Конкурс «Био/Мол/Текст»-2022/2023

Эта работа опубликована в номинации «Своя работа» конкурса «Био/Мол/Текст»-2022/2023.

Партнер номинации — компания «Хеликон».

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Болит живот, и ничего не хочется...

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) — это группа заболеваний, для которых характерно острое или хроническое воспаление в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), преимущественно в толстой и тонкой кишке [1], [2]. Современной науке неясно, что и как именно запускает развитие ВЗК, и как полностью излечиться от них. Вдобавок к образу жизни, питанию, экологии и возрасту с предрасположенностью к ВЗК связывают около 200 генов. Главное, что мы знаем на данный момент: ВЗК возникают тогда, когда нарушается баланс между про- и противовоспалительными сигналами, стенка кишечника становится более проницаемой, и иммунная система хозяина начинает остро реагировать на симбиотическую микробиоту, в норме населяющую полость кишки [2]. Поэтому стратегия лечения направлена на ослабление иммунного ответа, но не устранение причин ВЗК.

Пациенты с ВЗК страдают от болей в животе, проблем со стулом и потери веса. Вдобавок, ВЗК может сопровождаться депрессией, тревогой, биполярным расстройством, бессонницей и отсутствием мотивации [3], [4]. Действительно, как тут радоваться, если чуть ли не каждый прием пищи причиняет боль? Но не всё так просто! Самого факта наличия болезни недостаточно, чтобы психика пациента страдала, нужна материальная основа. В качестве такой основы выступает ось «кишечник—мозг» — система взаимодействий центральной нервной системы (ЦНС) и ЖКТ, которая состоит из нервных и биохимических связей. Значимый вклад в последние привносит как раз та самая микробиота, на которую иммунная система хозяина агрессивно реагирует в моменты обострения ВЗК [5]. Что особенно интересно, микробиоты больного ВЗК и здорового человека различаются по видовому и количественному составу [6]. Это означает, что, изучая ВЗК, мы должны учитывать влияние микробиоты на организм и vice versa.

Мыши с «голой» кишкой

Любопытные ученые создали десятки моделей ВЗК, отражающие разные аспекты этого многогранного состояния [7]. Одна из них — модель муцин-дефицитных мышей, у которых отключен ген Muc2. Этот ген необходим для синтеза в бокаловидных клетках кишечника муцина-2 — основного гликопротеина слизи кишки (рис. 1). В норме муциновый, он же слизистый, слой покрывает внутреннюю стенку кишки, одновременно отодвигая микробы от эпителия и предоставляя им среду для питания (да, некоторые микробы любят кушать вашу слизь) [8]. У мутантных мышей бокаловидные клетки не могут вырабатывать муцин, и микробы лежат на «голом» эпителии, лишний раз тревожа и без того беспокойный иммунитет хозяина [9], [10]. Как следствие, такие мыши страдают от хронического воспаления, проблем с набором массы тела, предрасположены к выпадению прямой кишки и образованию опухолей [11].

А как ведут себя мыши, когда у них болит живот?

Исходя из описания муцин-дефицитных мышей, было бы логично предположить, что их поведение должно характеризоваться пассивностью, тревожностью и депрессивными чертами (рис. 2). Удивительно, но это не так! Да, в своей собственной клетке такие мыши передвигаются менее активно и из-за диареи пьют больше воды по сравнению с контрольными мышами (в качестве контроля использовались очень популярные среди исследователей мыши линии C57BL/6 [12]; они содержались отдельно от Muc2-дефицитных мышей). Но после нескольких поведенческих тестов стало очевидно: мыши без гена Muc2 менее тревожны, куда более активны, храбры и любознательны. Далее мы рассмотрим различные поведенческие тесты и оценим результаты, которые показали муцин-дефицитные мыши.

Важно помнить, что все манипуляции, которые исследователи проводят с животными, проходят строгую проверку в специальном этическом комитете на предмет гуманности и оправданности.

Исследовательская деятельность

Один из самых популярных поведенческих тестов — тест открытого поля (рис. 3а). Мышь сажают в центр белой ярко освещенной арены и оценивают, как она себя ведет в незнакомом месте. С точки зрения мыши центральная часть арены является более опасной, чем периферия со стенкой, где есть укрытие от потенциального хищника хотя бы с одной стороны. В то же время обследование незнакомой территории может принести какие-то приятные бонусы, например, еду или самку для спаривания. Поэтому оценивается именно баланс между этими двумя возможностями. Оказалось, что муцин-дефицитные мыши предпочитают проводить больше времени в центре поля по сравнению с контрольными. Вдобавок они чаще встают на задние лапки, более активно изучая пространство.

