«Био/мол/текст»-2016

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «био/мол/текст»-2016.

---

Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

---

Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма «Атлас».

Восставший из консервов

В первые десятилетия ХХ века явление радиоактивности было очень модным: например, успешно продавалась косметика и зубная паста с радием — пока не стало понятно, что излучение от радиоактивных элементов вредит живому. Самым печально известным примером стали ядерные взрывы в Хиросиме и Нагасаки: помимо поражающего эффекта самогό взрыва, люди, флора и фауна подверглись губительному действию ионизирующего излучения. Во-первых, высокие дозы поглощенной радиации приводили к развитию лучевой болезни, во-вторых, среди населения этих регионов Японии впоследствии чаще выявлялись случаи заболевания лейкемией [1].

Тем не менее смертоносному влиянию ионизирующего излучения на живые организмы попытались найти применение. В 50-е годы ХХ века в США проводили эксперименты по стерилизации мясных консервов с помощью радиации. Для этого их подвергали сильному облучению, а затем смотрели, испортится ли со временем мясо. Ожидалось, что все грибы и бактерии в консервах погибнут, и продукт останется нетронутым. Каково же было удивление исследователей, когда мясо испортилось! Присмотревшись, ученые обнаружили на нём ярко-розовые бактериальные колонии. Оказалось, что образуют эти колонии грамположительные бактерии шарообразной формы, которые поначалу были названы Micrococcus radiodurans [2]. Впоследствии ученые решили выделить отдельный род Deinococcus, в который поместили эту бактерию и другие близкие виды. При более детальном изучении выяснилось, что D. radiodurans способен выдержать дозу 10 000 Гр, что делает его в 30 раз устойчивее к радиации, чем модельный объект молекулярной биологии E. coli, и в 1000 раз устойчивее человеческих клеток [3]. Естественно, сразу же возник вопрос, какие уникальные особенности этой бактерии позволяют ей выживать в таких экстремальных условиях.

Самая главная молекула

Во второй половине ХХ века биологи установили структуру двойной спирали ДНК и постулировали центральную догму молекулярной биологии [4]. Не осталось никаких сомнений в огромной важности ДНК для наших клеток, а в начале 80-х годов известный советский, а ныне американский биофизик М.Д. Франк-Каменецкий даже назвал свою замечательную научно-популярную книгу о ДНК «Самая главная молекула». Кроме того, оказалось, что ионизирующее излучение повреждает ДНК: буквально разрывает ее. Получилась логичная схема: радиация разрушает ДНК, а без «инструкций», хранящихся в «самой главной молекуле», клетка не может функционировать и погибает. Следовательно, для развития радиоустойчивости необходимо прежде всего защитить свою ДНК. Тут же обнаружилось, что клеточная стенка D. radiodurans очень толстая, а геном плотно упакован в странную структуру тороидальной формы (рис. 1) [5]. Как эти приспособления могли бы помочь клеткам переносить высокие дозы облучения, показать так никому и не удалось. И действительно, в опыте по прямому подсчету количества разрывов ДНК после облучения оказалось, что D. radiodurans защищает свою ДНК от радиации нисколько не лучше, чем E. coli [6].

Ну хорошо, если нельзя защитить свою ДНК от повреждений, то, наверное, можно научиться быстро и эффективно их устранять? Исправлением повреждений в ДНК занимаются специальные системы репарации. Прежде чем понять, как они работают, разберемся, какие типы разрывов возникают в ДНК под действием радиации. Всё просто: ДНК состоит из двух нитей, каждая из которых может порваться под действием ионизирующего излучения. Если повреждается только одна — такой разрыв называют однонитевым. Его починить проще простого: в клетках и так есть фермент ДНК-лигаза (он необходим любой клетке для репликации ДНК), который зашивает однонитевые разрывы.

