Осамо Шимамура (Osamu Shimomura), первооткрыватель зелёного флуоресцентного белка, начал заниматься биолюминисценцией ещё в студенчестве — в 1955 году в Университете Нагойи, где его первой самостоятельной задачей стало определить, почему разлагающиеся моллюски рода Cypridina светятся в темноте. Шимамуре удалось успешно справиться с этой сложной задачей: он выделил ярко люминесцирующий белок. (В случае люминесценции свечение обусловлено химической реакцией окисления особого субстрата — люциферина; в отличие от флуоресценции, где причиной свечения является предварительное возбуждение светом определенной длины волны.)

Профессура, удивлённая успехами Шимамуры, даже вручила ему степень кандидата наук (PhD) заочно, несмотря на то, что он даже не был аспирантом. После публикации результатов, его пригласили работать в США, где он продолжил изучать светящиеся организмы, — на этот раз медуз Aequorea victoria. Предание гласит, что в течение всего лета 1961 года Шимамура и его научный руководитель собирали на морском берегу и исследовали медуз, и через их руки и аппарат, в котором они их «перерабатывали», проходило по 3000 организмов в день.

Первым светящимся белком, выделенным из медузы, стал экворин, люминесцирующий синим светом при окислительном присоединении молекулы целентеразина в присутствии ионов кальция (которые содержатся в морской воде). (Кстати, экворин-целентеразиновая система с тех пор считается одним из основных биохимических сенсоров Ca²⁺.) Однако самым интересным было то, что экворин давал синее свечение, а сами медузы светились зелёным! Дело, оказывается, было в том, что медуза содержала ещё один белок — флуоресцентный, «удостоившийся» почти полвека спустя «Нобелевки», — зелёный флуоресцентный белок (GFP).

Первым упоминанием о GFP можно считать статью Шимамуры, вышедшую в 1962 году [1]. В ней было описано, что под действием света раствор этого белкá приобретает слегка зеленоватый цвет, а ультрафиолет вызывает яркое свечение раствора. И — самое важное — для свечения белка необходим только возбуждающий поток света и кислород в обычных концентрациях, и больше ничего (никаких дополнительных кофакторов — в отличие от экворина). Обо всех этих открытиях можно почитать в замечательном «автобиографическом» обзоре Шимамуры [2].

Этот интересный феномен, правда, в те времена было затруднительно использовать — биотехнология тогда делала ещё только самые первые шаги. Настоящая революция началась после встречи Шимамуры с Мартином Шалфи (Martin Chalfie) на одном из семинаров в Университете Колумбии (Нью-Йорк). Последний работал с прозрачным червём-нематодой Caenorhabditis elegans, и предложил попробовать использовать GFP для «картирования» клеток развивающихся зародышей С. elegans, а также для отслеживания определённых белков внутри клетки. Этому способствовала и бурно развивавшаяся научно-техническая база — на дворе был уже конец 80-х. Результат потрясал — внутри живой клетки можно было проследить за перемещением отдельных видов белков в реальном времени, при чем без особых ухищрений — для этого нужен обычный микроскоп с ультрафиолетовой лампой и светофильтром, пропускающим нужную длину волны (рис. 2).

Кстати следует обратить внимание на красный цвет на рисунке 2! Оказалось, что с помощью направленного мутагенеза можно не только усилить свечение белка, но и поменять его цвет. Так появились варианты GFP, излучающие в желтой, синей и красной областях спектра. С гордостью надо сказать, что одной из ведущих лабораторий по разработке новых «красок» является лаборатория Сергея Лукьянова в московском Институте биоорганической химии.

Лукьянов и его коллеги открыли и описали массу флуоресцирующих и окрашенных белков в морских организмах, которые обычно сами не светятся, но часто флуоресцируют в ультрафиолете, — например в актиниях (Anemonia majano и Ricordia yuma) и кораллах [4]. Что интересно, этих животных учёные брали не из моря, из домашнего аквариума одного из коллег. Кстати «в затылок» русским исследователям дышала группа австралийских учёных, но публикация наших соотечественников, вышедшая в 1999 году [5], прочно закрепила их приоритет в области «цветных» флуоресцентных белков.

