда была сосредоточена на почвенных бактериях: считалось, что именно там бурлит жизнь и активно идет борьба за существование. Однако в микробиоме человека насчитывается более тысячи видов бактерий, конкурирующих за место и питательные вещества. Это способствует появлению настоящего «оружия массового поражения» — бактериоцинов, производимых с помощью ферментов двух типов — поликетидсинтаз и нерибосомных пептидсинтетаз [5].

Семейные разборки

Немецкий исследователь Александр Ципперер со своими сотрудниками в июле 2016 года сообщил о том, что обнаружил в человеческом носу бактерию Staphylococcus lugdunensis IVK28, которая подавляет рост метициллин-резистентного золотистого стафилококка (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) [1].

Штамм S. lugdunensis IVK28 эффективно боролся со своим вредоносным родственником лишь в условиях недостатка железа и только на твердых агаризованных средах (рис. 3, слева). Механизм противостояния был неясен, а потому Ципперер провел транспозонный мутагенез клеток выделенного штамма — чтобы выявить ген, ответственный за синтез смертельного для S. aureus вещества.

Антибактериальная активность S. lugdunensis

Рисунок 3. Антибактериальная активность S. lugdunensis против метициллин-резистентного S. aureus. Слева — дикий штамм IVK28 образует зону лизиса на культуре S. aureus. В центре — штамм IVK28ΔlugD (с «выключенным» встраиванием транспозона геном lugD) не оказывает влияния на золотистого стафилококка. Справа — штамм с восстановленной активностью гена lugD снова лизирует клетки конкурента.

В итоге удалось получить мутанта IVK28, который не мог подавлять рост MRSA. Анализ места встройки транспозона показал, что тот нарушил структуру гена предполагаемой нерибосомной пептидсинтетазы (НРПС). Оказалось, что этот ген вместе с другими последовательностями, связанными с биосинтезом антибиотиков, входит в состав оперона размером 30 т.п.н. Это указывало на то, что предполагаемая молекула ингибитора может быть комплексом нерибосомных пептидов.

Оперон методом ПЦР обнаружили во всех культурах S. lugdunensis, а значит, он характерен для всего вида, а не только для штамма IVK28. Однако GC-состав оперона (26,9%) отличался от GC-состава остального генома S. lugdunensis (33,8%), что свидетельствовало о возможном заимствовании этого полезного генетического кластера у других видов бактерий — путем горизонтального переноса .

Разношерстные участники и пикантные подробности бактериального горизонтального генетического переноса описаны в статье «Мобильные генетические элементы прокариот: стратификация „общества“ бродяжек и домоседов» [11].

Оперон состоит из генов lugA, B, C и D, кодирующих пептидсинтетазные белки (см. врезку ниже), а также из других генов, чьи продукты необходимы для синтеза и транспорта нерибосомного пептида.

Чтобы окончательно вменить оперону участие в антибактериальной деятельности S. lugdunensis, наименьший ген (lugD) удалили. Мутант ΔlugD, как и ожидалось, не мог подавлять рост золотистого стафилококка, но когда в него ввели плазмиду с работающим геном lugD, агрессивный фенотип восстановился (рис. 3, в центре и справа).

Секретное оружие

Выделенный Ципперером продукт lug-оперона оказался нерибосомным циклическим пептидом, состоящим из пяти аминокислот (двух D-валинов, L-валина, D-лейцина и L-триптофана) и тиазолидинового гетероцикла (рис. 4). Назвали антибиотик лугдунином.

Гены и синтез лугдунина

Рисунок 4. Кластер генов, биосинтетический путь и химическая структура лугдунина. а — Гены «субъединиц» (не модулей!) нерибосомной пептидсинтетазы S. lugdunensis: lugA, B, C и Dб — Функциональные домены продуктов оперона: А — аденилирующий, Р — пептидильный, С — конденсирующий, Е — эпимеризующий, R — редуктазный. Их специфические комбинации составляют модули — обособленные каталитические единицы фермента. Биосинтез лугдунина начинается, видимо, в инициирующем модуле LugD и продолжается последовательно с помощью LugA-C. в — Структурная формула лугдунина.