Еще один похожий тест — «темно-светлая камера» (рис. 3б). Он проводится в установке, поделенной на две части, одна из которых открыта и ярко освещена, а другая закрыта от света. Мышам, как сумеречным животным, более комфортно находиться в темной, закрытой части (как в норке), а вылезать в ярко освещенную часть поля лишь для рискованного изучения территории. И здесь муцин-дефицитные мышки чаще выходили в светлую область, активно ее исследовали и проводили в ней больше времени, чем контрольные, здоровые. Это означает, что они менее тревожны.

Психические нарушения и... ловкость?

Склонность к депрессивному поведению определяют по реакции животного при помещении в безвыходное положение. Тест с подвешиванием мыши за хвост направлен на то, чтобы оценить, как быстро она оставит попытки освободиться (рис. 4а). Контрольные мыши действительно в среднем через пару минут теряли надежду выбраться из неудобного положения и неподвижно повисали. А вот время наступления неподвижного состояния у муцин-дефицитных мышей так и не удалось оценить! Они активно искали пути выхода до тех пор, пока не удавалось извернуться, поймать свой собственный хвост и вскарабкаться по нему в более комфортное положение. Неужели хроническое воспаление кишечника у мышей может приводить к развитию ловкости одновременно со снижением депрессивного поведения?

Возможно, мутантные мыши просто очень упорные? В конце концов, некоторые контрольные мыши тоже изредка умудрялись взбираться по собственному хвосту. Поэтому исследователи проверили координацию и ловкость мышей с помощью ротарода. Ротарод — это установка из вращающегося стержня, на который усаживают мышь и проверяют, как хорошо она балансирует и как долго не падает (рис. 4б). И тут муцин-дефицитные мыши не подвели: удерживались на стержне дольше и выдерживали бóльшую скорость вращения, чем контрольные.

Тест на потребление сахара, оценивающий склонность к ангедонии (неспособности получать удовольствие), показал, что лишенные муцина мутанты в удовольствиях себе не отказывают (рис. 4в). Из двух предложенных поилок: с раствором сахара и простой водой — все мыши одинаково предпочитали сладкий напиток. С учетом прошлых тестов мы четко видим отсутствие склонности к депрессии у мышей без муцина.

Склонность к аутичному или обсессивно-компульсивному поведению можно оценить с помощью теста с шариками (рис. 4г). 20 стеклянных шариков диаметром около сантиметра укладывали в клетку с подстилом из березовых опилок на равном расстоянии друг от друга. Мыши со склонностью к повторяющемуся поведению стремятся упорядочить пространство вокруг себя и один за другим закапывают шарики, демонстрируя своего рода ритуал. Мыши без психических нарушений обычно стеклянные шарики осматривают, но целенаправленно не закапывают. Муцин-дефицитные мыши обращали на шарики еще меньше внимания, чем контрольные, явно показывая, что их психика в полном порядке.

Память, обучение и сенсомоторная активность

Интересно также оценить когнитивные способности животных. Лабиринт Барнеса — это ярко освещенное открытое поле, на периферии которого на равных расстояниях от центра находятся выходы в темные «норки» (рис. 5а). Таких норок всего 20, но лишь в одной из них мышь может спрятаться. В первый день мыши «учатся»: запоминают кратчайший путь до правильной норки, а через несколько дней исследователи проверяют, как хорошо они его запомнили. И исходя из полученных результатов, контрольные и муцин-дефицитные мыши справляются с этим заданием одинаково успешно, то есть их колит не влияет на долговременную память.

Другой тест на память — это Т-образный лабиринт (рис. 5б). Мышь сажают в коридорчик, выходя из которого она попадает в Т-образную развилку и выбирает, куда идти — в левый или правый рукав. Для мышей в природе вполне естественно не ходить одними и теми же путями — так проще найти еду, и хищник не выследит. Это явление называют спонтанной альтерацией. В начале теста не дается выбора рукава, открыт только один. Затем мышь сажают в начало, и открываются оба пути. Мышь должна выбрать рукав, отличный от того, что проходила в прошлый раз. Выбор повторяют несколько раз, оценивая процентное соотношение «ошибок» (два одинаковых выбора подряд) и «верных выборов» (смену направления движения). У муцин-дефицитных мышей это отношение было таким же, как у контрольных. Следовательно, рабочая кратковременная память у них в порядке.