Если же две цепи ДНК порвались друг напротив друга — это двунитевой разрыв. Его зашить сложнее. У нас, например, для этого существует специальная система «негомологичного соединения концов», работа которой заключается в сшивании между собой любых концов двойных спиралей ДНК. Нам-то хорошо: возник иногда один двунитевой разрыв в ДНК (такое периодически случается, не стоит беспокоиться), и эта система его быстро починила, потому что в такой ситуации понятно, что с чем сшивать. А при облучении в ДНК возникают десятки и даже сотни двунитевых разрывов. Очевидно, что вероятность случайным образом правильно собрать геном по кусочкам в такой ситуации крайне низка. Вот D. radiodurans и не использует этот механизм.

К счастью, есть другой, более точный способ репарации двунитевых разрывов. Он основан на гомологичной рекомбинации — сложном молекулярно-генетическом процессе, суть которого сводится к обмену нуклеотидными последовательностями между двумя гомологичными молекулами (например, хромосомами). Другими словами, если одна хромосома повреждена, а другая нет, то неповрежденную можно использовать как образец при ремонте (рис. 2). Тут впору задуматься, откуда же у D. radiodurans найдется гомологичная хромосома, ведь всем известно, что бактерии являются гаплоидными организмами. Оказалось, что и у них иногда бывает несколько копий генома. Клетки E. coli в условиях избытка питательных веществ обычно содержат от двух до четырех копий хромосомы из-за того, что ДНК постоянно удваивается, несколько опережая деление клеток. А в клетках D. radiodurans может быть сразу 10 копий генома [7]! Это открывает поистине широкие возможности для репарации путем гомологичной рекомбинации (рис. 3) [8]. Однако такой сложный процесс требует времени. А за это время ДНК может окончательно деградировать под действием своих же ферментов нуклеаз, которые целую ДНК не трогают, но фрагментированную тут же расщепляют до отдельных нуклеотидов. Чтобы этого не допустить, у D. radiodurans есть уникальные белки — защитники ДНК: DdrA, DdrB и DRA0282 [6]. Эти белки связываются с концевыми и однонитевыми участками ДНК и не подпускают к ним нуклеазы.

Таким образом, D. radiodurans действительно неплохо заботится о своей ДНК. В случае повреждения она сначала защищается специальными белками, а потом восстанавливается с помощью крайне эффективной гомологичной рекомбинации. Так и получается, что для E. coli уже десяток двунитевых разрывов ДНК несовместим с жизнью, а D. radiodurans способен собрать геном заново из сотен фрагментов, ничего при этом не перепутав. Казалось, что ответ на вопрос, как пережить облучение, получен: если ДНК сохранилась — клетка выжила. Получалось, что всё отличие D. radiodurans от той же E. coli состоит в многокопийности генома да наличии парочки уникальных белков . Но всё оказалось далеко не так просто...

Изучение транскрипции, т.е. процедуры переписывания информации из ДНК в РНК для синтеза белков, у D. radiodurans и других бактерий — тоже очень важная задача. Как исследуют РНК-полимеразу, транскрипцию и ее регуляцию в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ИМГ РАН, рассказывает статья «РНК-полимераза, горизонтальный перенос генов и связь поколений в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ИМГ РАН» [9]. — Ред.

ДНК, РНК... Главное — белки!

Ученые, исследовавшие радиоустойчивость D. radiodurans, настолько увлеклись изучением воздействия ионизирующего излучения на ДНК, что совершенно забыли о других молекулах до тех пор, пока не был проведен опыт по получению радиоустойчивых штаммов E. coli. Для этого клетки выращивали в условиях повышающегося радиационного фона, и среди E. coli происходил отбор наиболее устойчивых. Анализ получившихся бактерий показал, что у них появились механизмы защиты очень важных молекул. Но вовсе не ДНК, а белков [10]. В этот момент биологи вспомнили, что одним из эффектов ионизирующего излучения является образование активных форм кислорода (АФК) из молекул воды [11]. А АФК повреждают не только ДНК, но и белки, от работы которых зависит эффективность репарации ДНК. Понимание значения защиты белков сменило парадигму в исследованиях природы радиоустойчивости.