Однако третьим Нобелевским лауреатом стал не Лукьянов, а Роджер Тсин (Roger Tsien), объяснивший механизм возникновения флуоресценции в белкé, не содержащем кофакторов и не требующем присутствия ионов металла. Кроме того, он всё-таки первым открыл флуоресцентные белки отличного от зелёного цвета — голубого, синего и жёлтого. В его группе также произвели «переделку» тетрамерного красного белка, открытого Лукьяновым, — с тем, чтобы заставить его работать в качестве мономера и уменьшить молекулярную массу (это необходимо с технологической точки зрения для удобства применения в экспериментах).

Современные светящиеся метки уже далеко превзошли «способности» прадедушки-GFP. Например, на его основе созданы включающиеся-выключающиеся разными длинами света флуоресцентные метки (рис. 3). Для таких белков стало возможным с помощью пучка света включать и выключать свечение молекулы, экономя её «ресурс» (это важно, поскольку флуоресцентные белки «выгорают», и яркость GFP или его аналогов максимальна только в первые минуты, а дальше она постепенно затухает).

Создав разноцветные флуоресцентные белки, ученые получили ещё один неожиданный инструмент. Оказалось, что если модифицировать два белкá двумя разноцветными метками, то можно по изменению цвета излучения «видеть» их взаимодействие. Это может происходить, когда длина волны флуоресценции одного белка является возбуждающей для другого (рис. 4). Так, в норме, возбуждая флуоресценцию голубого белка, мы видим синее излучение. Однако при сближении меченного синим белка-хозяина с его партнером — например субстратом, который мы модифицировали меткой другого цвета, — мы будем видеть затухание синего излучения и возникновение желтого! Модифицировав такой парой два белка, мы теперь можем точно регистрировать их взаимодействие in vivo, внутри клетки. Этот способ лёг в основу интересного и точного метода, получившего название FRET (Фёрстеровский резонансный перенос энергии).

Закончить наш обзор хочется красиво. А что может быть красивее, чем прижизненная и абсолютно безвредная визуализация частей тела! На рисунке 5 (слева) в специально выведенную лысую породу мышей введен ген красного флуоресцентного белка. Когда всё тело светится — это красиво. Но намного больше пользы принесут "светлячки«-сигналы болезней (рис. 5 (справа)). Так, первые эксперименты с раковыми опухолями, экспрессирующими флуоресцентные маркеры, показали, что можно визуально пронаблюдать развитие болезни. Возможно, когда-нибудь мы сможем так диагностировать болезни и у себя — на самых ранних этапах, когда любой серьёзный недуг можно сравнительно легко предотвратить. И — кто знает — может быть, предупреждать нас будет все тот же GFP, или его «наследники».

Литература

1. Osamu Shimomura, Frank H. Johnson, Yo Saiga. (1962). Extraction, Purification and Properties of Aequorin, a Bioluminescent Protein from the Luminous Hydromedusan,Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol.. 59, 223-239;
2. O. SHIMOMURA. (2005). The discovery of aequorin and green fluorescent protein. J Microsc. 217, 3-15;
3. D. E. Nelson. (2004). Oscillations in NF- B Signaling Control the Dynamics of Gene Expression. Science. 306, 704-708;
4. Лабас Ю.А., Гордеева А.В., Фрадков А.Ф. (2003). Флуоресцирующие и цветные белки. «Природа». 3;
5. Mikhail V. Matz, Arkady F. Fradkov, Yulii A. Labas, Aleksandr P. Savitsky, Andrey G. Zaraisky, et. al.. (1999). Erratum: Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17, 969-973;
6. Konstantin A. Lukyanov, Dmitry M. Chudakov, Sergey Lukyanov, Vladislav V. Verkhusha. (2005). Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 885-890;
7. Jean Livet, Tamily A. Weissman, Hyuno Kang, Ryan W. Draft, Ju Lu, et. al.. (2007). Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62;
8. Сычёв В. (2008). Зелёный белок отмечен Нобелевской премией по химии. Strf.ru;
9. Пресс-релиз Нобелевского комитета. (2008). The Nobel Prize.