Тест на рефлекс вздрагивания (startle reflex) проводят, чтобы оценить, как работают рефлексы мыши, а также такие функции ЦНС, как привыкание и преимпульсное ингибирование (рис. 5в, 5г). Исследователь включает резкий звук (110–120 Дб) и смотрит, как сильно животное рефлекторно вздрагивает и как быстро привыкает. Преимпульсное ингибирование — это когда перед основным, «пугающим» сигналом, раздается сигнал послабее (65–85 Дб), «предупреждающий», и в норме нервная система животного приучается не реагировать или слабо реагировать на пугающий сигнал после предупреждающего. При различных психических нарушениях, например, шизофрении или аутизме этот параметр ЦНС нарушается. Исследователи не обнаружили различий в преимпульсном ингибировании между группами мышей, однако мутанты вздрагивали менее активно (пониженная тревожность дает о себе знать!) и плохо привыкали к резким звукам. Похоже, вместе со снижением тревожности у мутантов нарушена способность отделять важные сигналы от неважных и приспосабливаться.

Социальное поведение

Как же ведут себя храбрые, ловкие, любопытные, не склонные к депрессии и вместе с тем безнадежно больные колитом мыши с другими представителями своего вида? На это могут ответить тесты на социальное поведение. Впрочем, полученные ответы вызвали куда больше вопросов...

Тест с двумя интрудерами (от англ. intruder — нарушитель, незваный гость) подразумевает помещение в клетку животного-самца двух незнакомых ему представителей его вида: самки и самца (рис. 6а). В качестве интрудеров выступают мыши другой линии, BALB/c — белые альбиносы, их легко отличить от тестируемой мыши, а одного из интрудеров (обычно самку) вдобавок помечают краской на спине. Затем исследователь в течение нескольких минут считает, сколько времени тестируемая мышь уделит самке, сколько самцу, обнюхивая, ухаживая или выражая агрессию. Обычный самец в таком тесте большую часть времени уделяет внимание самке, обнюхивая, облизывая, а позже приступает к более решительным действиям. Движимые инстинктом размножения, они нередко пытаются делать садки на самок. С самцом-чужеземцем тестируемая мышь контактирует меньше, проявляет агрессию, кусает, дерется, сердито бьет хвостом, гоняет по всей клетке — это ЕГО территория, и чужакам здесь не рады. Крайне редко бывает такое, что мышь совершает над самцом движения, похожие на садку на самку, и это интерпретируется, как акт агрессии и доминирования.

Как же обстояли дела с лишенными муцина зверьками? Любопытно, но они не проявляли предпочтения к самкам и проводили равное количество времени и с самками, и с самцами! Это проявлялось в том, что с самцом они контактировали гораздо чаще, чем контрольные мыши — опять же, наравне с самками. Отличалось и само их «общение»: мутанты проявляли агрессию к самкам, нападали на них, а с самцами пытались спариваться! Что происходит?? Как колит может вызывать потерю предпочтения самок самцу?

«Может, дело в их восприятии запахов? Может, они потеряли способность различать их?» — подумали исследователи. И провели тест на различение запахов (рис. 6б). Они помещали в клетку голодной мыши две одинаковые емкости: одна наполнена пахнущей едой, другая — стеклянными бусинами. Все животные одинаково предпочитали еду, следовательно, они различали запахи.

Может быть, они не различают именно запахи самца и самки, поэтому путают их? Проверили это с помощью теста предпочтения запахов, помещая в клетки самцов два подстила: один из клетки самца, другой из-под самки (рис. 6в). И здесь мыши-мутанты вели себя, как и ожидалось: выражали явное предпочтение подстилу из клетки самки. Похоже, здесь дело именно в отсутствии разницы в поведении муцин-дефицитных мышей в отношении представителей разных полов.