Химическим синтезом удалось получить продукт с идентичными природному лугдунину химическими свойствами и антибактериальным эффектом. Ученые предположили, что этот антибиотик ингибирует синтез бактериальных биополимеров — белков, ДНК и пептидогликанов [5].

В экспериментах немецких ученых лугдунин действовал не только на метициллин-резистентных стафилококков, но и на гликопротеин-резистентных, и даже на других грамположительных бактерий типа листерии и ванкомицин-резистентного энтерококка (табл. 1). Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) нового бактериоцина — 1,5–12 мкг × мл−1, что говорит о высокой активности вещества. При этом такие концентрации никак не влияли на человеческую сыворотку, не вызывали лизис нейтрофилов или эритроцитов и не ингибировали метаболическую активность моноцитов. Бактериальные же клетки под действием лугдунина в концентрации даже ниже МИК прекращали синтезировать ДНК, РНК, белки и компоненты клеточной стенки. В этом отношении лугдунин напоминает даптомицин, дающий такой же эффект, но способ действия которого пока не изучен. Не было отмечено возникновения резистентности клеток S. aureus к лугдунину даже после их месячного выращивания на малых концентрациях.

Таблица 1. Спектр активности лугдунина
Виды и штаммыРезистентностьМИК лугдунина (мкг × мл−1)
Staphylococcus aureus USA300 (LAC)MRSA1,5
+ 50% человеческой сыворотки крови1,5
Staphylococcus aureus USA300 (NRS384)MRSA1,5
Staphylococcus aureus Mu50GISA3
Staphylococcus aureus SA1133
Staphylococcus aureus RN42203
Enterococcus faecium BK463VRE3
Enterococcus faecalis VRE366VRE12
Listeria monocytogenes ATCC191186
Streptococcus pneumoniae ATCC496191,5
Bacillus subtilis 168 (trpC2)4
Pseudomonas aeruginosa PAO1>50
Escherichia coli DH5α>50
Условные обозначения: MRSA — метициллин-резистентные S. aureus; GISA — устойчивые к гликопротеинам S. aureus; VRE — ванкомицин-резистентные Enterococcus. Таблица из [1].

Испытания в боевых условиях

Как и полагается, способность лугдунина лечить стафилококковые инфекции продемонстрировали in vivo на мышиной модели (рис. 5). У шести мышей сбрили шерсть на спине и, повредив кожу многократным приклеиванием/отклеиванием пластыря, нанесли на это место золотистого стафилококка. Затем кожу обработали мазью, содержащей 1,5 мкг лугдунина, и спустя шесть часов оценили результат. Обработка новым антибиотиком сильно сокращала или даже полностью уничтожала популяцию S. aureus. Причем не только на поверхности кожи, но и в более глубоких ее слоях.

Идентификация природного антибиотика

Рисунок 5. Общая схема подхода к идентификации природного антибиотика. Из бактериальных популяций человеческого тела отбирают представителей, которые не могут сосуществовать с интересующими патогенными бактериями. Этих возможных конкурентов тестируют по отдельности на средах с инфекционным агентом. Из культуры, успешно подавляющей рост патогенов, выделяют антибиотик, действие которого проверяют на животных моделях.

[5], рисунок модифицирован и адаптирован

Чтобы понять, может ли S. lugdunensis помешать колонизации носовой полости позвоночных животных золотистым стафилококком в естественных условиях, ученые провели следующий эксперимент. В носы хлопковых хомяков ввели два вида смешанных культур (S. aureus + S. lugdunensis IVK28 и S. aureus + S. lugdunensis IVK28ΔlugD) и каждую по отдельности. В контрольных случаях, когда вводили по одному штамму, все три культуры стабильно колонизировали носовую полость. Однако при введении смеси S. aureus + S. lugdunensis IVK28 количество золотистого стафилококка через 5 дней значительно уменьшилось по сравнению со смесью S. aureus + S. lugdunensis IVK28ΔlugD. Этот эксперимент показал, что продукция лугдунина позволяет штамму IVK28 эффективно конкурировать с золотистым стафилококком in vivo.

