В клетках прокариот имеется несколько защитных молекулярных механизмов, препятствующих развитию вирусной инфекции и использующих разные способы распознавания чужеродного генетического материала.

Один из самых первых открытых способов защиты, система рестрикции-модификации, распознает чужеродную ДНК вирусного происхождения по отсутствию в ней метильных меток в определенных коротких последовательностях нуклеотидов. Тогда как в клеточной ДНК такие последовательности содержат метильные метки. После распознавания вирусную ДНК измельчают эндонуклеазы рестрикции.

В защитных системах CRISPR/Cas в локус CRISPR вставляются короткие фрагменты ДНК из вирусных геномов, так что при повторном заражении вирусный геном распознается с помощью комплементарной РНК, считанной с соответствующего фрагмента в геноме микроорганизма, и разрушается специальными белками.

Еще одна плохо изученная защитная система, известная как BREX (от англ. BacteRiophage EXclusion), по принципу распознавания чужеродной ДНК напоминает системы рестрикции-модификации, хотя механизм уничтожения такой ДНК в ходе работы BREX неизвестен. BREX-система активируется при попадании в клетку бактерии фаговой ДНК, в которой неметилированы специфические сайты (BREX-сайты), распознаваемые метилтрансферазой BrxX — важным белком системы BREX. После обнаружения неметилированных BREX-сайтов в чужеродной ДНК она либо уничтожается по пока неизвестному механизму, либо метилируется при участии BrxX. Подробнее про известные аспекты функционирования системы BREX можно прочитать в нашей статье [1].

Вирусы умеют «обманывать» не только нашу с вами иммунную систему, но и защитные механизмы бактерий и архей. Например, многие фаги имеют белки, известные под общим названием «анти-CRISPR», которые на разных этапах блокируют работу систем CRISPR/Cas (подробнее про эти белки читайте в нашей статье [2]). Систему рестрикции-модификации многие фаги тоже успешно «взломали». «Антирестрикционные» гены имеются у многих фагов и других мобильных элементов вроде плазмид. Более того, как показало недавнее исследование, они даже группируются вместе и образуют что-то вроде «защитных островков» в вирусных геномах, похожих на «островки защиты» в геномах клеток бактерий [3]. Например, у фага T7, поражающего бактерию Escherichia coli (кишечную палочку), имеется белок Ocr, молекулы которого по форме и распределению зарядов на поверхности похожи на несколько витков двойной спирали ДНК (кстати, белки, подобные Ocr и «подражающие» ДНК, есть и у многих других фагов) (рис. 1) [4], [5].

Благодаря особенностям своей структуры Ocr может связывать многие бактериальные белки, взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами, однако он наиболее приспособлен для взаимодействия с компонентами систем рестрикции-модификации, делая невозможной их работу (рис. 2). Недавно исследователи из лаборатории Константина Северинова в Сколтехе показали, что Ocr также защищает вирус и от действия BREX-системы [6]. Таким образом, Ocr выступает в роли своеобразного «швейцарского ножа», защищая фага T7 от самых разных неприятностей.

Какие фаги могут противостоять BREX?

Ученые заметили, что некоторые штаммы фага T7 из имеющихся в их лаборатории обладают полной устойчивостью к действию BREX-системы, а другие, напротив, целиком уничтожаются этой системой. Секвенирование геномов фагов обеих разновидностей показало, что у чувствительных к BREX фагов имеется делеция, приводящая к потере ряда не обязательных для выживания генов, а также слиянию в один ген генов 0.3 (который и кодирует белок Ocr) и 0.7. Такая делеция часто возникает спонтанно при культивировании фага Т7 в лаборатории. Чтобы убедиться, что причина уязвимости фага с делецией к системе BREX кроется в отсутствии нормального белка Ocr, ученые направленно создали мутантных фагов, лишенных гена 0.3. Оказалось, что такие мутанты действительно не способны убивать клетки E. coli, имеющие систему BREX (мы будем обозначать такие клетки BREX+), в то время как фаги дикого типа размножаются в клетках BREX+ так же эффективно, как и в клетках без BREX-системы (такие клетки мы будем обозначать BREX–). Вирус без гена 0.3 был не способен уничтожать культуры клеток BREX+, даже если уже в начале эксперимента инфицировал почти все клетки культуры. А вот фаги с белком Ocr оказались устойчивы не только к действию системы BREX, но и, как было ранее установлено, к действию системы рестрикции-модификации, эффекторным комплексом которой является эндонуклеаза EcoKI.

Но достаточно ли только белка Ocr, чтобы фаг мог успешно противостоять действию системы BREX? Для ответа на этот вопрос исследователи вставили ген 0.3 в плазмиду под индуцируемый промотор, так что его экспрессия запускалась только при добавлении в среду специфического вещества. Культуры BREX+, в которые ввели эту плазмиду, успешно заражались мутантным фагом, лишенным собственного Ocr, причем чем больше в среду добавляли индуктора синтеза Ocr, тем быстрее протекало размножение фага. То же самое наблюдалось и в случае клеток, защищенных EcoKI: синтеза Ocr с плазмиды было достаточно, чтобы мутантный фаг мог противостоять системе рестрикции-модификации и запускать литический цикл в клетках. Ocr полностью подавлял защитное действие BREX-системы, так как при его продукции фаги T5 и λ, неродственные фагу Т7 и обычно уязвимые для действия BREX, приобретали резистентность к защите. Примечательно, что другие белки, которые могут подавлять систему рестрикции-модификации EcoKI и, как и Ocr, своей структурой «подражают» ДНК, не блокировали систему BREX. Следовательно, одного только сходства с ДНК для подавления BREX-системы недостаточно.