Невидимые виновники происходящего

Ученые усомнились в том, что хроническое воспаление приводит к такому поведению, поскольку на других моделях колита подобного не наблюдалось. Тогда они получили мышей, которые не имели мутации в гене Muc2, но были вскормлены и выращены вместе с мутантами по этому гену в течение нескольких поколений, поэтому у них сформировалась одинаковая микробиота. Их также провели через все вышеописанные тесты, и обнаружили, что они хорошо воспроизводят ранее выявленные странности! Однако оказалось, что, если покормить мышей с нормальным генотипом и нарушениями в поведении антибиотиком широкого спектра амоксициллином в сочетании с клавулановой кислотой, поведение «исправляется» — становится таким же, как у контрольных мышей. Стало быть, причина повышенной храбрости, психической устойчивости, ловкости и отсутствия предпочтения самок самцам у мышей кроется в составе микробиоты .

О том, как формируется микробиота у человека, можно почитать на «Биомолекуле»: «Микробиом кишечника: мир внутри нас» [13].

Изучив микробное сообщество, населяющее кишечник мышей, исследователи обратили внимание на такую бактерию, как аккермансия (Akkermansia muciniphila) [20]. Ее количество было выше у мутантных мышей и нормальных мышей, выращенных вместе с мутантными, по сравнению с контрольной группой.

Кто вообще такая эта Akkermansia muciniphila? Это грамотрицательная анаэробная неподвижная бактерия, которая питается белками-муцинами из кишечника (рис. 7). Обычно ее наличие у человека связывают с положительным влиянием на барьерную функцию кишки, иммунитет и здоровое пищеварение [14]. Уже известно о том, что аккермансия снижает депрессию, связанное с тревогой и повторяющееся поведение, двигательную дегенерацию, дефицит обучения и памяти в различных моделях мышей, однако ее влияние на половое и социальное поведение, похоже, было выявлено впервые [15], [16]. Что интересно, при ВЗК у людей численность аккермансии снижается [17].

В доказательство гипотезы о том, что именно аккермансия приводит к сдвигам в поведении мышей, исследователи с помощью сочетания антибиотиков ванкомицина и рифампицина стимулировали у нормальных мышей размножение аккермансии. Затем провели поведенческие эксперименты, и... вновь наблюдали выраженную храбрость и сниженную тревожность в тестах «открытое поле» и «свет—темнота»! Еще более ярким было влияние на социальное поведение: после кормления комбинацией ванкомицина и рифампицина мыши дикого типа теряли интерес к самкам. Даже нарисовалась тенденция — чем больше в кишечнике аккермансии, тем меньше мыши взаимодействуют с самкой и больше с самцом.

Дополнительные исследования показали, что наличие больших количеств аккермансии в кишечнике приводит к изменениям в составе крови и мозга животных. В мозге повышается концентрация глицина — тормозного нейромедиатора, который участвует в контроле тревожности и сенсомоторной активности. Многие могли слышать о том, что глицин пьют «от нервов». В крови же обнаружились повышенные количества веществ, участвующих в синтезе глицина — бетаина и холина. Тогда ученые вкололи муцин-дефицитным мышам вещества, которые специфично блокируют сайты связывания рецепторов мозга с глицином. Это привело к «исправлению» поведения в тестах: животные стали более осторожными, менее агрессивными и начали предпочитать общение с самкой. Исходя из этого, можно сделать вывод, что аккермансия в процессе своей жизнедеятельности выделяет какие-то вещества, которые изменяют состав метаболитов в крови, что в свою очередь приводит к увеличению синтеза глицина в мозгу, и тот оказывает влияние на поведение. Таким образом, мы вместе с авторами работы проследили одну из интригующих связей оси «кишечник—мозг».

Эта работа заставляет задуматься о том, действительно ли мы хозяева своей жизни. На «Биомолекуле» уже писали о том, что наши симбионты могут отвечать за наше телосложение [18] и пищевые привычки [19]. В разобранной работе показано, что они также могут влиять на психическую стабильность, ловкость и социальные взаимодействия мышей. Но это вовсе не значит, что нужно срочно чистить свой организм антибиотиками в попытке избавиться от влияния микробов. Это лишь в очередной раз подтверждает, что каждый организм — сложная цепь взаимодействий между всеми его составляющими, и при изучении того, как работает тело, необходимо учитывать все возможные аспекты.

Литература

1. Maryana V. Morozova, Mariya A. Borisova, Olga A. Snytnikova, Kseniya M. Achasova, Ekaterina A. Litvinova, et. al.. (2022). Colitis-associated intestinal microbiota regulates brain glycine and host behavior in mice. Sci Rep. 12;
2. Lidiya V. Boldyreva, Maryana V. Morozova, Snezhanna S. Saydakova, Elena N. Kozhevnikova. (2021). Fat of the Gut: Epithelial Phospholipids in Inflammatory Bowel Diseases. IJMS. 22, 11682;
3. C D Moulton, P Pavlidis, C Norton, S Norton, C Pariante, et. al.. (2019). Depressive symptoms in inflammatory bowel disease: an extraintestinal manifestation of inflammation?. Clinical and Experimental Immunology. 197, 308-318;
4. Rachel Neuendorf, Aubrey Harding, Noelle Stello, Douglas Hanes, Helané Wahbeh. (2016). Depression and anxiety in patients with Inflammatory Bowel Disease: A systematic review. Journal of Psychosomatic Research. 87, 70-80;
5. Fei Huang, Xiaojun Wu. (2021). Brain Neurotransmitter Modulation by Gut Microbiota in Anxiety and Depression. Front. Cell Dev. Biol.. 9;
6. Katsuyoshi Matsuoka, Takanori Kanai. (2015). The gut microbiota and inflammatory bowel disease. Semin Immunopathol. 37, 47-55;
7. Atsushi Mizoguchi. (2012). Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 263-320;
8. Malin E. V. Johansson, Daniel Ambort, Thaher Pelaseyed, André Schütte, Jenny K. Gustafsson, et. al.. (2011). Composition and functional role of the mucus layers in the intestine. Cell. Mol. Life Sci.. 68, 3635-3641;
9. Mariya A. Borisova, Kseniya M. Achasova, Ksenia N. Morozova, Evgeniya N. Andreyeva, Ekaterina A. Litvinova, et. al.. (2020). Mucin-2 knockout is a model of intercellular junction defects, mitochondrial damage and ATP depletion in the intestinal epithelium. Sci Rep. 10;
10. Malin E. V. Johansson, Jessica M. Holmén Larsson, Gunnar C. Hansson. (2011). The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host–microbial interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 108, 4659-4665;
11. Maria Van der Sluis, Barbara A.E. De Koning, Adrianus C.J.M. De Bruijn, Anna Velcich, Jules P.P. Meijerink, et. al.. (2006). Muc2-Deficient Mice Spontaneously Develop Colitis, Indicating That MUC2 Is Critical for Colonic Protection. Gastroenterology. 131, 117-129;
12. Kazuyuki MEKADA, Kuniya ABE, Ayumi MURAKAMI, Satoe NAKAMURA, Hatsumi NAKATA, et. al.. (2009). Genetic Differences among C57BL/6 Substrains. Exp. Anim.. 58, 141-149;
13. Микробиом кишечника: мир внутри нас;
14. Qixiao Zhai, Saisai Feng, Narbad Arjan, Wei Chen. (2019). A next generation probiotic, Akkermansia muciniphila. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 59, 3227-3236;
15. Zihao Ou, Lulu Deng, Zhi Lu, Feifan Wu, Wanting Liu, et. al.. (2020). Protective effects of Akkermansia muciniphila on cognitive deficits and amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nutr. Diabetes. 10;
16. Aurelijus Burokas, Silvia Arboleya, Rachel D. Moloney, Veronica L. Peterson, Kiera Murphy, et. al.. (2017). Targeting the Microbiota-Gut-Brain Axis: Prebiotics Have Anxiolytic and Antidepressant-like Effects and Reverse the Impact of Chronic Stress in Mice. Biological Psychiatry. 82, 472-487;
17. Chin Wen Png, Sara K Lindén, Kristen S Gilshenan, Erwin G Zoetendal, Chris S McSweeney, et. al.. (2010). Mucolytic Bacteria With Increased Prevalence in IBD Mucosa Augment In Vitro Utilization of Mucin by Other Bacteria. Am J Gastroenterol. 105, 2420-2428;
18. Почему так сложно похудеть, или Влияние кишечной микробиоты на метаболизм;
19. Чего от нас хотят микробы?;
20. Akkermansia muciniphila — мал золотник, да дорог.