https://vk.cc/9ysowd
Подписаться

Как избежать случайных связей: инструкция от Cas12b

  • 423
  • 0,5
  • 1
  • 2
Добавить в избранное
Новость

Помимо Cas9, для редактирования генома можно использовать и другие белки Cas, например Cas12b

Технология редактирования генома, основанная на CRISPR/Cas, стремительно набирает популярность в качестве инструмента для решения самых разных биологических задач. Чаще всего в качестве редактора используют белок-эффектор Cas9, который с помощью направляющей (гидовой) РНК узнает ДНК-мишень, а затем разрезает ее. Впрочем, несмотря на свою популярность, Cas9 не лишен недостатков, в частности, он нередко разрушает не те мишени, которые были запрограммированы в гидовой РНК. Возможная альтернатива Cas9 — белки Cas12, в частности Cas12b, которые несколько лет назад предсказал сотрудник, а тогда аспирант, Сколтеха Сергей Шмаков. Любопытно, что, несмотря на то что для распознавания мишени Cas12b нужно спаривание всего лишь пяти нуклеотидов гидовой РНК с мишенью, этот фермент довольно специфичен. Как же Cas12b это удается? В работе, опубликованной журналом RNA biology, аспирантка Ишита Джайн из Центра наук о жизни Сколтеха и ее соавторы решили разобраться с этим. Попробуем разобраться и мы.

Вот уже несколько лет технология CRISPR/Cas победно шествует по планете: оказалось, что этот на редкость простой — и идейно, и методологически — подход, не требующий огромных финансовых затрат, подходит для решения множества задач. Предпринимали даже амбициозные попытки редактировать с его помощью геном человека (точнее, абортированных человеческих эмбрионов). Помимо сложных этических аспектов самого факта редактирования генома человека, применению CRISPR/Cas в медицине препятствует побочная активность белков-редакторов Cas: в том или ином количестве клеток редактирование затрагивает нецелевые участки, что может иметь фатальные последствия при медицинском применении технологии. Многие ученые работают над усовершенствованием ключевого эффекторного белка Cas9, который наиболее часто используют при редактировании геномов. Но на Cas9 свет клином не сошелся, и вместо этого белка можно применять другие, неродственные белки Cas. Например, в некоторых исследованиях вместо Cas9 использовали белок Cas12. Группа ученых из Сколтеха решила разобраться в молекулярных особенностях его работы [4].

Когда были получены пространственные структуры белка Cas12b (одного из видов Cas12), оказалось, что для разрушения мишени достаточно точного соответствия (комплементарности) лишь пяти нуклеотидов гидовой РНК с мишенью (протоспейсером). В этом отношении Cas12b — абсолютный рекордсмен: все прочие белки Cas требуют гораздо более протяженные комплементарные участки. Очевидно, что чем короче участок мишени, точно комплементарный направляющей РНК (так называемый seed-участок), тем больше вероятность того, что Cas12b распознáет не ту мишень, которая планировалась. Тем не менее специфичность Cas12b к «правильным» мишеням высока. Как же она достигается?

Для определения позиций нуклеотидов в протоспейсере, которые необходимы для его разрушения Cas12b, была создана библиотека плазмид, содержащих слегка различающиеся протоспейсеры. Важно, что последовательность PAM, необходимая для распознавания Cas12b, у всех протоспейсеров была одна и та же — соответствующая Cas12b (к тому времени она уже была известна). Понятно, что чем лучше протоспейсер соответствует CRISPR/Cas12b, тем эффективнее он будет разрушаться и тем меньше будет в клетках численность плазмид, которые его содержат, — они будут просто-напросто разрушены Cas12b. Количество каждого протоспейсера было определено по числу соответствующих ему прочтений, полученных секвенированием ДНК плазмид. Оказалось, что наибольшее значение для взаимодействия с РНК-гидом имеют позиции 1–3 и 5 в протоспейсере.

Далее исследователи решили изучить особенности комплекса Cas12b с ДНК-мишенью. Они собрали в пробирке комплекс из очищенного Cas12b бактерии Bacillus thermoamilovorans и направляющей РНК, после чего добавили к нему фрагмент ДНК, полностью комплементарный направляющей РНК. Чтобы ДНК не была разрезана, эксперимент проводили в отсутствие ионов магния. Эксперимент показал, что для распознавания мишени белком Cas12b чрезвычайно важен остаток гуанина в позиции 15 протоспейсера. При его замене на тимин комплекс РНК и Cas12b полностью перестает распознавать и разрезать мишень. Кроме того, Cas12b, вероятно, специфично взаимодействует с AT-богатым участком, расположенным вне протоспейсера, и это взаимодействие необходимо для реакции разрезания мишени. Любопытно, что для Cas12b другой бактерии, Alicyclobacillus acidoterrestis, у которой длина seed-участка составляет целых 18 нуклеотидов, 15-я позиция мишени также имеет критическое значение. Вообще, Cas12b этих двух бактерий эволюционно очень близки, и чем вызвана столь значительная разница в длине seed-участка, не понятно. Таким образом, несмотря на очень короткий seed-участок, Cas12b — довольно специфичный фермент, и его специфичность, вероятно, обеспечивается двумя путями: посредством 15 позиции мишени и дополнительных участков вне протоспейсера, с которыми Cas12b также специфично взаимодействует.

Как отмечает первый автор публикации, Ишита Джайн, несмотря на то что напрямую эффективность Cas9 и Cas12b не сравнивали, можно с уверенностью говорить о том, что Cas12b — вполне рабочая альтернатива Cas9, которая, несомненно, найдет широкое применение в редактировании геномов.

Литература

  1. CRISPR-системы: иммунизация прокариот;
  2. Просто о сложном: CRISPR/Cas;
  3. CRISPR-эпопея и ее герои;
  4. Ishita Jain, Leonid Minakhin, Vladimir Mekler, Vasily Sitnik, Natalia Rubanova, et. al.. (2018). Defining the seed sequence of the Cas12b CRISPR-Cas effector complex. RNA Biology. 1-10;
  5. Wen Y. Wu, Joyce H. G. Lebbink, Roland Kanaar, Niels Geijsen, John van der Oost. (2018). Genome editing by natural and engineered CRISPR-associated nucleases. Nat Chem Biol. 14, 642-651.

Комментарии