Тут же вспомнили, что у D. radiodurans повышена активность каталазы и супероксиддисмутазы — основных ферментов, нейтрализующих АФК [12]. Кроме того, было зарегистрировано повышение концентрации ионов марганца (Mn²⁺) в клетках D. radiodurans после облучения. К настоящему моменту ученые установили, как эти ионы помогают в борьбе с АФК:

• замещают ионы железа (Fe²⁺) в активных центрах ферментов, а Fe²⁺опасны тем, что реагируют с перекисью водорода с образованием гидроксил-радикалов, разрушающих белки;
• участвуют в регуляции активности многих белков: активируют супероксиддисмутазу, изменяют свойства ДНК- и РНК-полимераз, а также белков — регуляторов экспрессии генов;
• и самое интересное — комплексы Mn²⁺ с нуклеотидами, фосфатами, аминокислотами и пептидами обладают антиоксидантной активностью. Получается, что ионы марганца участвуют не только в регуляции ответа на окислительный стресс, но и в непосредственной ликвидации АФК (рис. 4) [13].

Как и зачем?

После того, как ученые выяснили детали (впрочем, еще не все) механизмов радиоустойчивости D. radiodurans, некоторые из них задались вопросом, как в процессе эволюции эта особенность вообще могла появиться. Действительно, те дозы облучения, которые способен выдерживать D. radiodurans, в природе получить весьма проблематично. Возникла даже гипотеза о марсианском происхождении этой бактерии [14]. Уж там-то устойчивость к радиации точно пригодилась бы! Согласно этой теории, D. radiodurans должен был прилететь на Землю с метеоритом. Гипотеза не встретила одобрения в научном сообществе по одной простой причине: уж слишком эта бактерия похожа на земных обитателей. По всем микробиологическим, биохимическим и молекулярно-генетическим параметрам род Deinococcus относится к домену эубактерий, имеет своих родственников, из которых ближайшими являются хорошо известные молекулярным биологам бактерии рода Thermus (именно ДНК-полимеразу из Thermus aquaticus чаще всего используют в ПЦР ) [15].

Про ПЦР можно подробнее почитать на «биомолекуле»: «Важнейшие методы молекулярной биологии и генной инженерии» [16], «Поиск иголки в стоге сена за 10 минут — подсвети себе LAMPой» [17] и «12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция» [23].

Разрешить загадку возникновения радиоустойчивости помогло то, что D. radiodurans неплохо переносит и другие виды стресса: обработку некоторыми антибиотиками, обезвоживание, облучение ультрафиолетом. Оказывается, в основе такой экстремофильности лежит всё та же способность выдерживать сильный окислительный стресс. В настоящее время считается, что D. radiodurans в процессе эволюции приспособился к регулярному обезвоживанию [8]. Действительно, одним из типичных местообитаний бактерий рода Deinococcus являются пустыни, где способность переносить недостаток воды весьма полезна. Эта адаптация развивалась путем совершенствования механизмов устойчивости к окислительному стрессу. Ни в какой защите от радиации тогда и смысла не было! Но так уж получилось, что, научившись переносить обезвоживание, бактерия обрела способность к выживанию в самых разных экстремальных условиях.

Заключение

Итак, устойчивость к радиации D. radiodurans — это побочный эффект адаптации к обезвоживанию. Она достигается защитой белков от окислительного стресса, а также эффективной репарацией ДНК, основанной на многокопийности генома бактерии.

Фундаментальные исследования механизмов борьбы с последствиями облучения и окислительным стрессом могут помочь в предотвращении старения . Кроме того, можно пытаться защищать клетки пациентов, подвергаемых лучевой терапии против рака, используя те же подходы, что и D. radiodurans. Самих же бактерий можно использовать для утилизации отходов в местах с высоким радиационным фоном [6]. Cуществование таких амбициозных проектов подтверждает, что можно и нужно продолжать изучение удивительной бактерии D. radiodurans.

