За последние годы технология редактирования геномов, разработанная на базе бактериальных систем CRISPR/Cas9, обеспечивающих защиту от вирусов, вызвала настоящую революцию в биологии . Эта технология оказалась гораздо дешевле и проще, чем уже применяемые методы редактирования геномов, например, основанные на работе белков TALEN . Десятки, если не сотни, научных статей посвящены использованию CRISPR/Cas9 для редактирования геномов различных организмов, среди которых и человек.

«Биомолекула» не раз писала о CRISPR: об открытии и приручении этой системы в статье «CRISPR-эпопея и ее герои» [1], а о деталях ее работы в материале «Просто о сложном: CRISPR/ Cas» [2].

О технологии TALEN и других подобных рассказано в статье спецпроекта «12 биологических методов в картинках» — «Генная инженерия. Часть II: инструменты и техники» [3].

Собственно говоря, в генной инженерии применяют часть системы CRISPR/Cas9, а именно нуклеазу Cas9 с направляющей РНК (РНК-гидом, guide RNA, gRNA), необходимой для поиска места редактирования в клеточной ДНК. Метод могут применять как ex vivo — на отдельных клетках с их последующей трансплантацией в организм-реципиент, — так и in vivo — например, путем доставки РНК компонентов системы в клетки организма посредством вирусных векторов или наночастиц. Применение технологии Cas9/gRNA позволило достичь значительных успехов в лечении серповидноклеточной анемии. Исследуют возможность ее использования для терапии мышечных дистрофий и пигментного ретинита [4].

Однако исследователи столкнулись и с рядом проблем. Оказалось, что эта система допускает ошибки и способна внести изменение в неправильное место генома. А недавно открылся еще один факт, который может сильно ограничить применение Cas9/gRNA: выяснили, что иммунная система распознает ключевой белок Cas9 как опасный и стремится разрушить его!

Еще раньше было известно, что при использовании вирусного вектора для доставки редактирующей системы в клетки он сам может вызвать иммунный ответ. Но оказалось, что, даже достигнув клеток и начав синтезироваться, Cas9/gRNA остается незащищенной от иммунитета. Иммунная система неустанно следит за тем, какие белки производят клетки организма. Для этого фрагменты всех клеточных белков выставляются для проверки на поверхность клеток в составе главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC). Обнаружив на MHC фрагменты подозрительных или потенциально опасных белков, иммунные Т-лимфоциты уничтожают клетку, производящую эти белки. И белок Cas9 оказался среди таких «неблагонадёжных» [4]. Почему же иммунная система так реагирует на него и означает ли это, что колоссальный потенциал Cas9/gRNA переоценен?

В генной инженерии широко применяют два фермента Cas9: бактерий Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes. Группа исследователей из Стэнфордского университета (Калифорния) изучила образцы крови 22 младенцев и 12 здоровых взрослых и выяснила, что антитела к Cas9 первого типа имеются у 79% пациентов, а к Cas9 второго типа — у 65%. Кроме того, у 13 пациентов обнаружили Т-лимфоциты, специфичные к Cas9 S. aureus. На Cas9 другого типа Т-клеточного ответа не было, однако исследователи отмечают, что это, возможно, связано с низкой чувствительностью теста. Откуда же могли взяться эти антитела и специфические Т-лимфоциты? Дело в том, что Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes — комменсалы человека, и с их белками человеческий организм имеет дело чуть ли не с первых дней жизни, сразу же обзаводясь специфическим иммунитетом к ним [4], [5].

Таким образом, если в будущем Cas9/gRNA начнут использовать в терапевтических целях, белки Cas9 из S. aureus и S. pyogenes вряд ли будут эффективны. Но не всё так плохо! Исследователи из Стэнфорда предлагают несколько путей решения проблемы: подавлять иммунитет на время работы системы Cas9/gRNA, применять нуклеазы Cas9 из других микроорганизмов или использовать рекомбинантные белки. Разумеется, предварительно необходимо все системы проверять на иммуногенность. Вместе с тем остается еще и редактирование ex vivo: пока Cas9 с РНК-гидом работают, фрагмент нуклеазы выставляется на поверхность клеток, но после прекращении синтеза нуклеазы фрагмент ее оттуда убирается, и модифицированные клетки уже без опаски можно трансплантировать реципиенту — иммунной реакции на них не будет [4].

Ученые продолжают поиск подходящих белков для замещения широко используемых сейчас Cas9 и совершенствуют технологию. Так что едва ли система Cas9/gRNA останется неприменимой в медицине будущего.

Литература

1. CRISPR-эпопея и ее герои;
2. Просто о сложном: CRISPR/Cas;
3. 12 методов в картинках: генная инженерия. Часть II: инструменты и техники;
4. Charlesworth C.T., Deshpande P.S., Dever D.P., Dejene B., Gomez-Ospina N., Mantri S. et l. (2018). Identification of pre-existing adaptive immunity to Cas9 proteins in humans. bioRxiv;
5. Ledford H. (2018). How the immune system could stymie some CRISPR gene therapies. Nature News.