Оставалось разобраться, предотвращает ли присутствие S. lugdunensis в носу человека колонизацию бактериями S. aureus. Ципперер и его коллеги исследовали мазки из носовых ходов 187 госпитализированных больных. Из них у 60 человек (32,1%) обнаружили золотистого стафилококка и у 17 человек (9,1%) — S. lugdunensis. И только у одного пациента с S. lugdunensis в носу обитал S. aureus. У всех выделенных штаммов S. lugdunensis ПЦР-анализ продемонстрировал наличие lug-оперона, а все обнаруженные штаммы S. aureus оказались восприимчивы к лугдунину.

Перспективы

Из-за высокой эффективности лугдунина авторы обсуждаемой работы предлагают использовать S. lugdunensis в борьбе с золотистым стафилококком, особенно у пациентов с высокими рисками развития инфекции — после операций, иммуносупрессии или гемодиализа. Ранее пробиотическими, как правило, называли бактерий, активно действующих на благо макроорганизма в желудочно-кишечном тракте. Группа Ципперера выступает за расширение понятия «пробиотики» — включение туда бактерий, борющихся с инфекциями и в других местах человеческого тела, таких как носовая полость или кожа.

В очень редких случаях и сам S. lugdunensis может вызывать заболевания, но если удастся создать мутантов, полностью утративших факторы вирулентности, или встроить lug-оперон в абсолютно «мирные» бактерии, можно разработать безопасный пробиотический препарат.

Лугдунин оказался первым обнаруженным бактериоцином нового класса — макроциклических тиазолидиновых пептидных антибиотиков. Все проверенные штаммы S. aureus (как природные, так и лабораторные) не смогли выработать резистентности к нему. Это дает надежду на то, что лугдунин в будущем станет коммерческим препаратом для борьбы с золотистым стафилококком.

И наконец, сам факт обнаружения нового антибиотика у представителя человеческой микробиоты должен послужить стимулом для активизации поиска других продуцентов бактериоцинов в составе именно таких сообществ. В дальнейшем это поможет медикам успешнее сдерживать наступление мультирезистентных патогенов.

Литература

  1. Zipperer A., Konnerth M.C., Laux C., Berscheid A., Janek D., Weidenmaier C. et al. (2016). Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535, 511–516;
  2. Dobson A., Cotter P.D., Ross R.P., Hill C. (2012). Bacteriocin production: a probiotic trait? Appl. Environ. Microbiol. 78, 1–6;
  3. Donia M.S., Cimermancic P., Schulze C.J., Wieland Brown L.C., Martin J., Mitreva M. et al. (2014). A systematic analysis of biosynthetic gene clusters in the human microbiome reveals a common family of antibiotics. Cell. 158, 1402–1414;
  4. Антимикробные пептиды — возможная альтернатива традиционным антибиотикам;
  5. Lewis K. and Strandwitz P. (2016). Antibiotics right under our nose. Nature. 535, 501–502;
  6. Википедия: «Золотистый стафилококк»;
  7. Карпов И.А. и Качанко Е.Ф. (2005). Стафилококковая инфекция: клинические аспекты и перспективы терапии. Медицинские новости. 9, 53–56;
  8. Mandal A. (2012). What is Staphylococcus aureus? News-Medical.net;
  9. Naber C.K. (2009). Staphylococcus aureus bacteremia: epidemiology, pathophysiology, and management strategies. Clin. Infect. Dis. 48, S231–S237;
  10. Стафилококк золотистый (Staphylococcus aureus). ГастроСкан;
  11. Мобильные генетические элементы прокариот: стратификация «общества» бродяжек и домоседов;
  12. Википедия: «Нерибосомные пептиды»;
  13. Caboche S., Pupin M., Leclère V., Fontaine A., Jacques P., Kucherov G. (2008). NORINE: a database of nonribosomal peptides. Nucleic Acids Res. 36, D326–D331;
  14. Mironovskiĭ M.L., Ostash B.E., Fedorenko V.A. (2010). Diversity of genes encoding nonribosomal peptide synthetases in the Streptomyces sioyaensis genome. Genetika. 46, 896–903.

Комментарии