Как ни крути, но старение хотя бы отчасти является результатом накопления повреждений клеток. Подробнее читайте в спецпроекте «биомолекулы» о старении: «Старческие капризы природы: почему люди прекращают стареть, а мыши не успевают жить» [18].

Литература

1. Tomonaga M. (1962). Leukaemia in Nagasaki atomic bomb survivors from 1945 through 1959. Bull. World Health Organ. 26, 619–631;
2. Anderson A., Nordan H., Cain R., Parrish G., Duggan D. (1956). Studies on a radio-resistant micrococcus. I. Isolation, morphology, cultural characteristics and resistance to radiation. Food Technol. 10, 575–577;
3. Daly M.J., Ouyang L., Fuchs P., Minton K.W. (1994). In vivo damage and recA-dependent repair of plasmid and chromosomal DNA in the radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans. J. Bacteriol. 176, 3508–3517;
4. Уотсон Д. Двойная спираль. М.: АСТ, 2013 г. — 219 с.;
5. Englander J., Klein E., Brumfeld V., Ajay K., Doherty A.J., Minsky A., Sharma A.K. (2004). DNA toroids: framework for DNA repair in Deinococcus radiodurans and in germinating bacterial spores. J. Bacteriol. 186, 5973–5977;
6. Slade D. and Radman M. (2011). Oxidative stress resistance in Deinococcus radiodurans. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75, 133–191;
7. Driedger A. (1970). The DNA content of single cells of Micrococcus radiodurans. Can. J. Microbiol. 16, 1136–1137;
8. Krisko A. and Radman M. (2013). Biology of extreme radiation resistance: the way of Deinococcus radiodurans. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a012765;
9. РНК-полимераза, горизонтальный перенос генов и связь поколений в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ИМГ РАН;
10. Harris D.R., Pollock S.V., Wood E.A., Goiffon R.J., Klingele A.J., Cabot E.L., Battista J.R. (2009). Directed evolution of ionizing radiation resistance in Escherichia coli. J. Bacteriol. 191, 5240–5252;
11. Активный кислород: друг или враг, или О пользе и вреде антиоксидантов;
12. Tian B., Wu Y., Sheng D., Zheng Z., Gao G., Hua Y. (2004). Chemiluminescence assay for reactive oxygen species scavenging activities and inhibition on oxidative damage of DNA in Deinococcus radiodurans. Luminescence. 19, 78–84;
13. Culotta V.C. and Daly M.J. (2013). Manganese complexes: diverse metabolic routes to oxidative stress resistance in prokaryotes and yeast. Antioxid. Redox Signal. 19, 933–944;
14. Pavlov A.K., Kalinin V.L., Konstantinov A.N., Shelegedin V.N., Pavlov A.A. (2006). Was Earth ever infected by martian biota? Clues from radioresistant bacteria. Astrobiology. 6, 911–918;
15. Omelchenko M.V., Wolf Y.I., Gaidamakova E.K., Matrosova V.Y., Vasilenko A., Zhai M., Makarova K.S. (2005). Comparative genomics of Thermus thermophilus and Deinococcus radiodurans: divergent routes of adaptation to thermophily and radiation resistance. BMC Evol. Biol. 5, 57;
16. Важнейшие методы молекулярной биологии и генной инженерии;
17. Поиск иголки в стоге сена за 10 минут — подсвети себе LAMPой;
18. Старческие капризы природы: почему люди прекращают стареть, а мыши не успевают жить;
19. Extremophiles survive simulated conditions on Europa. (2011). MIT Technology review;
20. Dooling D. (1999). Meet Conan the bacterium. NASA Science;
21. Bauermeister A., Moeller R., Reitz G., Sommer S., Rettberg P. (2011). Effect of relative humidity on Deinococcus radiodurans’ resistance to prolonged desiccation, heat, ionizing, germicidal, and environmentally relevant UV radiation. Microb. Ecol. 61 (3), 715–722;
22. Huyghe P. (1998). Conan the Bacterium. The Sciences (New York Academy of Sciences). 38 (4), 16–19;
23. 12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция.