Ферменты — катализаторы белковой природы — способны ускорять протекание биохимических реакций в миллионы раз, и даже осуществлять катализ термодинамически невыгодных превращений за счёт сопряжения «целевой» реакции и гидролиза макроэргических связей, источником которых является преимущественно АТФ — универсальная «энергетическая валюта» клетки. Люди давно научились использовать многие ферменты в своих целях — от научных исследований до биотехнологии и промышленности. Сейчас главным образом используются природные ферменты, эффективность и стабильность которых часто улучшены за счёт подбора бактериальных (как правило, более стабильных) гомологов или введения направленных мутаций. Так, полимеразная цепная реакция — меч и орало молекулярной биологии — проводится с помощью термостабильного гомолога ДНК-полимеразы, полученного из бактерии Thermus aquaticus и обладающего высокой стабильностью, требующейся для этого многостадийного процесса.

Мощный набор молекулярно-биологических методов, накопленных к настоящему времени, скромно сдобренный пониманием механизмов химических реакций и принципов работы ферментов, уже позволяет создавать новые ферменты, более активные и/или стабильные, чем встречающиеся в живой природе, и даже проектировать белки с доселе не наблюдавшейся каталитической функцией [1]. Делается это, как правило, с использованием механизма, называемого «in vitro-эволюцией», суть которого заключается в создании большого числа (обычно 10⁶–10⁸, до 10¹²) вариантов гена, кодирующего исходный фермент, обладающий хотя бы следовой активностью требуемого рода, и сканировании получаемого после трансляции «ферментного супа» на предмет выявления белков, по случайности обладающих улучшенными качествами. Многократное повторение этого процесса позволяет создать новые ферменты, характеристики которых намного превосходят «стартовую точку», — хотя и «не дотягивающие» по эффективности до уровня природных белков-катализаторов [1].

Однако прогресс не стоит на месте: американские учёные разработали методику получения совершенно «новых» ферментов, катализирующих реакции, для которых отсутствуют белки-катализаторы в живых организмах [2], [3]! Эта работа является плодом совместного труда групп исследователей из Университета Калифорнии под руководством Кендалла Хоука (Kendall Houk) и Университета Вашингтона под руководством Дэвида Бэйкера (David Baker).

«Дизайн новых ферментов для реакций, не катализируемых в природе, вполне осуществим, — говорит Хоук. — Целью нашей работы является разработка компьютерных подходов для конструкции каталитических сайтов в белках, осуществляющих требуемые реакции».

Реакция, создание белка-катализатора для которой было задумано исследователями [2], носит название элиминации Кемпа, и заключается в отщеплении атома водорода от неионизуемого углеродного атома (рис. 1). Реакция предположительно одностадийна и протекает с образованием одного промежуточного состояния, в котором основание — положительно заряженный аминокислотный остаток — отщепляет протон, а другая группа — донор водородной связи — стабилизирует частичный отрицательный заряд на атоме бензоксазольного кислорода (превращающегося в результате расщепления конденсированного ароматического кольца в фенольный кислород). Основываясь на этом механизме, учёные предложили два варианта строения «идеального» каталитического центра — включающего один карбоксильный остаток (аспарагиновая или глутаминовая кислоты) или пару из остатка гистидина и того же карбоксильного остатка в качестве основания, катализирующего депротонирование.

Ключевым моментом предложенной методики является поиск белкового «каркаса», способного ориентировать каталитические аминокислотные остатки в пространстве наилучшим для протекания реакции образом. (Оптимальное положение каталитических групп было получено в квантово-механических расчетах переходного состояния субстрата и ключевых остатков сайта связывания.) Подбор нужного «каркаса» осуществлялся среди известных структурных мотивов в белках с помощью программы RosettaMatch — варианта программы Rosetta, разрабатываемой в лаборатории Бэйкера и уже снискавшей славу на ниве предсказания структуры небольших глобулярных белков [4]. Число комбинаций, перебираемых программой, выглядит совершенно астрономическим — ~10¹⁸ — однако в публикации уверяют, что подавляющая часть из них отсеивается с крайне низкими затратами компьютерного времени, а оставшиеся эффективно ранжируются по предсказанной энергии связывания переходного состояния, что позволяет сконцентрироваться на очень небольшом числе искусственных ферментов (порядка нескольких десятков). Хотя без распределённых вычислительных сетей тут не обошлось — на благо учёных постарались также пользователи программы Rosetta@Home, предоставляющие доступ к ресурсам своих компьютеров Дэвиду Бэйкеру и его коллегам.

Список типов укладки, способных поддержать в пространстве проектируемый активный сайт (например, основанный на паре His-Asp для реакции Кемпа), очень широк: тут оказываются и α/β-«бочонки», и β-«пропеллеры», и Россмановский мотив, и даже некоторые мембранные белки. Среди уже оптимизированных низкоэнергетических вариантов фермента 71% составили белки с типом организации α/β-«бочонок» (TIM barrel), который часто встречается в природных ферментах. На этом варианте учёные и сосредоточили свои усилия.

Мутагенез каталитических остатков в «новорожденных» ферментах доказал, что именно они отвечают за ферментативную активность, как и было задумано изначально, а полученная кристаллографическая структура оказалась практически идентичной созданной на компьютере модели (рис. 2).

Исследователи не остановились на достигнутом: компьютерный дизайн белка-катализатора был дополнен направленной эволюцией полученного фермента in vitro. «Оптимизированные» ферменты содержали 4–8 аминокислотных замен, не затрагивающих ключевых остатков каталитического центра, а активность этих белков возросла более чем в 200 раз.

Как довольно часто бывает, когда учёные докладывают в научной периодике о своих успехах, которые они считают исключительными, результаты исследования опубликованы сразу в двух ведущих журналах — в Nature [2] (пример с реакцией Кемпа) и Science [3], статья в котором посвящена разработке фермента для многостадийной (в отличие от реакции элиминации) ретроальдольной реакции. (Нужно, впрочем, отметить, что не только сами исследователи, но и строгие рецензенты посчитали достижения значительными, — что доказывается парой мартовских статей.) В публикации в Science рассказывается о разработке ферментов, также осуществляющих некатализируемый в природе процесс, обратный реакции альдольной конденсации, являющейся важным этапом метаболизма углеводов. Всего было синтезировано 72 белка, для 32 из которых обнаружили желаемую активность — и кристаллографические структуры двух лучших ферментов также совпали с предсказанным строением этих белков.

«Предыдущие попытки дизайна ферментов были не очень-то успешными, а некоторые из них оказались просто фальсификацией, пусть и не намеренной, — говорит Хоук. — И наш нынешний успех тем более удивителен, если учесть, что Природе требуются миллионы лет, чтобы сделать то, что у нас занимает считанные недели. Однако каталитическая активность искусственных ферментов пока довольно далека от той, которой обладают природные катализаторы». Де Чанси (DeChansie) — один из авторов статьи в Science — надеется на ещё большие успехи: «При условии, что нам удастся оптимизировать эту технологию, разрыв между природными белками-катализаторами и „дизайнерскими“ ферментами удастся существенно сократить» [5].

Работа обеих групп учёных — и команды Хоука, предлагающей каталитический механизм реакции и строение активных сайтов новых белков на основе квантово-химических расчётов, и группы Бэйкера, занимающейся компьютерным дизайном «целиковых» ферментов, — поддерживаются грантом Управления перспективных исследований Министерства обороны США (DARPA), что однозначно указывает на заинтересованность военных в разработках белков с заданной каталитической функцией. Остаётся надеяться, что новые поколения «дизайнерских» ферментов будут использоваться в биотехнологии и обороне — например, для нейтрализации химического и биологического оружия или последствий техногенных аварий, — но не для создания новейшего биохимического и вирусологического вооружения.

Литература

1. Ферменты haut couture;
2. Daniela Röthlisberger, Olga Khersonsky, Andrew M. Wollacott, Lin Jiang, Jason DeChancie, et. al.. (2008). Kemp elimination catalysts by computational enzyme design. Nature. 453, 190-195;
3. L. Jiang, E. A. Althoff, F. R. Clemente, L. Doyle, D. Rothlisberger, et. al.. (2008). De Novo Computational Design of Retro-Aldol Enzymes. Science. 319, 1387-1391;
4. Новые успехи в предсказании пространственной структуры белков;
5. „Designer enzymes“ created by chemists have defense and medical uses. (2008). ScienceDaily.