Механизм подавления BREX белком Ocr

Так как же Ocr действует на систему BREX? Ученые показали, что этот белок непосредственно связывается с главным «действующим лицом» системы — метилтрансферазой BrxX. Сначала они продемонстрировали, что, используя Ocr как «наживку», из клеток BREX+ можно «вытащить» белок BrxX. Верно и обратное: за BrxX можно точно так же «вытянуть» Ocr, что подтверждает взаимодействие этих двух белков внутри клетки. Взаимодействие Ocr с BrxX было подтверждено и в случае инфекции клеток BREX+ фагом T7. К слову, за Ocr, сшитый со стрептавидиновыой меткой, можно «вытащить» и белковые субъединицы рестриктазы EcoKI, что означает взаимодействие Ocr напрямую не только с белками системы BREX, но и с компонентами системы рестрикции-модификации EcoKI. В недавнем исследовании, опубликованном в Nature Microbiology, показали, что Ocr настолько хорошо мимикрирует под ДНК, что белки EcoKI-системы осуществляют требуемые конформационные перестройки, будто бы не замечая «подмены» [7].

Поскольку BrxX необходим как для модификации ДНК бактерии, так и для защитного действия системы BREX, ученые проверили, как Ocr влияет на метилирование BREX-сайтов в бактериальных геномах. С помощью технологии секвенирования PacBio , позволяющей выявлять метилирование в геномной ДНК, ученые исследовали, как изменялось метилирование BREX-сайтов генома клеток в присутствии и в отсутствие Ocr, который экспрессировался с плазмиды. Выяснилось, что в присутствии Ocr полностью деметилируются сайты EcoKI в клетках и BREX–, и BREX+, а в клетках BREX+ деметилируются еще и 20% BREX-сайтов. При этом снижение метилирования BREX-сайтов под действием Ocr не сказалось на жизнеспособности бактериальных клеток.

О различных технологиях секвенирования нуклеиновых кислот читайте в нашей статье [8] спецпроекта «12 методов молекулярной биологии».

По предположению исследователей, метилтрансфераза BrxX необходима на активном этапе защиты, и ее взаимодействие с Ocr также инактивирует оба типа комплексов — и модифицирующий, и атакующий вирусную ДНК. Будем надеяться, что в ближайшем будущем механизм действия загадочной системы BREX будет в подробностях прояснен.

Первый автор исследования аспирант Сколтеха Артем Исаев комментирует результаты работы следующим образом:

«Область исследования бактериальных систем защиты стремительно развивается: когда я начинал работу с BREX-системой, это был уникальный новый механизм, однако уже сейчас описан целый ряд новых систем, которые, подобно BREX, способны модифицировать ДНК, но при этом кодируют набор белков, совсем не типичный для классических систем рестрикции-модификации. Тем важнее, что текущее открытие позволяет нам перебросить “мост в неизведанное”, и связать активности новой системы с уже хорошо изученным белком-ингибитором Ocr. Ряд работ показывает, каким образом Ocr приспособился взаимодействовать с системами рестрикции-модификации первого типа, и теперь мы можем предполагать, что активные комплексы BREX-системы обладают схожими свойствами, которые мы сможем исследовать in vitro. По-прежнему остается загадкой, каким образом Ocr, взаимодействуя с метилтрансферазой BrxX, не полностью блокирует ее модификационную функцию, но при этом полностью отключает опосредованную BREX-системой защиту от вирусной инфекции. Для решения этого вопроса нам потребуется провести структурные исследования комплексов BrxX с Ocr. Помимо Ocr, нам удалось обнаружить и другие ингибиторы BREX, и каждый из них сообщает что-то новое о принципах функционирования системы. Таким образом, мы надеемся, что нам удастся “взломать” код опосредованной BREX-защиты, исследуя то, каким образом это уже научились делать фаги».

Литература

1. Свой среди чужих, чужой среди своих: как система BREX защищает бактерию от фагов и самой себя;
2. Анти-CRISPR: ответ вирусов;
3. Rafael Pinilla-Redondo, Saadlee Shehreen, Nicole D. Marino, Robert D. Fagerlund, Chris M. Brown, et. al. Discovery of multiple anti-CRISPRs uncovers anti-defense gene clustering in mobile genetic elements — Cold Spring Harbor Laboratory;
4. M.D Walkinshaw, P Taylor, S.S Sturrock, C Atanasiu, T Berge, et. al.. (2002). Structure of Ocr from Bacteriophage T7, a Protein that Mimics B-Form DNA. Molecular Cell. 9, 187-194;
5. Chun-Han Ho, Hao-Ching Wang, Tzu-Ping Ko, Yuan-Chih Chang, Andrew H.-J. Wang. (2014). The T4 Phage DNA Mimic Protein Arn Inhibits the DNA Binding Activity of the Bacterial Histone-like Protein H-NS. J. Biol. Chem.. 289, 27046-27054;
6. Artem Isaev, Alena Drobiazko, Nicolas Sierro, Julia Gordeeva, Ido Yosef, et. al.. (2020). Phage T7 DNA mimic protein Ocr is a potent inhibitor of BREX defence. Nucleic Acids Research. 48, 5397-5406;
7. Yina Gao, Duanfang Cao, Jingpeng Zhu, Han Feng, Xiu Luo, et. al.. (2020). Structural insights into assembly, operation and inhibition of a type I restriction–modification system. Nat Microbiol;
8. 12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот.